斑马鱼胚胎中组织特异性荧光的半自动化成像

本实验的总体目标是自动检测活体斑马鱼幼鱼中对雌激素有响应的细胞。首先通过繁殖五条 X-E-R-E-G-F-P 成年鱼获得雌激素报告基因斑马鱼胚胎，以此实现该目标。随后，将胚胎分别放入96孔板的各个孔中。

然后将雌激素加入胚胎培养板中。最后，使用带有电动载物台的落射荧光显微镜对培养板进行荧光扫描。最终，通过荧光显微镜观察雌激素受体在组织中的特异性活性。

因此，与高通量或高内涵筛选等传统技术相比，该技术的主要优势在于仅需使用标准的倒置荧光显微镜并配备电动载物台，即可对斑马鱼幼鱼中的组织特异性荧光进行成像，无需专用的酶标仪。需注意，含双酚A（BPA）和雌二醇的化学品具有危害性，可能对人类胎儿造成不良影响。

谨慎操作内分泌干扰物，并始终使用适当的个人防护装备。在本实验中，斑马鱼将在受精后48小时开始暴露于不同剂量的雌激素17β-雌二醇、双酚A和染料木黄酮，实验流程包括斑马鱼的繁殖、卵子的收集与均等分配。在处理当天，将冻存的母液化学物质用1毫升E3B加PTU溶液稀释1000倍，并剧烈涡旋混匀。

作为溶剂对照，使用大口径塑料移液管将 DMSO 按 1:1000 的比例稀释于 E3B 和 PTU 中，并用移液器将每孔 3 枚胚胎转移至 96 孔板中，每种条件准备 3 个孔。

避免将胚胎置于外周孔中，以防止长期处理过程中培养基蒸发。操作需迅速，以免胚胎干燥，吸去每孔中的培养基，加入 200 µL 充分混匀的处理溶液。肉眼确认所有胚胎均浸没在溶液中，且未黏附在孔壁上。

将胚胎在受精后72小时于28.5摄氏度下孵育。通过向每个孔中加入10微升浓度为4毫克/毫升的三卡因（trica）麻醉胚胎。将96孔板放置于电动载物台上，并使用蔡司Zen Blue 2011软件进行操作。

通过选择样本载具选项并选择 96 孔板，然后在遵循逐步操作说明之前选择校准。使用 10 倍物镜以及明场（BF）设置，识别一个阳性对照胚胎，并为明场和 GFP 通道适当设置曝光参数，确保荧光信号未使相机饱和。聚焦于单个胚胎，并设置显微镜以获取共三个 Z 层图像，包括当前焦平面以上 50 微米和以下 50 微米各一张图像。

接下来，设置软件参数，以使用 GFP 和明场（BF）通道采集拼接图像。在采集选项卡下，选择高级设置，选择拼接区域，然后选择拼接图像。选择圆形区域。

选择合适的孔板载体并设置90%的填充因子，以对选定的孔进行多视野成像，使每个孔90%的区域在合成图像中可见。在选项中，选择所需的重叠度，例如5%至10%，以确保图像之间平滑拼接。随后开始成像，使用20倍物镜和明场（BF）模式手动采集图像，并识别阳性对照胚胎。

按照之前设置的明场（BF）和GFP参数进行成像。该图显示了96孔板中各个孔的复合图像。每幅图像由59张单幅图像组成，图像间重叠率为5%。

请注意，活体斑马鱼在每个孔中的方向是随机的。然而，我们仍能够区分心脏和肝脏中的荧光信号。明场图像可作为参考，用于评估斑马鱼的方位并观察形态学异常。

此处显示的图像是使用 20 倍长工作距离物镜拍摄的，以进行更详细的分析，并且是在完成上述自动扫描后，未将培养板从显微镜载物台上移除的情况下直接拍摄的。使用 20 倍物镜，可将心脏中的荧光精确定位于箭头所示的房室瓣以及箭头所指的主动脉瓣。一旦掌握该技术，每天可完成 3 个 96 孔板的图像采集。

请注意，操作内分泌干扰化合物可能存在危险，因此在进行本实验时，务必采取适当的预防措施，例如穿戴合适的个人防护装备。