使用简化的原位杂交方案研究Xenopus早期器官发生过程

以下实验的总体目标是展示特定基因在完整胚胎中的表达位置。该目标通过第二步将RNA固定在胚胎内原位来实现。针对目标基因的反义RNA探针将与胚胎内的靶RNA进行杂交。

该探针包含一个表位，通常是地高辛，随后可对其进行检测。接着，将碱性磷酸酶偶联的抗体与RNA探针上的表位杂交，然后使用比色染色法。为了观察RNA在胚胎中的定位，根据显色反应结果并结合胚胎解剖学知识，可精确显示目的基因的表达位置。

与现有方案相比，我们研究所的方案主要优势在于速度更快、试剂用量更少，且未出现明显质量损失。该方法可解答胚胎学中的关键问题，例如组织如何被特化并形成特定模式。尽管该方法可用于研究作品的发育过程，也可广泛应用于其他多种小型胚胎，如斑马鱼和小鼠早期胚胎。

我们最初开始开发这些方法，是因为传统方法耗时较长，因此我们尝试省略Ed步骤，以提高实验流程的效率，同时不降低实验质量。胚胎固定需分阶段进行。首先，准备好将用于所有步骤的玻璃小瓶，包括最终储存胚胎的步骤，以便在实验全过程的各个阶段对胚胎进行观察和监测。

使用带有优质聚四氟乙烯（Teflon）密封盖的透明小瓶，并用永久性记号笔在小瓶上标注相应的实验信息。用透明胶带覆盖标签，以防止在实验过程中标签丢失。由于实验中使用醇类及其他有机溶剂，需按照方案文本所述配制MFA固定液。

将每支已标记的玻璃小瓶中加入三到四毫升 MFA 溶液。将100%甲醇溶液于-20摄氏度保存。制作一支切割过的玻璃移液管，用于将胚胎转移至含有 Memphis 溶液的玻璃小瓶中进行固定。

将胚胎连同尽量少的培养基液体一并加入。每个小瓶固定不超过20至30个胚胎。将胚胎置于Memphis溶液中，在室温下于摇床中孵育两小时。

在完成多聚甲醛固定后，将 Memphis 溶液替换为约四毫升的 -20 摄氏度 100% 甲醇，用于在组装探针合成反应前保存胚胎。让 DNA 水、NTP 混合液和聚合酶缓冲液升温至室温。该实验成功最关键的步骤之一是正确组装探针反应体系。

在室温下配制探针合成反应体系。按以下顺序将各组分加入一个1.5毫升微量离心管中：模板DNA、水（调整体积至反应总体积为20微升）、NTP混合液、RNA抑制剂、RNA聚合酶缓冲液和RNA聚合酶，然后在37摄氏度孵育转录反应2小时。

孵育时间略长于两小时不会产生不良影响，但若孵育仅一小时，则产量会有所降低，尽管仍足以制备出良好的探针。转录反应完成后，取一微升反应混合物用于1%琼脂糖TAE凝胶电泳检测，剩余反应混合物保留备用。

加入80 µL含1% SDS的TE缓冲液、10 µL 5 M醋酸铵和220 µL冷乙醇。剧烈涡旋混合，并将混合物置于冰上静置，直至获得RNA质量检测结果。在沉淀前取出的1 µL RNA中加入水和标准上样染料，随后将RNA上样至含有AUM溴化物的1%琼脂糖TAE凝胶中进行电泳。

使用紫外光透射仪观察琼脂糖凝胶上溴化乙锭标记的RNA，以检测探针的质量。应可见一条清晰的单一条带，上下无拖尾现象。确认RNA质量合格后，将先前置于冰上保存的剩余RNA在微量离心机中以最大速度离心10至15分钟，进行沉淀。

用拉细的玻璃移液管吸除上清液，让RNA短暂干燥。随后，将探针重悬于RNA杂交缓冲液中，置于15毫升带螺旋盖的聚苯乙烯管内，于-20 °C保存。开始此操作时，取出保存在-20 °C甲醇中的胚胎，使其恢复至室温。

整个操作均在玻璃小瓶中进行。若同一组中的不同胚胎需用不同的探针进行检测，在添加探针之前应将其保留在同一个小瓶中。为减少第一天准备探针添加步骤时的变异性和工作量，应按照本表所述通过甲醇系列进行胚胎再水化，并使用玻璃移液器小心地更换每种溶液，因为在该步骤中胚胎容易受损。

转移液体时，检查管盖内侧，确保胚胎未被卡在其中。每次更换溶液后，轻轻摇动胚胎，以确保它们没有粘附在管壁或彼此粘连。在使用RNA杂交缓冲液和探针前，需将胚胎置于摇床上，并将杂交缓冲液和探针预先加热至65摄氏度。

将胚胎在探针溶液中杂交过夜，次日在65摄氏度下轻轻摇动。移除探针溶液，并将其保存在已标记日期和使用次数的15毫升螺旋盖聚苯乙烯管中。将探针溶液储存在-20摄氏度。

探针移除后，按照此处所述的系列洗涤步骤对胚胎进行针对该探针的抗体染色前处理；根据需要，将连接有胚胎管的移液器直接转移至设定好相应温度的杂交炉中以调节温度。在胚胎于封闭液中孵育期间，配制适量体积的封闭液并加入抗-地高辛抗体，使抗体在加入胚胎前预先封闭。将胚胎在抗体溶液中于4°C、摇床上孵育过夜，次日继续操作。

移除抗体溶液，用含有马来酸和氯化钠的 mab 溶液洗涤。室温下振荡洗涤至少 12 次，每次 30 分钟。将最后一次洗涤液替换为碱性磷酸酶底物。

于室温下轻轻振荡孵育过夜，进行染色反应。按照本表中所述更换液体，终止染色反应，并对胚胎进行储存和成像前的处理。胚胎复水后，用MFA固定染料30分钟。

固定后，移除MFA，并用25%甲醇洗涤胚胎。如果需要去除内源性色素，移除25%甲醇并加入漂白液。密切观察漂白过程，因为该过程发生较快，且可根据不同需求调整漂白程度。

对于长期保存，在短期保存和后续成像前，将胚胎经漂白后通过甲醇梯度脱水至100%甲醇，然后将胚胎转移至PBS。未透明化的胚胎最适合在1%琼脂糖背景下观察和成像。制备琼脂糖溶液时，将琼脂糖加入水中并加热至沸腾，直至琼脂糖完全溶解。待琼脂糖冷却至50摄氏度后，倒入培养皿中，厚度约为两毫米。

当 aros 培养皿准备就绪后，将未清除背景的胚胎放入培养皿中，并继续进行成像。aros 可提供蓝灰色背景，与胚胎及染色反应的蓝色形成良好对比。它还有助于弥散干扰性的阴影和反射光，避免注意力从胚胎上分散，从而便于从不同角度（例如腹侧）对胚胎进行成像。

使用精细镊子在琼脂糖中切割出适合胚胎的切口。将胚胎放入这些通道中以进行定位。操作胚胎时需小心谨慎，因其容易受损。

使用光纤光源以浅角度照射胚胎，使胚胎表面产生阴影，从而增强图像的立体感，并有助于识别表面结构，因为漂白可能去除提供有用解剖标志的色素。对于漂白程度较高的胚胎，应利用阴影效果进行观察。透明化处理后的胚胎可用于观察位于胚胎内部较深区域的染色信号，例如脊索、肺或脑部区域。

在本实验方案中，采用不同程度的漂白以观察胚胎中的染色情况。如果染色较强，较轻的漂白处理可保留部分色素，有助于更准确地判断胚胎的发育阶段和定位。然而，如果染色区域本身色素含量较高（如肾脏区域），则更强的漂白处理可获得更佳的效果。

对 ARO 基部的操作有助于胚胎的定向。例如，通过在 aros 上切出一条细小的通道，可使侧卧的蝌蚪期胚胎稳定地以腹面朝上进行观察，从而获得高质量的图像。该胚胎被放置在一个微小的孔洞中，孔洞使其位置固定且腹面朝上，从而能够完整观察目的基因的表达模式。

在经PAX2染色但未透明化的不透明胚胎中，可观察到内部器官；而在透明化处理后的胚胎中，内部器官的观察效果更佳。在34期，视神经茎以及神经管均可见，但细节不够清晰。通过胚胎透明化处理，包括视神经茎在内的表达区域边界变得更加清晰。

透明程度可通过在此胚胎中能否看到两只眼睛来判断。然而，透明化胚胎常见的问题是部分染色会积聚在内部腔隙中。观看本视频后，您应能较好地掌握如何快速进行整体原位杂交实验，使用更少的试剂并获取高质量的图像。