双光子在体内树突棘中的鼠标皮质用稀疏的头颅成像准备
May 12th, 2014
活体动物的延时成像提供了有关完整大脑结构重组的宝贵信息。在这里，我们介绍了一种变薄的颅骨制备物，它允许通过双光子显微镜对活体小鼠皮层中荧光标记的突触结构进行经颅成像。
该程序的总体目标是允许经颅成像，即通过两个光子显微镜在活体小鼠皮层中荧光标记的突触结构。麻醉小鼠后的第一步是进行变薄的颅骨准备。接下来，使用定制的固定板固定鼠标的头部。
然后使用两个光子显微镜通过变薄的头骨获取图像堆栈。最终，重新定位和成像。先前成像的区域允许在各种条件下在不同时间段内追踪树突棘的动力学。
为了准备手术，用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉小鼠，并进行脚趾捏以确保完全麻醉。然后将鼠标放在加热垫上，用剃须刀片剃头。用交替的酒精棉片擦拭皮肤，对剃须区域进行消毒并去除任何残留的剪发。
此外，轻轻地将眼药膏涂抹在双眼上。接下来，沿着头皮中线做一个笔直的切口，然后将皮肤横向移向颅骨边缘。然后去除附着在颅骨上的结缔组织，开始制备变薄的颅骨。
首先，根据其与中线和 bgma 的相对位置确定所需的成像区域。然后用生理盐水润湿颅骨以观察脉管系统，以避免在大血管区域使颅骨变薄，因为它们会阻挡光线穿透并模糊图像结构。选择直径为 0.5 至 1 毫米的区域后，使用高速微型钻头将颅骨的圆形区域变薄。
将钻头平行于颅骨表面移动，而不是将其靠在颅骨上并向下压，以防止过热造成损坏。避免钻头和颅骨钻头之间长时间接触，直到外部致密骨层和中间海绵骨层都被去除。接下来，使用保持约 45 度的显微外科刀片在钻头变薄区域中心减薄内部致密的骨层。
刮擦颅骨，不要向下压迫颅骨，直到获得直径为 200 至 300 微米、厚度约为 20 至 30 微米的均匀变薄区域。一旦颅骨充分变薄，小心地清除骨碎屑。下一步是安装头板，该头板由剃须刀片制成，边缘锋利，用胶带覆盖。
首先在头板中心开口的每个边缘滴一小滴氰基丙烯酸酯胶。然后将头板居中在变薄的区域。将其紧紧地靠在颅骨上。
现在，轻轻地将皮肤从颅骨两侧拉到头板中心开口的边缘。将头板固定一到两分钟。然后再等待 8 到 9 分钟，直到头板很好地连接到颅骨上。
10 分钟后，将头板放在固定板的两个横向块上。接下来，拧紧头板边缘的螺钉，将鼠标固定在固定板上。通过解剖显微镜观察老鼠的头部，同时轻轻垫住老鼠的背部，以确保头部被正确固定。
接下来，用盐水 rinsey 暴露的颅骨以去除任何未聚合的胶水，以便重新定位先前成像的区域。在随后的成像过程中，拍摄暴露颅骨变薄区域的脉管系统照片，该照片被指定为地图一。然后将鼠标放在成像显微镜下，并在 10 x 空气物镜下找到变薄的区域。
使用 epi 荧光，将最薄的区域移动到视图的中心。现在在头骨顶部加入一滴盐水并切换到 60 倍物镜。选择一个区域，使单个树突棘沿着树突清晰可见。
通过比较 epi 荧光视图和脉管系统照片之间的脉管系统，识别并标记地图 1 上的相应区域。接下来，根据荧光四分值调整双光子激光波长。然后使用 60 x 物镜沿 Z 轴以两个千分尺的步长获取图像堆栈，覆盖大约 200 微米 x 200 微米的区域。
这被指定为映射二，用于在后续成像会话期间重新定位图像树突线段。现在，使用 3 倍数字变焦在地图 2 中获取 9 个图像堆栈。每个图像堆栈覆盖的面积约为 70 微米 x 70 微米，沿 Z 轴的步长为 0.7 微米。
成像后，轻轻地将头板从颅骨上分离。接下来，使用显微外科刀片去除颅骨上剩余的胶水。然后用生理盐水冲洗颅骨和皮肤数次，并用无菌手术缝合
线缝合头皮。在恢复过程中，将动物放在单独笼子的加热垫上，并皮下注射丁丙诺啡镇痛药以缓解术后疼痛。完全康复后，将动物放回家庭仪表 要在另一天重新成像树突，请麻醉动物并露出头骨。和以前一样，通过安装头板并将其连接到固定板来重复头部固定。
然后通过比较脉管系统模式来定位先前成像的区域，将脉管系统模式与图谱 1 和树突状分支模式进行比较以映射 2。如果在一周内进行重新成像，可以用显微外科刀片去除新生长的骨薄层。如果超过一周后进行重新成像，请先使用显微钻头，然后使用显微手术刀片使颅骨变薄。
现在调整两个光子显微镜下的位置和方向，以获得与先前拍摄的图像堆栈匹配的图像堆栈。获取图像后，让鼠标像以前一样恢复并将其放回笼子中，并且使用指定为地图一的薄颅骨区域周围的血管模式图像来参考所有后续成像会话。黑框表示采集两个光子体内图像的区域。
这张一个月大的小鼠运动皮层树突状分支的图像被指定为图二。白框显示选择用于成像的树突段。随着时间的推移，在第 0 天、第 2 天、第 4 天和第 8 天对相同的树突节段进行了两次光子成像。
新形成的棘。也就是说，上一个成像会话中不存在的书脊由箭头显示，在成像会话之间消除的书脊由箭头显示。Philip Podia 一旦掌握，就会由星星表示。
如果执行得当，这项技术可以在一到两个小时内完成。
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概述
本文介绍了一种使用双光子显微镜对活体小鼠皮层中荧光标记的突触结构进行经颅成像的方法。通过颅骨变薄的准备，可以详细观察到完整大脑结构随时间的重组。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 成像技术
- 突触动力学
背景
- 了解突触结构对神经科学研究至关重要。
- 传统的成像方法可能不允许体内观察。
- 双光子显微镜提供高分辨率的成像能力。
- 颅骨变薄的准备是这种成像的一种新方法。
研究目的
- 实现活体小鼠中突触结构的经颅成像。
- 观察树突棘随时间的动态变化。
- 促进对大脑结构重组的研究。
使用的方法
- 使小鼠麻醉。
- 进行颅骨变薄的准备。
- 用自定义固定板固定小鼠的头部。
- 使用双光子显微镜通过变薄的颅骨获取图像堆叠。
主要结果
- 成功成像荧光标记的突触结构。
- 能够随时间追踪树突棘的动态变化。
- 对活体小鼠皮层中的结构变化有了见解。
- 证明了颅骨变薄的准备方法的有效性。
结论
- 颅骨变薄的准备是神经科学研究的一种有价值的技术。
- 双光子显微镜允许进行详细的体内成像。
- 这种方法可以增强我们对突触动力学的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-resolution two-photon in vivo imaging of dendritic spines in the mouse cortex enables direct observation of synaptic structural dynamics over time, supporting mechanistic de-risking in neurobiology discovery. This approach provides predictive confidence for target validation and pathway interrogation in CNS drug discovery portfolios. The method's repeatability and minimal invasiveness facilitate longitudinal studies critical for translational continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of synaptic remodeling, informing target engagement and pathway relevance.
- Supports functional validation of synaptic plasticity mechanisms in disease-relevant neural circuits.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing repeated, quantitative assessment of dendritic spine dynamics.
Screening & Assay Development
- Provides a validated in vivo system for evaluating compound effects on synaptic structure.
- Enables reproducible, quantitative imaging outputs suitable for comparative analysis across conditions.
- Supports assay standardization by mapping and relocating identical dendritic segments over multiple sessions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by enabling imaging in various cortical regions and cell types under physiological and pathological states.
- Facilitates longitudinal biomarker studies by tracking synaptic changes over extended periods.
- Supports risk-adjusted advancement decisions through robust, repeatable in vivo measurements.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational research in CNS portfolios.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct observation of synaptic changes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging data for compound evaluation in live neural tissue.
- Analytics: Provides high-content image stacks and quantitative spine turnover metrics for statistical comparison.
- Translational Research: Enables continuity by allowing repeated imaging in the same animal across time points and conditions.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse CNS targets, cell types, and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in synaptic target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes in vivo imaging workflows and supports reproducibility across studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust longitudinal data collection.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in two-photon microscopy and small animal surgical techniques.
- Demands access to advanced imaging instrumentation and custom head immobilization hardware.
- Necessitates rigorous cross-session mapping and standardization for longitudinal studies.
- Adaptable to various cortical regions, layers, and cell types as supported by the protocol.
- Limited by the need for precise skull thinning and potential regrowth of bone over time.
