双光子 体内 使用颅骨变薄制备法对小鼠皮层树突棘进行成像

本实验的总体目标是通过双光子显微镜对活体小鼠大脑皮层中荧光标记的突触结构进行经颅成像。在麻醉小鼠后，第一步是制备薄颅骨样本。接下来，使用定制的固定板对小鼠头部进行固定。

然后通过双光子显微镜对变薄的颅骨进行图像堆栈采集。最终，重新定位并成像先前已成像的区域，从而能够在不同条件下随时间追踪树突棘的动态变化。

手术准备时，使用氯胺酮和赛拉嗪麻醉小鼠，并通过脚趾夹捏测试以确认麻醉完全。然后将小鼠置于加热垫上，用剃刀剃除头部毛发。交替使用酒精棉片擦拭皮肤，以消毒剃毛区域并清除残留的毛发碎屑。

同时，轻轻地在两只眼睛上涂抹眼膏。接下来，沿头皮正中线做一个直线切口，并将皮肤向颅骨边缘两侧推开。然后去除附着在颅骨上的结缔组织，以开始进行颅骨变薄处理。

首先，根据目标成像区域相对于中线和背侧内侧膝状体（bgma）的位置确定其位置。然后用生理盐水湿润颅骨，以观察血管分布，避免在大血管经过的区域进行颅骨打磨，因为这些血管会阻碍光的穿透并导致图像结构模糊。选定直径为0.5至1毫米的区域后，使用高速微型钻头对颅骨的圆形区域进行打磨减薄。

移动钻头时应平行于颅骨表面，而不是将钻头抵住颅骨并向下按压，以防止因过热造成损伤。避免钻头与颅骨长时间接触，直至外层密质骨和中间松质骨层均被去除。随后，将显微外科刀片以约45度角持握，对钻孔变薄区域中心的内层密质骨进行减薄处理。

轻柔刮除颅骨，避免用力按压，直至获得一个直径为 200 至 300 微米、厚度约为 20 至 30 微米的均匀变薄区域。当颅骨充分变薄后，小心清除骨碎片。下一步是安装头固定板，该头固定板由剃须刀片制成，其锋利边缘已用胶带包裹。

首先，在头板中心开口的每一边缘处滴加少量氰基丙烯酸酯胶水，然后将头板对准颅骨变薄区域的中心位置，用力将其紧压在颅骨上。

现在，轻轻地将头骨两侧的皮肤拉向头板中心开孔的边缘。将头板固定在原位 1 至 2 分钟。然后等待另外 8 至 9 分钟，直至头板牢固地附着在头骨上。

10 分钟后，将头板放置在固定板的两个侧块上。接着，拧紧头板边缘上的螺丝，以将小鼠固定在固定板上。通过解剖显微镜观察小鼠头部，同时轻轻按压小鼠背部，确认头部已正确固定。

接下来，用生理盐水冲洗暴露的颅骨，以去除任何未聚合的胶水，从而重新定位先前成像的区域。在后续成像过程中，拍摄暴露颅骨薄化区域的血管图像，该图像指定为图1。然后将小鼠置于成像显微镜下，并在10倍空气物镜下定位薄化区域。

使用落射荧光将最薄的区域移至视野中心。现在在颅骨顶部滴加一滴生理盐水，然后切换至60倍物镜。选择一个能够沿树突清晰观察到单个树突棘的区域。

通过比较表层荧光图像与血管照片中的血管结构，在图一上识别并标记出对应的区域。接着，根据荧光染料的特性调节双光子激光器的激光波长。然后使用60倍物镜，沿Z轴以2 µm为步长采集图像序列，覆盖约200 µm × 200 µm的区域。

此区域被指定为图谱二，用于在后续成像过程中重新定位图像树突段。现在使用3倍数字放大在图谱二中采集九组图像序列。每组图像序列覆盖约70微米×70微米的区域，沿Z轴步进0.7微米。

成像完成后，轻柔地将头固定板从颅骨上分离。接着使用显微外科刀片去除颅骨上残留的胶水。然后用生理盐水反复冲洗颅骨和皮肤，并使用无菌外科缝线缝合头皮。

恢复期间，将动物置于单独笼子中的加热垫上，并皮下注射布托啡诺镇痛剂以缓解术后疼痛。完全恢复后，将动物放回原笼。若需在另一天重新成像树突，需先麻醉动物并暴露颅骨。与之前相同，通过安装头部固定板并将其连接至固定板来重复进行头部固定。

然后通过将血管模式与图一进行比对，树突分支模式与图二进行比对，定位先前成像的区域。如果在一周内进行重复成像，可使用显微外科刀片去除新生长的薄层骨组织。如果在超过一周后进行重复成像，则需先使用微型钻头，再使用显微外科刀片对颅骨进行减薄处理。

现在在双光子显微镜下调整位置和方向，以获取与先前采集的图像堆栈相匹配的图像堆栈。采集图像后，让小鼠恢复，并像之前一样将其放回笼中，使用一张标记为图一的薄颅骨区域周围血管模式的图像作为所有后续成像会话的参考。黑色方框表示获取双光子活体图像的区域。

这幅显示一个月大小鼠运动皮层中树突分支的图像被标记为图二。白色方框表示选定用于成像的树突片段。随着时间推移，对同一树突片段分别在第零天、第二天、第四天和第八天进行了双光子成像。

新形成的树突棘。即在上一次成像过程中未出现的树突棘，用箭头标示；在两次成像期间消失的树突棘，用箭头标示。一旦掌握，足突（Philip Podia）用星号标示。

如果操作得当，该技术可在一到两小时内完成。