Name: 了解早期器官使用简体原位杂交协议爪 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 50 s
Description: 学习简化版整体原位杂交技术，用于在非洲爪蟾胚胎中定位基因表达。该方法通过RNA探针杂交和显色反应，帮助研究人员快速可视化早期发育中的基因功能。

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作者感谢加拿大卫生研究院（CIHR）对 Steve Deimling 提供的博士后资助，以及西安大略大学儿科系对 Steve Deimling、Rami Halabi 和 Stephanie Grover 的支持。本研究得到了加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）资助项目 R2654A11 及 NSERC 发现加速补充基金的支持。

1. 胚胎制备
<ol>
	<li>若胚胎培养过程中未常规进行脱胶处理，则在固定前使用2.5%半胱氨酸（pH 8.0）对胚胎进行脱胶 8虽然并非绝对必要，但在固定前使用精细镊子手动去除受精膜是有帮助的。
	<ol>
		<li>使用玻璃巴斯德移液管转移胚胎。由于移液管口径过窄，无法直接吸取胚胎，因此需使用钻石笔在适当位置将玻璃移液管切割至足够宽的口径，以便吸起胚胎。切割后，迅速将移液管尖端通过本生灯火焰，熔化切口边缘以去除锐利部分。 
		注意：尽管玻璃器皿经目视已冷却，但仍可能足够热而造成烫伤，需小心操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分阶段进行胚胎固定。首先，准备用于胚胎固定的玻璃小瓶，并在所有步骤（包括最终储存）中均使用这些小瓶。选择瓶身透明、瓶盖带有优质聚四氟乙烯（Teflon）密封垫的玻璃小瓶，以便在操作全过程监测胚胎状态。使用永久性记号笔在小瓶上标注相应的实验信息，再用透明胶带覆盖标签，因为即使使用永久性记号笔书写，在使用酒精及其他有机溶剂的过程中标签仍可能脱落。
	<ol>
		<li>使用 Mempfa 固定胚胎。每次配制 50–100 ml 的 8% 多聚甲醛储备液。使用所需量约 75% 的 H2O 并加热至 50–60 °C，此温度条件是使多聚甲醛溶解所必需的。 
		注意：该溶液与以往发表的方案版本中使用的 Memfa 略有不同，其采用多聚甲醛而非甲醛。</li>
		<li>加入2-3滴10N NaOH，或直至pH值约为7.5（使用pH试纸检测pH值）。由于甲醛溶液具有高毒性，因此应在通风橱中配制母液。待甲醛完全溶解后，将溶液经Whatman滤纸过滤至洁净容器中，并加入H2O至终体积。如有需要，可将多聚甲醛溶液在4 °C保存1-2周。</li>
		<li>组装 Mempfa 固定液的其余组分（表1）。确保多聚甲醛的终工作浓度为4%。固定液各组分作为储备液于4 °C保存。</li>
		<li>使用切割过的玻璃移液管，将胚胎加入已装有约3-4 ml Mempfa溶液的标记玻璃小瓶中以固定胚胎（表1）。每管避免固定超过20-30个胚胎。转移胚胎时尽量减少培养液的带入。在室温下用Mempfa溶液固定胚胎2小时，或在4 °C下过夜固定。</li>
		<li>对于晚期内胚层结构，执行以下操作 原位 在人工分离的肠道和内胚层衍生物上 9,10，这有利于探针的良好渗透，同时避免空腔染色。</li>
		<li>在 -20 °C 下保存 100% 甲醇溶液。经多聚甲醛固定后，将 Mempfa 溶液替换为约 4 ml 的 -20 °C 预冷的 100% 甲醇，用于胚胎的储存。</li>
		<li>加入甲醇后轻轻涡旋小瓶，以防止胚胎粘附在玻璃壁或其他胚胎上。同时确保小瓶密封严密，因为甲醇若封口不紧，会在冷冻过程中逐渐挥发。 
		注意：胚胎在甲醇中可保存至少一年，甚至更长时间，且在染色前不会出现明显退化。 原位 杂交质量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 探针制备
<ol>
	<li>使用1-2 µg模板DNA制备地高辛标记的探针。用适合该载体的限制性内切酶在目标基因5’端对应的质粒上进行酶切，以产生反义探针。 
	注意：质粒应含有适当的RNA聚合酶结合位点（例如 T7、T3 或 SP6</li>
	<li>将DNA、水、NTP混合液和聚合酶缓冲液置于室温下回温，再进行探针合成反应体系的配制。按所列顺序，将RNA合成反应的各组分加入一支1.5 ml微量离心管中 表格 2调整加入的水量，使探针合成反应总体积为20 µl。反应体系在室温下配制，因为当浓度较高且处于低温时，聚合酶缓冲液中的组分可能导致模板DNA沉淀。</li>
	<li>在37 °C下孵育转录反应2小时。 
	注意：孵育时间略长于两小时不会产生不良影响，但增产效果亦不明显。若孵育一小时，产量会有所降低，但仍足以制备出良好的探针。
	<ol>
		<li>在等待转录反应完成的同时，制备用于检测探针质量的琼脂糖凝胶。将1 µg琼脂糖溶于100 ml 1x TAE缓冲液中（见 表1通过将溶液加热至沸腾来溶解。当琼脂糖粉末完全溶解后，将溶液从热源上移开。</li>
		<li>将 2 µl 溴化乙锭贮存液（10 mg/ml）加入约 100 ml 已冷却至约 60 °C 的琼脂糖凝胶中，以便在紫外光（UV）下观察 RNA。 
		注意：该琼脂糖凝胶溶液可保存在60 °C培养箱中，以便后续制胶时无需反复熔化。由于溴化乙锭具有潜在毒性，操作时需小心。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在孵育2小时后，向转录反应体系中加入1 µl DNA酶I（无RNA酶级），于37 °C继续孵育10分钟，以消除模板DNA。</li>
	<li>从反应混合物中取出 1 µl 用于 1% 琼脂糖-TAE 凝胶检测，向剩余部分（20 µl）中加入 80 µl 含 1% SDS 的 TE 缓冲液（10 mM Tris pH 8.0，1 mM EDTA）和 10 µl 5M NH₄OAc4 乙酸和220 µl冷乙醇。剧烈涡旋混合，置于冰上静置，直至RNA质量检测结果明确。
	<ol>
		<li>将沉淀前取出的1 µl RNA在1%琼脂糖-TAE凝胶上电泳。为便于上样，向RNA中加入4–5 µl水和1 µl标准上样染料。使用紫外透射仪观察凝胶上的RNA，以检测探针的质量（见讨论部分）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将步骤2.5中置于冰上保存的剩余RNA进行沉淀：在微型离心机中以最大速度离心10至15分钟。用拉制的玻璃移液管吸除上清液，并短暂干燥。
	<ol>
		<li>用1 ml RNA杂交缓冲液重悬探针（表1) 加入离心管中。&#160; 涡旋混匀，短暂置于37 °C条件下加热，再涡旋混匀。&#160; 将探针溶液转移至一个15 ml螺口聚苯乙烯管中，并用RNA杂交缓冲液定容至7-10 ml。&#160; 注意：探针可进一步稀释（再稀释10倍仍可有效），通常可降低背景，但染色反应时间也会相应延长。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 原位 杂交
<ol>
	<li>将保存在 -20 °C 甲醇中的胚胎取出，使其升至室温。整个操作过程均在玻璃小瓶中进行。若同一组中的不同胚胎将使用不同探针进行检测，在添加探针前应将其保留在同一个小瓶中，以减少第一天的实验变异性和工作量。
	<ol>
		<li>通过甲醇梯度溶液复水胚胎，步骤如下所述 表3 （参见 表1 为准备探针的添加，按洗涤配方进行操作。每次更换液体后，轻轻摇动胚胎，确保它们没有粘附在管壁或彼此粘连，并将管子置于摇床上轻轻 rocking 胚胎。转移液体时，检查管盖内侧，确保没有胚胎被困在其中。</li>
		<li>一旦放入探针溶液中，按照所述方法将胚胎杂交过夜 表3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移除探针溶液。将使用过的探针保存于标记有日期和使用次数的15 ml螺口聚苯乙烯管中，于-20 °C保存。 
	注意：同一探针可在后续实验中重复使用多次 原位 杂交反应直至显色反应开始需要异常长的时间才能达到理想强度。
	<ol>
		<li>探针移除后，通过以下系列洗涤步骤对胚胎进行针对该探针的抗体染色前处理 表4. 根据需要调节温度（表4通过移动混匀器，将附有胚胎管的混匀器直接放入设定好适当温度的杂交炉中。</li>
		<li>补足适量体积的 MAB+HTSS+BR+anti-Dig 抗体（表4在胚胎孵育于MAB+HTSS+BR封闭液的同时，对抗体进行封闭处理，以确保在加入胚胎前已完成封闭。封闭液需在使用当天新鲜配制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移除抗体溶液，并在抗体孵育过夜后，按照表5所述开始洗涤步骤。为准备使用碱性磷酸酶底物进行染色并尽可能降低背景信号，需进行至少12次、每次30分钟的洗涤。可使用MAB缓冲液或TBT溶液（表1用于洗涤步骤。 
	注意：TBT 溶液是在 TTw 中添加了 2 mg/ml BSA 制成的。
	<ol>
		<li>用BM Purple碱性磷酸酶底物替换最后一次洗涤液。在室温或37 °C下进行显色反应。 
		注意：在 37 °C 下染色速度较快，但若过夜孵育，常会导致背景染色过强。染色反应通常需要过夜孵育，此时室温条件最为安全。</li>
		<li>如果需要进一步染色且BM紫色溶液开始呈现蓝色，则更换为新鲜的BM Purple染液，并将试管置于37 °C。若目标mRNA丰度较高，可将胚胎置于染色液中于4 °C过夜，随后转移至室温或37 °C，以便更有效地监测染色反应进程。</li>
		<li>密切监测新反应，因为不同靶标RNA达到最终结果所需时间差异较大。为保持一致性，当延长孵育时间后不再出现新的表达位点时，即终止染色反应（见3.4）。重要的是，如果 原位 杂交被用作分析不同处理组实验的一种检测方法时，处理组与对照组胚胎的显色反应时间应保持一致。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>终止染色反应，并按照下述步骤更换液体，以制备胚胎用于储存和图像采集 表6此阶段不要晃动胚胎，因为染料的去除可通过胚胎周围甲醇中出现的紫色着色来观察。 
	注意：胚胎常因染色液而呈现浅蓝色染色，冷甲醇至少可部分去除该染色，但不足以消除严重的背景染色或腔隙染色。冷甲醇指保存在 -20 °C 冰箱中的甲醇。
	<ol>
		<li>复水胚胎并用 Mempfa 固定染色表6）。固定后，移除Mempfa，并用25%甲醇洗涤胚胎。</li>
		<li>除去25%甲醇，若需去除内源性色素，则加入漂白液。处理漂白液时需小心，因其可引起灼伤。密切观察漂白过程，该过程发生较快，且可根据不同效果调整漂白程度（图2).</li>
		<li>通过甲醇梯度脱水，将胚胎脱水至100%甲醇，用于漂白后的长期保存；或转移至PBS中用于短期保存及后续成像（参见 表6).&#160;</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 胚胎成像
<ol>
	<li>胚胎完成染色后，对胚胎进行成像，以记录目的基因的表达位置信息，便于更广泛的受众查阅。使用1%琼脂糖作为背景来观察未透明化的胚胎。 
	注意：琼脂糖提供蓝色/灰色背景，与胚胎及染色反应的蓝色形成良好对比。同时有助于消散分散注意力的阴影和反光，使观察焦点集中于胚胎。
	<ol>
		<li>将琼脂糖加入水中，加热至沸腾，直至琼脂糖完全溶解，然后冷却至50°C后再倒入培养皿中。与TAE凝胶溶液类似，可将琼脂糖溶液储存于55°C培养箱中以供多次使用。将琼脂糖倒入培养皿，厚度约为2 mm。如有需要，可通过调整琼脂糖厚度来获得略有差异的背景色调。</li>
		<li>将储存于甲醇中的胚胎经甲醇梯度逐步复水至水相溶液（PBS或TTw）后，将其置于含有琼脂糖基底的培养皿中（见表6）。保持溶液清洁，必要时可通过简单过滤去除可能干扰图像背景清晰度的微小颗粒物。</li>
		<li>若需从不同角度（如腹侧）对胚胎成像，可用精细镊子在琼脂糖中切出细小沟槽，将胚胎置入其中以固定方向（图3）。操作胚胎时需格外小心，因其极易受损。 
		注意：大多数发育阶段的胚胎在置于溶液中时会呈现特征性姿态。例如，囊胚期胚胎通常动物极朝上；一旦胚胎开始伸长，则倾向于侧卧。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用光纤光源以浅角度照射胚胎，使胚胎表面产生阴影，从而增强图像的立体感，并有助于分辨表面结构。由于漂白可能消除提供重要解剖标志的色素，因此对于漂白程度较强的胚胎，应依赖阴影效果进行观察。</li>
	<li>对胚胎进行透明化处理，以便观察位于胚胎深层的染色信号，例如脊索、肺或脑区等部位的表达（图4）。为此，需将胚胎经甲醇梯度逐步转移至100%甲醇。
	<ol>
		<li>胚胎完全浸入甲醇后，将其转移至由一份苯甲醇与两份苯甲酸苄酯（BABB）组成的混合溶液中。胚胎最初会漂浮于液面，但随着甲醇与BABB混合，胚胎将逐渐沉入溶液中。所有涉及BABB的操作均应在玻璃小瓶或玻璃器皿中进行；BABB可溶解任何塑料或油漆材料。</li>
		<li>透明化完成后，使用来自胚胎下方的透射光进行观察。调节光源强度及入射角度，以优化图像对比度并呈现最佳颜色效果。</li>
		<li>观察透明化胚胎时，应将玻璃培养皿抬离底座。可通过两个其他培养皿的盖子将其垫高，使含有胚胎的区域被抬升。 
		注意：此方法的优势在于使底座脱离焦平面，从而消除显微镜底座上可能存在的瑕疵或污渍对图像造成的干扰。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 双倍 原位 杂交
<ol>
	<li>为了在同一胚胎中同时观察两种不同基因的表达模式，需合成两种探针，每种探针分别针对一种基因。其中一种探针使用 DIG-11-UTP 作为标记物，合成方法如上所述。将体外转录反应产物用 RNA 杂交缓冲液稀释，使其浓度达到单重杂交实验所用探针浓度的 3 倍。 原位 杂交。
	<ol>
		<li>使用与DIG标记探针相同的方案合成另一种感兴趣的探针，但需用荧光素-12-UTP替代DIG-11-UTP。将转录反应产物用RNA杂交缓冲液稀释，使其浓度比单重检测所用探针高3倍 原位 杂交。</li>
		<li>将两种浓缩探针按1:1比例混合。为获得最佳结果，建议对在单重检测中表达最强的基因使用荧光素标记的探针 原位 杂交实验方案</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用相同的 原位 单重杂交实验方案 原位 杂交步骤中，除在第一天结束时使用双探针（含有地高辛标记和荧光素标记探针的1.5倍浓缩混合物）代替单探针外，其余步骤相同 原位 杂交探针
	<ol>
		<li>在双重实验的第二天遵循单次杂交方案 原位 杂交实验步骤中，除使用抗荧光素-AP Fab片段以1:4,000稀释度替代抗DIG-AP Fab片段外，其余操作同单重杂交。随后按单重杂交方法充分洗去胚胎中多余抗体 原位 使用BM-Purple AP底物进行第一轮显色反应的方案与操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第一次显色反应后，用0.1 M甘氨酸（pH 2.0）灭活荧光素抗体，处理40分钟，随后在MAB缓冲液中洗涤5次，每次10分钟。将胚胎在MAB+HTSS+BR封闭液中封闭90分钟。按1:2,000稀释比例加入抗DIG抗体，溶于MAB+HTSS+BR中，4 °C孵育过夜。
	<ol>
		<li>次日，用 MAB 彻底清洗胚胎（共 12 次，每次 30 分钟），以去除多余的抗体。</li>
		<li>用 AP 缓冲液洗涤胚胎 10 分钟（表1）然后用 BCIP（AP 缓冲液中 0.5 mg/ml）染色。 
		注意： 原位 组合应产生深蓝紫色作为第一次显色反应，浅蓝色作为第二次显色反应（图5).</li>
		<li>通过移除AP缓冲液终止最终的显色反应，并用MAB洗涤三次。用Mempfa固定胚胎10分钟。在MAB或TBT中对胚胎进行5次快速洗涤。</li>
		<li>使用这种颜色组合时，染色后处理中不能再使用甲醇，因为它会消除BCIP单独显色的结果。染色和固定后的胚胎应保存在含有0.02%叠氮化钠的PBS中。双重染色时，着色强度可能较弱 原位如果存在问题，可将洗涤次数减少至4次，每次持续2小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Hurtado, R., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sensitivity+and+stability+in+two-color+in+situ+hybridization+by+means+of+a+novel+chromagenic+substrate+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination.</a> Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).</li>
</ol>

作者无任何竞争性财务利益需要披露。

使用的能力 原位 通过杂交技术来可视化特定基因的表达模式，仍是鉴定特定器官或细胞类型最常用的方法 非洲爪蟾 胚胎。这是因为该技术具有多项优势。在出现任何组织学分化迹象之前，基因表达即可识别特定结构，例如 nkx2.5 在心脏前体细胞出现任何明确界定之前的心肌前体细胞中的表达 18一旦所有试剂齐备，该方法还具有很高的成本效益。除了获取编码目标基因的质粒外，几乎无需额外的时间和成本投入，即可制备大量可有效重复使用的个体探针。根据我们的经验，尽管每次使用不可避免地会带来少量稀释，探针仍可重复使用多年而活性损失极小。最后，在使用不同探针时，几乎无需进行额外优化。
探针合成的质量是实验方案成功的关键因素。检测RNA探针质量的方法有多种，但在TAE凝胶上直接电泳是一种快速、简便且相当可靠的方法。我们通常使用溴化乙锭对RNA进行染色，但大多数机构要求对此类染料的凝胶进行特殊处理和处置。市面上有无毒的替代染料，但我们尚未系统比较这些替代品在探针可视化方面的效果。RNA探针应呈现为单一条带，尽管在TAE凝胶上其条带相较于DN...

特定基因的表达模式是确定该基因在特定器官或细胞类型发育过程中潜在作用的重要信息。简而言之，若基因未在正确的时间和位置表达，则其发挥关键作用的可能性较小。在 非洲爪蟾，与大多数早期胚胎一样，检测基因表达最常用的检测方法是整体原位杂交 原位 使用标记的反义RNA探针进行杂交。利用抗体染色评估基因表达 非洲爪蟾 随着研究人员发现通常针对哺乳动物蛋白产生的抗体也能与之发生交叉反应，这种情况正变得越来越普遍 非洲爪蟾 同源物或自行生成 1-3然而，绝大多数关于 非洲爪蟾 器官发生研究仍普遍使用反义RNA探针。当采用抗体时，每种抗体通常需要针对一抗浓度或固定方案进行优化。相比之下，该方案的 原位 不同探针的杂交条件基本保持不变。其基本概念相对简单，且已有完善的标准化实验方案。 4. 我们的方案是原始方案的简化版本 4 仍能对早期胚胎中的基因表达模式提供优异的检测效果。胚胎经固定后，通过更换溶液和调整温度进行杂交前处理，以确保标记的反义RNA探针与其靶mRNA实现高严谨性结合。未结合的探针经洗涤去除后，将胚胎进行后续处理，使其与针对RNA探针上标记物的抗体结合。洗去多余抗体后，利用酶促显色反应定位RNA探针在胚胎中的结合位置。目前已有多种转基因爪蟾品系，可在特定组织中驱动荧光蛋白的表达，这些品系可从 非洲爪蟾 如伍兹霍尔的国家非洲爪蟾资源中心等保种中心。尽管该方案对于需要在活体胚胎中研究器官发生的许多实验非常有用，但转基因品系需要单独饲养。 
原位 杂交可以清晰地界定特定器官或细胞类型在早期胚胎中的形成位置（图1该技术具有极高的灵敏度，能够在单个胚胎的少量细胞中检测到基因表达。 5。然而， 原位 由于显色反应并非线性过程，因此通过比色染色强度进行的杂交结果不被视为可定量。尽管染色强度的量化存在困难，但表达水平的变化通常十分明显；尤其是在 原位 杂交显示表达区域大小的可量化增加或减少 6,7. 
整体装片的显著优势 原位 杂交使其成为早期发育研究中的关键检测方法。然而，该方法耗时较长，需在数天内完成多个步骤。本方案是对标准流程的简化版本，省略了多个步骤，同时不降低结果质量 原位 结果。这种简化还消除了变异来源，使得出现问题时更易于排查。 原位 杂交效果不理想。具体而言，我们去除了蛋白酶K和RNase对胚胎的处理步骤，这两个步骤对试剂质量有依赖性，且若处理过度会降低信号强度。该方案还因省去了多种试剂的使用而在一定程度上节约了成本。最后，本方案还提供了一些简单的指南，以改进图像采集质量 原位 杂交结果。尽管本方案已针对以下工作优化 非洲爪蟾 胚胎中，至少部分简化方法可能是适用的 原位 其他胚胎系统中的杂交实验工作。

<table><tbody><tr><td>Labguake 试管振荡器</td><td>VWR</td><td>17-08-2011</td><td></td></tr><tr><td>VWR 小瓶</td><td>VWR</td><td>10-07-2012</td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>BioShop</td><td>CYS342.500</td><td></td></tr><tr><td>核糖核苷三磷酸试剂盒，100 mM</td><td>罗氏</td><td>11277057001</td><td></td></tr><tr><td>地高辛-11-UTP</td><td>罗氏</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>RNase抑制剂（RNase OUT）</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA 聚合酶</td><td>Fermentas</td><td>EPO111</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA聚合酶</td><td>Fermentas</td><td>EPO101</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA聚合酶</td><td>Fermentas</td><td>EPO131</td><td></td></tr><tr><td>Dnase 1</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>18047-019</td><td></td></tr><tr><td>羊血清</td><td>&amp;nbsp;Wisent</td><td>31150</td><td></td></tr><tr><td>封闭剂</td><td>罗氏</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>BM 紫色 AP 底物</td><td>罗氏</td><td>11442094001</td><td></td></tr><tr><td>抗地高辛-碱性磷酸酶 Fab 片段</td><td>罗氏</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>VWR</td><td>CAMX0485-7</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioShop</td><td>SOD002.10</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>电子显微镜&amp;nbsp;</td><td>7910</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioShop</td><td>EDT001.500</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>BioShop</td><td>TRS003.5</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>电子显微镜&amp;nbsp;</td><td>9480</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>Mops</td><td>BioShop</td><td>MOP001.250</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E-3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>BioShop</td><td>PAR070.500&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>&amp;nbsp;VWR&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>CAFX0420-4&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RNA</td><td>罗氏</td><td>10109223001</td><td></td></tr><tr><td>马来酸</td><td>&amp;nbsp;VWR&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>CAMX0100-3</td><td></td></tr><tr><td>三水合柠檬酸钠</td><td>BioShop</td><td>CIT001</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢（30% 溶液）</td><td>电子显微镜&amp;nbsp;</td><td>HX0635-2</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>BioShop</td><td>ALB001.100</td><td></td></tr><tr><td>PVP-40</td><td>ICN</td><td>195451</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0300-10</td><td></td></tr><tr><td>苯甲醇</td><td>Sigma</td><td>B-1042</td><td></td></tr><tr><td>苯甲酸苄酯</td><td>Sigma</td><td>B-6630</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>16500-500</td><td></td></tr></tbody></table>

使用简化的原位杂交方案研究xenopus早期器官发生过程

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

器官发生是研究器官在发育过程中如何被确定，并获得其特定形态和功能的学科。 非洲爪蟾laevis 胚胎因其体积较大，在研究器官发生时非常有用，便于在器官发生的最初阶段识别各种器官。目前，用于识别特定器官或原基的主要方法是整体装片法。 原位 使用针对目标器官中表达的基因的标记反义RNA探针进行杂交。此外，操纵基因或信号通路相对容易 非洲爪蟾 和 原位 杂交可用来检测目标器官在存在性或形态学上的变化。整体装片 原位 杂交是一种需要多天完成且涉及多个步骤的实验流程。本文提供了一种简化后的方案，减少了步骤和试剂的使用数量，适用于常规检测。 原位 杂交机器人极大地简化了该过程，我们详细说明了在流程中如何以及何时使用该技术。一旦 原位 杂交完成后，获取结果的最佳图像可能令人困扰。我们提供有关如何优化成像的建议 原位 杂交结果。尽管该方案描述了器官发生过程的评估 Xenopus laevis，相同的基本方案几乎肯定可以被调整适用于 Xenopus tropicalis 及其他模型系统。

使用组织特异性探针可提供有关特定器官发育状态的出色信息。在以下示例中，胚胎的发育阶段依据 Nieuwkoop 和 Faber 分期表11确定。若使用在分化后表达的基因探针，例如在 28–30 期检测cardiac troponin I（图 1C），则可在分化后的任何阶段评估已分化器官的存在与否或大小。多年前，胚胎学家依靠对早期胚胎组织学的深入知识进行此类分析12,13，但这种专业知识在目前的胚胎学家群体中已基本失传。尽管这一专业知识的丧失令人遗憾，但原位杂交技术的可靠性和易用性使得任何研究人员均可实现对特定组织的识别。一些相对不明显的组织，例如胚胎 25 期的孵化腺（图 1A），可通过原位杂交清晰标记，而无需依赖特异性抗体或组织学技术（图 1C）。此外，整体胚胎原位杂交技术使得研究人员能够在完整胚胎的背景下观察整个器官，而不必依赖组织切片的推断（图 2）。即使是位于胚胎深层的组织，如视神经...

由于其体积较大且易于操作，Xenopus laevis 胚胎在早期发育研究中仍然具有极高的应用价值。本文提供了一种简化的整体原位杂交（whole mount in situ hybridization）实验方案，可用于该模型系统中特定器官的鉴定。

使用简化的原位杂交方案研究Xenopus早期器官发生过程

器官发生是研究器官在发育过程中如何被确定，并获得其特定形态和功能的学科。Xenopus laevis 胚胎……

以下实验的总体目标是展示特定基因在完整胚胎中的表达位置。该目标通过第二步将RNA固定在胚胎内原位来实现。针对目标基因的反义RNA探针将与胚胎内的靶RNA进行杂交。该探针包含一个表位，通常是地高辛，随后可对其进行检测。接着，将碱性磷酸酶偶联的抗体与RNA探针上的表位杂交，然后使用比色染色法。为了观察RNA在胚胎中的定位，根据显色反应结果并结合胚胎解剖学知识，可精确显示目的基因的表达位置。与现有方案相比，我们研究所的方案主要优势在于速度更快、试剂用量更少，且未出现明显质量损失。该方法可解答胚胎学中的关键问题，例如组织如何被特化并形成特定模式。尽管该方法可用于研究作品的发育过程，也可广泛应用于其他多种小型胚胎，如斑马鱼和小鼠早期胚胎。我们最初开始开发这些方法，是因为传统方法耗时较长，因此我们尝试省略Ed步骤，以提高实验流程的效率，同时不降低实验质量。胚胎固定需分阶段进行。首先，准备好将用于所有步骤的玻璃小瓶，包括最终储存胚胎的步骤，以便在实验全过程的各个阶段对胚胎进行观察和监测。使用带有优质聚四氟乙烯（Teflon）密封盖的透明小瓶，并用永久性记号笔在小瓶上标注相应的实验信息。用透明胶带覆盖标签，以防止在实验过程中标签丢失。由于实验中使用醇类及其他有机溶剂，需按照方案文本所述配制MFA固定液。将每支已标记的玻璃小瓶中加入三到四毫升 MFA 溶液。将100%甲醇溶液于-20摄氏度保存。制作一支切割过的玻璃移液管，用于将胚胎转移至含有 Memphis 溶液的玻璃小瓶中进行固定。将胚胎连同尽量少的培养基液体一并加入。每个小瓶固定不超过20至30个胚胎。将胚胎置于Memphis溶液中，在室温下于摇床中孵育两小时。在完成多聚甲醛固定后，将 Memphis 溶液替换为约四毫升的 -20 摄氏度 100% 甲醇，用于在组装探针合成反应前保存胚胎。让 DNA 水、NTP 混合液和聚合酶缓冲液升温至室温。该实验成功最关键的步骤之一是正确组装探针反应体系。在室温下配制探针合成反应体系。按以下顺序将各组分加入一个1.5毫升微量离心管中：模板DNA、水（调整体积至反应总体积为20微升）、NTP混合液、RNA抑制剂、RNA聚合酶缓冲液和RNA聚合酶，然后在37摄氏度孵育转录反应2小时。孵育时间略长于两小时不会产生不良影响，但若孵育仅一小时，则产量会有所降低，尽管仍足以制备出良好的探针。转录反应完成后，取一微升反应混合物用于1%琼脂糖TAE凝胶电泳检测，剩余反应混合物保留备用。加入80 µL含1% SDS的TE缓冲液、10 µL 5 M醋酸铵和220 µL冷乙醇。剧烈涡旋混合，并将混合物置于冰上静置，直至获得RNA质量检测结果。在沉淀前取出的1 µL RNA中加入水和标准上样染料，随后将RNA上样至含有AUM溴化物的1%琼脂糖TAE凝胶中进行电泳。使用紫外光透射仪观察琼脂糖凝胶上溴化乙锭标记的RNA，以检测探针的质量。应可见一条清晰的单一条带，上下无拖尾现象。确认RNA质量合格后，将先前置于冰上保存的剩余RNA在微量离心机中以最大速度离心10至15分钟，进行沉淀。用拉细的玻璃移液管吸除上清液，让RNA短暂干燥。随后，将探针重悬于RNA杂交缓冲液中，置于15毫升带螺旋盖的聚苯乙烯管内，于-20 °C保存。开始此操作时，取出保存在-20 °C甲醇中的胚胎，使其恢复至室温。整个操作均在玻璃小瓶中进行。若同一组中的不同胚胎需用不同的探针进行检测，在添加探针之前应将其保留在同一个小瓶中。为减少第一天准备探针添加步骤时的变异性和工作量，应按照本表所述通过甲醇系列进行胚胎再水化，并使用玻璃移液器小心地更换每种溶液，因为在该步骤中胚胎容易受损。转移液体时，检查管盖内侧，确保胚胎未被卡在其中。每次更换溶液后，轻轻摇动胚胎，以确保它们没有粘附在管壁或彼此粘连。在使用RNA杂交缓冲液和探针前，需将胚胎置于摇床上，并将杂交缓冲液和探针预先加热至65摄氏度。将胚胎在探针溶液中杂交过夜，次日在65摄氏度下轻轻摇动。移除探针溶液，并将其保存在已标记日期和使用次数的15毫升螺旋盖聚苯乙烯管中。将探针溶液储存在-20摄氏度。探针移除后，按照此处所述的系列洗涤步骤对胚胎进行针对该探针的抗体染色前处理；根据需要，将连接有胚胎管的移液器直接转移至设定好相应温度的杂交炉中以调节温度。在胚胎于封闭液中孵育期间，配制适量体积的封闭液并加入抗-地高辛抗体，使抗体在加入胚胎前预先封闭。将胚胎在抗体溶液中于4°C、摇床上孵育过夜，次日继续操作。移除抗体溶液，用含有马来酸和氯化钠的 mab 溶液洗涤。室温下振荡洗涤至少 12 次，每次 30 分钟。将最后一次洗涤液替换为碱性磷酸酶底物。于室温下轻轻振荡孵育过夜，进行染色反应。按照本表中所述更换液体，终止染色反应，并对胚胎进行储存和成像前的处理。胚胎复水后，用MFA固定染料30分钟。固定后，移除MFA，并用25%甲醇洗涤胚胎。如果需要去除内源性色素，移除25%甲醇并加入漂白液。密切观察漂白过程，因为该过程发生较快，且可根据不同需求调整漂白程度。对于长期保存，在短期保存和后续成像前，将胚胎经漂白后通过甲醇梯度脱水至100%甲醇，然后将胚胎转移至PBS。未透明化的胚胎最适合在1%琼脂糖背景下观察和成像。制备琼脂糖溶液时，将琼脂糖加入水中并加热至沸腾，直至琼脂糖完全溶解。待琼脂糖冷却至50摄氏度后，倒入培养皿中，厚度约为两毫米。当 aros 培养皿准备就绪后，将未清除背景的胚胎放入培养皿中，并继续进行成像。aros 可提供蓝灰色背景，与胚胎及染色反应的蓝色形成良好对比。它还有助于弥散干扰性的阴影和反射光，避免注意力从胚胎上分散，从而便于从不同角度（例如腹侧）对胚胎进行成像。使用精细镊子在琼脂糖中切割出适合胚胎的切口。将胚胎放入这些通道中以进行定位。操作胚胎时需小心谨慎，因其容易受损。使用光纤光源以浅角度照射胚胎，使胚胎表面产生阴影，从而增强图像的立体感，并有助于识别表面结构，因为漂白可能去除提供有用解剖标志的色素。对于漂白程度较高的胚胎，应利用阴影效果进行观察。透明化处理后的胚胎可用于观察位于胚胎内部较深区域的染色信号，例如脊索、肺或脑部区域。在本实验方案中，采用不同程度的漂白以观察胚胎中的染色情况。如果染色较强，较轻的漂白处理可保留部分色素，有助于更准确地判断胚胎的发育阶段和定位。然而，如果染色区域本身色素含量较高（如肾脏区域），则更强的漂白处理可获得更佳的效果。对 ARO 基部的操作有助于胚胎的定向。例如，通过在 aros 上切出一条细小的通道，可使侧卧的蝌蚪期胚胎稳定地以腹面朝上进行观察，从而获得高质量的图像。该胚胎被放置在一个微小的孔洞中，孔洞使其位置固定且腹面朝上，从而能够完整观察目的基因的表达模式。在经PAX2染色但未透明化的不透明胚胎中，可观察到内部器官；而在透明化处理后的胚胎中，内部器官的观察效果更佳。在34期，视神经茎以及神经管均可见，但细节不够清晰。通过胚胎透明化处理，包括视神经茎在内的表达区域边界变得更加清晰。透明程度可通过在此胚胎中能否看到两只眼睛来判断。然而，透明化胚胎常见的问题是部分染色会积聚在内部腔隙中。观看本视频后，您应能较好地掌握如何快速进行整体原位杂交实验，使用更少的试剂并获取高质量的图像。

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了解早期器官使用简体<em&gt;原位</em&gt;杂交协议<em&gt;爪</em

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