皮层中间神经元亚型选择性电穿孔

本实验的总体目标是通过子宫内电穿孔技术，靶向发育中鼠类大脑的中间神经元。首先需制备注射针，第二步是将胚胎从麻醉动物体内取出。

然后对大脑进行DNA注射和电穿孔。最后一步是让动物从手术中恢复。最终，子宫内电穿孔可用于选择性靶向中间神经元亚型。

与现有的非特异性子宫内电转染技术相比，这些方法的优势在于能够对皮层中间神经元的一个亚群进行细胞自主性分析。高水平的GFP表达使得单个中间神经元的可视化和分析成为可能。该方法有助于回答神经发育领域中的一些基本问题，例如调控成熟中间神经元整合的规律是什么。

开始此操作时，先用拉针仪拉制玻璃毛细管以制备显微注射针。接着，小心取下毛细管，收集其底部的针头用于显微注射。然后，将麻醉后的怀孕小鼠仰卧置于加热垫上。

用面罩覆盖其面部，以在手术期间持续提供异氟烷。随后在两只眼睛上涂抹眼用润滑剂。将加热垫设置为36摄氏度，以防止术后低体温。

通过夹捏后肢足部或尾巴，检查足部和尾部反射是否消失。接着，用70%乙醇清洁腹部皮肤。用镊子将皮肤向上提起。

然后，在第三和第四对乳腺之间的中点处，沿正中线做一个2厘米长的小纵切口。使用圆头镊子时需小心，避免损伤腹壁。轻柔地将胚胎链从体腔中拉出。

将链条放在湿巾上。首先暴露子宫的一半，然后继续进行胚胎的电穿孔，再转向另一半。

在此步骤中，通过将标准大提物纯化方案获得的沉淀溶解于蒸馏水中来制备DNA溶液。然后以1:20的比例向DNA溶液中加入快绿，以便在注射过程中进行观察。接下来，使用精细镊子剪去预拉制微移液管尖端，使从肩部起始处到尖端末端的长度保留为6毫米。

随后，用快速绿染料将一微升 DNA 溶液吸入微量移液器中用于注射。用圆形镊子固定胚胎头部。以 45 度角将移液器插入脑部，对准位于中线附近的侧脑室。

如果针头穿透了脑室，应缓慢回撤移液管。当溶液开始填充脑室时，脑室应变为绿色。此时停止移动移液管，并注入一微升 DNA。

然后轻轻抽出移液管。将 ECM 八 30 电转仪设置为 5 次 45 伏、50 毫秒的脉冲，脉冲间间隔为 950 毫秒。将 5 毫米桨状电极浸入 PBS 中，以确保电流有效传导。

然后将电极板置于胚胎头部周围，将带正电的电极板放在含有DNA溶液的脑室一侧。将正极电极板位置略低于负极电极板，以在神经节隆起区域形成向腹侧的电流，从而最大限度减少旁侧细胞中的异位表达。

现在通过踩下脚踏板一次来施加一个电脉冲，然后取下电极并将其擦拭干净。对每个胚胎重复上述步骤。在对所有胚胎完成电穿孔后。

向腹腔内注入 3 毫升 PBS，并将胚胎放回腹腔。接着，使用弯针和 5-0 丝线缝合腹壁，然后缝合皮肤。在伤口处涂抹利多卡因，并最初给予 120 毫克/千克的阿司匹林以镇痛。

将动物从麻醉管路中取出，置于铺有纸巾的加热垫上使其恢复意识。随后，将动物放回笼中。保持加热垫温度为37摄氏度，并监测其健康状况。

在本实验中，通过表达 CGE 来源亚型标记物来界定电穿孔的中间神经元。该图像显示，来源于 CGE 的中间神经元被转入了 DLX5/6-EGFP 质粒。此图像显示了在出生后第 8 天（P8）表达 VIP 的中间神经元。

EGFP 表达标记了单个神经元的完整树突树和轴突分支，此处为 P8 时表达 NPY 的中间神经元。NPY 表达标记了神经胶质样细胞。最后，此处为 P15 时表达 NPY 的中间神经元。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在20分钟内完成。通过结合使用特定质粒与基因修饰小鼠品系，可实现对目的基因表达的时间和空间特异性调控。在某些实验中，我们使用A-D-L-X-T-T-A质粒来诱导AU依赖性转基因的表达。

在这些实验中，我们通过给予多西环素来抑制转基因的表达。