Name: 组织特异性荧光的斑马鱼胚胎半自动成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 学习利用半自动荧光显微镜成像技术检测斑马鱼胚胎中雌激素响应细胞的组织特异性活性。该方法使用X-E-R-E-G-F-P转基因品系，通过96孔板培养和 motorized stage 扫描，实现高通量活体成像。

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感谢Susan Farmer以及阿拉巴马大学伯明翰分校斑马鱼研究设施的工作人员对斑马鱼饲养的支持。本研究由药理学与毒理学系的启动资金资助。

注意：本方案已获得阿拉巴马大学伯明翰分校机构动物护理和使用委员会批准。
1. 斑马鱼繁殖与卵收集
<ol>
	<li>在开始化学暴露前3天，组装带有隔板的繁殖缸，用于分隔雄鱼和雌鱼。每个缸中加入半缸循环养殖系统水。使用网具将Tg(5xERE:GFP)c262/c262 鱼转移至繁殖缸中，每缸放入2条雄鱼和3条雌鱼，并用隔板分隔。为每个缸盖上盖子，并标注日期及待交配品系。</li>
	<li>次日早晨，移除所有隔板和挡板，使繁殖缸一端形成浅水区。让斑马鱼自然交配，并以10分钟&#160;为间隔收集胚胎，以确保精确的发育阶段判定。用E3B培养基通过茶筛冲洗，清洗卵子，并轻柔地将胚胎冲洗至培养皿中。将成鱼放回永久性养殖缸中。</li>
	<li>在体视显微镜下对胚胎进行分选、计数，并剔除未受精、形态异常或受损的胚胎。将正常胚胎置于含E3B培养基的培养皿中，在28.5 °C条件下培养，光照周期为14小时光照:10小时黑暗。胚胎密度可能影响发育，每只100 × 35 mm培养皿中不超过100个胚胎，每只60 × 15 mm培养皿中不超过50个胚胎。</li>
	<li>在受精后24小时（hpf），将培养基更换为含有200 μM 1-苯基-2-硫脲（PTU）的E3B培养基。PTU可抑制色素形成，使斑马鱼胚胎和幼鱼保持透明，从而提高成像清晰度。注意：高浓度PTU母液具有危害性；配制E3B+PTU溶液时需佩戴手套。</li>
	<li>在受精后1天（dpf），使用精细镊子人工去除每个胚胎的卵膜。尽管卵膜似乎不影响雌激素的渗透，但去除后可提高成像清晰度。无需从培养基中清除脱落的卵膜。备注：除人工去膜外，也可采用化学法去膜，即使用1 mg/ml&#160;蛋白酶处理，方法如先前文献所述11。</li>
</ol>
2. 胚胎的化学处理
<ol>
	<li>处理前一天，将每种化学物质的储备液以DMSO（或适当的溶剂）配制成1,000倍浓度的溶液。例如，若需使胚胎暴露于10 μM双酚A（BPA），则应将BPA储备液配制成10 mM的100% DMSO溶液。这可确保各处理组中DMSO浓度一致，并使1:1,000稀释的DMSO达到无毒水平，作为溶剂对照。将储备液储存于-20 °C。本实验方案中，胚胎将暴露于1 μM和10 μM BPA、18.5 nM和1.85 μM染料木黄酮、367 nM雌二醇（阳性对照）以及溶剂对照（0.1% DMSO，阴性对照）。 
	警告：双酚A（BPA）和雌二醇等化学品具有危害性，可能对人类胎儿产生不良影响。操作内分泌干扰物时应谨慎，并始终佩戴适当的个人防护装备。</li>
	<li>处理当天，将预先配制的化学储备液解冻。通过移液将1 ml&#160;E3B + PTU加入1.5 ml&#160;微量离心管中，再加入1 μl&#160;储备液，实现1:1,000稀释。充分涡旋混匀。将DMSO以1:1,000比例稀释至E3B + PTU中作为溶剂对照。另取1 mL E3B + PTU置于1.5 ml&#160;微量离心管中作为空白对照。</li>
	<li>使用大孔径塑料移液管，将胚胎从培养皿转移至96孔板中，每孔3个胚胎，每种条件设3孔。为防止长时间处理过程中液体蒸发，避免在板的外周行和列（A行和E行，1列和12列）放置胚胎。外周孔可加入300 μl E3B + PTU。适当标记板盖。</li>
	<li>使用细尖塑料移液管从各孔中移除培养基。操作应迅速，以避免胚胎干燥。</li>
	<li>向对应孔中加入200 μl&#160;处理溶液。将板盖倒置于板下作为参照，确保处理液准确加入相应孔中。加样前对每根离心管进行涡旋，使化学物质充分混匀。肉眼确认每个胚胎均处于处理液中。若胚胎附着于孔壁，可用洁净的移液管蘸取处理液将其冲洗入孔底。</li>
	<li>将96孔板置于28.5 °C培养箱中孵育。胚胎将在72 hpf时进行荧光分析。</li>
</ol>
3. 96孔板中胚胎的自动化成像
<ol>
	<li>通过向每个孔中加入 10 μl 的 4 mg/ml 三卡因溶液来麻醉胚胎。 
	注意：成像前需对胚胎进行麻醉。在 24–96 hpf 期间，斑马鱼会表现出自发运动，并在图像采集过程中因光源变化而产生惊吓反应。麻醉胚胎可减少成像期间的运动。</li>
	<li>将 96 孔板放置于电动载物台上并校准载物台。使用 Zeiss Zen Blue 2011 软件进行显微镜自动化与控制，选择 sample carrier 选项，并选择 multiwell 96。点击 calibrate，然后按照逐步提示完成载物台校准。 
	注意：此步骤后切勿取消选中“tiles”按钮。若取消选中该按钮，可能导致校准设置丢失，需重新校准 96 孔板。</li>
	<li>使用 10 倍物镜和明场（BF）模式，识别一个阳性对照胚胎，并为 BF 和 GFP 通道适当设置曝光参数，确保荧光信号未使相机饱和。对单个胚胎进行调焦，并设置显微镜采集共 3 层 Z 轴切片图像，即在当前焦平面之上 50 μm 和之下 50 μm 各采集一幅图像。 
	注意：由于不同组织位于不同的焦平面，此设置可确保每条斑马鱼的心脏和肝脏均能在图像中清晰对焦。</li>
	<li>设置软件参数以使用 GFP 和 BF 通道采集拼接图像。在 acquisition 选项卡下，选择 advanced setup，然后选择 tile regions，再选择 tiles，并选择 circle well 选项。 
	注意：图像拼接用于生成每个孔的合成图像。单个视野仅能覆盖每个孔的一小部分区域，而拼接功能可自动从每个孔中采集多个相邻视野，从而生成整个孔的合成图像。因此，可自动采集每块板上 96 个合成图像，每个合成图像包含来自单个孔的数十幅独立图像。</li>
	<li>选择 carrier 和 fill factor 90%。选择 90% 的填充因子将对选定孔采集多幅图像，使得每个孔 90% 的区域在合成图像中可见。 
	注意：选择填充因子时，屏幕上将显示一个示意图，表示将要成像的区域。应根据实验需求选择合适的百分比，以覆盖孔中适当的成像区域。</li>
	<li>在 options 下选择所需的重叠比例。 
	注意：在将多个图像拼接为单个代表性图像时，5–10% 的重叠可实现图像间平滑过渡。然而，若无需图像拼接，则使用 0% 重叠可缩短成像时间。当使用 90% 填充因子和 5% 重叠时，单个孔的合成图像由 59 幅独立图像组成。</li>
	<li>开始成像。显微镜将自动采集图像。</li>
	<li>手动检查每个孔的合成图像中的组织特异性荧光（图 1）。</li>
	<li>注意：建议首先检查阳性对照，以确认化学处理有效，然后再观察实验处理组孔。</li>
</ol>
4. 在96孔板中对胚胎进行手动图像采集
注意： 为确认结果，使用 20 倍长工作距离物镜手动获取更详细的图像（图 2）。
<ol>
	<li>使用 20 倍物镜和明场（BF）模式，识别阳性对照胚胎，并适当设置明场和 GFP 通道的曝光参数，确保荧光信号未使相机饱和。</li>
	<li>逐一识别胚胎并手动采集图像。 
	注意：一旦为阳性对照胚胎确定了曝光设置，便不再更改设置。这可确保在相同条件下采集每幅图像，从而实现荧光强度的比较。</li>
</ol>

<ol><li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62(2007).</li>
<li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li>
<li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Estrogen+Receptor+Transcriptional+Activation+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish.</a> Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).</li>
<li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+A+tool+for+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C%3A+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).</li>
<li>Peravali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+feature+detection+and+imaging+for+high-resolution+screening+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 50, 319-324 (2011).</li>
<li>Walker, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+reporter+quantification+in+vivo%3A+high-throughput+screening+method+for+reporter-based+assays+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Vogt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).</li>
<li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+estrogen+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li>
<li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , 4th edn, University of Oregon Press. (2000).</li>
</ol>

作者无任何竞争性经济利益。

本方案描述了一种自动成像斑马鱼胚胎中组织特异性荧光的简便方法。该方案使用配备 Zen Blue 2011 软件的 Zeiss Axio Observer. Z1 显微镜开发完成，但该技术也可适配于任何配备电动载物台且显微镜控制软件支持拼接以生成复合图像的倒置显微镜。为倒置显微镜加装电动载物台，可作为高通量筛选专用设备的一种实用且成本较低的替代方案。电动载物台的价格根据显微镜的品牌型号及载物台质量的不同，从数千至数万美元不等。
该实验方案中包含若干关键步骤。某些化学物质对光敏感，因此在处理过程中将胚胎置于避光环境中孵育可能更为有利。斑马鱼胚胎对干燥敏感。因此，对于持续超过一天的化学暴露处理，必须在96孔板边缘的孔中加入培养基，以减少蒸发（方案步骤2.3）。
还必须确保载物台经过仔细校准（实验方案步骤 3.2）。一个常见的错误是将培养板放置在载物台上时未完全固定。在这种情况下，当载物台移动时，培养板的位置可能发生偏移，导致某些孔部分成像或完全无法成像。在连续成像多个培养板时，只要这些板来自同一制造商且在载物台上的放置方向完全相同，...

已开发出转基因斑马鱼，可在活体胚胎中直接可视化多种信号通路的活性，例如成纤维细胞生长因子1、视黄酸2和雌激素3信号通路。此类工具可用于筛选干扰信号通路的化学物质（通过荧光强度变化进行检测）或以组织特异性方式调节信号通路的化学物质（通过荧光定位变化进行检测）4。自动化图像采集可显著提高化学筛选的通量5,6。目前许多针对活体斑马鱼的自动化荧光检测依赖昂贵且专用的设备。所谓高内涵筛选虽能实现高分辨率、定量成像，但需配备共聚焦显微镜的专用微孔板读板仪，成本较高7,8。本方法旨在利用常规的落射荧光显微镜，在96孔板中自动检测斑马鱼胚胎的组织特异性荧光。该技术可有效区分组织特异性荧光，对于缺乏专用微孔板读板仪或高内涵筛选设备的实验室而言，可能是一种切实可行的替代方案。
在本实验方案中，我们采用自动化成像技术，在受精后3天（dpf）的活体斑马鱼中检测组织特异性的雌激素受体（ER）激动剂。转基因品系 Tg(5xERE:GFP)c262/c262 在绿色荧光蛋白（GFP）3 的上游含有5个串联的雌激素反应元件DNA序列（ERE）。在无配体的情况下，雌激素受体通常处于非活性状态。配体结合可诱导受体发生构象变化，使其能够结合ERE DNA并调控转录9。5xERE:GFP斑马鱼可用于筛选化学文库中的ER调节剂，也可用于检测环境水样中的雌激素类污染物。

<table><tbody><tr><td>塑料移液管；宽口</td><td>Fisher</td><td>13-711-23</td><td></td></tr><tr><td>塑料移液管；细尖头</td><td>Fisher</td><td>13-711-26</td><td></td></tr><tr><td>96孔圆底平底板</td><td>Fisher</td><td>21-377-203</td><td></td></tr><tr><td>100 × 35 mm 培养皿</td><td>Fisher</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>35 × 60 mm 培养皿</td><td>Fisher</td><td>08-757-100B</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>尖端尺寸为 0.05 × 0.01 mm，用于手动去除胚胎的绒毛膜</td></tr><tr><td>三卡因甲磺酸盐（Tricaine methanesulfonate）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>参见《斑马鱼手册》配方（http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1-苯基-2-硫脲（PTU）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629-10G</td><td>配制 20 mM 储存液（100倍浓度），使用时稀释至 E3B 中含 200 &amp;mu;M&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>本方案需要配备电动载物台的倒置荧光显微镜</td></tr><tr><td>20倍长工作距离物镜</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>我们使用的物镜数值孔径为 0.4，工作距离为 8.4 mm</td></tr><tr><td>Axiocam HRm 数字相机</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZenBlue 2011 显微镜控制软件</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>本方案需要显微成像自动化与控制软件，以支持通过电动载物台采集拼接图像</td></tr><tr><td>亚甲蓝（Methylene Blue）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MB-1; 25 克</td><td>用反渗透水配制成 2% 溶液，用于 E3B（见下文）</td></tr><tr><td>E3B</td><td></td><td></td><td>60倍 E3 溶液：&lt;br/&gt; NaCl&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 17.2 克&lt;br/&gt; KCl&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 0.76 克&lt;br/&gt; CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;·2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 2.9 克&lt;br/&gt; MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;·7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp; - 4.9 克 或 MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; - 2.39 克&lt;br/&gt; 溶于 1 升 Milli-Q 水中；储存于无菌 1 升瓶中。&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 斑马鱼用 1倍 E3B 溶液：&lt;br/&gt; 60倍 E3&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 150 ml&lt;br/&gt; 2% 亚甲蓝&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 100 &amp;mu;l&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 用 Milli-Q 水定容至 9 升&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

斑马鱼胚胎中组织特异性荧光的半自动化成像

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

斑马鱼胚胎是进行小分子大规模筛选的有力工具。表达荧光报告蛋白的转基因斑马鱼常用于鉴定能够调节基因表达的化学物质。针对活体斑马鱼荧光表型的化学筛选通常依赖昂贵且专用的高内涵筛选设备。本文介绍一种利用配备电动载物台的标准落射荧光显微镜，自动成像斑马鱼胚胎并检测组织特异性荧光的方法。我们利用一种通过表达绿色荧光蛋白（GFP）来报告雌激素受体活性的转基因斑马鱼，建立了一种半自动化的筛选流程，用于寻找能够以组织特异性方式激活报告系统的雌激素受体配体。本视频中，我们描述了将受精后24-48小时（hpf）的斑马鱼胚胎排列于96孔板中，并加入可结合雌激素受体的小分子化合物的操作步骤。在受精后72-96 hpf时，自动采集整块96孔板各孔的图像，并人工检查是否存在组织特异性的荧光信号。该方案展示了检测能够在心脏瓣膜中激活受体但不在肝脏中激活的雌激素类物质的能力。

图1展示了96孔板中各个孔的复合图像。每个复合图像由59张独立图像组成，图像间重叠率为5%。请注意，活体斑马鱼在每个孔中的方向是随机的，但我们仍能区分心脏与肝脏中的荧光信号。明场图像可作为参考，用于评估斑马鱼的方位并观察形态学异常（图1A和1C）。使用10倍物镜进行自动成像，可用于化学物质筛选，并确定哪些样品需要进一步在更高放大倍数下进行人工评估。图2展示了使用20倍长工作距离物镜拍摄的图像，以实现更详细的分析。这些图像在完成图1所示的自动扫描后，无需将培养板从显微镜载物台上取下即可直接获取。使用20倍物镜可将心脏中的荧光信号精确定位于心脏瓣膜（图2C-2F）。偶尔，胚胎的方位可能不够理想，导致成像困难并产生结果判读上的不确定性。每个孔中放置3条斑马鱼，并对每种处理设置三个重复（实验步骤2.3），有助于提高准确观察荧光信号的机会。
<img...

本文介绍了一种对斑马鱼胚胎中组织特异性荧光进行半自动化成像的实验方案。

斑马鱼胚胎是进行小分子大规模筛选的有力工具。表达荧光报告蛋白的转基因斑马鱼……

本实验的总体目标是自动检测活体斑马鱼幼虫中对雌激素有响应的细胞。首先通过繁殖五条 X-E-R-E-G-F-P 成年斑马鱼，以获得雌激素报告基因斑马鱼胚胎；随后将胚胎分别放入 96 孔板的各个孔中。然后将雌激素加入胚胎培养板中。最后，使用带有电动载物台的落射荧光显微镜扫描培养板以检测荧光。最终，通过荧光显微镜观察雌激素受体在组织中的特异性活性。因此，与高通量或高内涵筛选等传统技术相比，该技术的主要优势在于仅需使用标准的倒置荧光显微镜并配备电动载物台，即可对斑马鱼幼鱼中的组织特异性荧光进行成像，无需专用的酶标仪。需注意，含双酚A（BPA）和雌二醇的化学品具有危害性，可能对人类胎儿产生不良影响。谨慎操作内分泌干扰物，并始终使用适当的个人防护装备。在此实验中，斑马鱼将在受精后48小时开始暴露于不同剂量的雌激素，包括17β-雌二醇、双酚A和染料木黄酮，实验流程始于斑马鱼繁殖后的受精卵收集与配比。在处理当天，按照说明将解冻的储备化学溶液用1毫升E3B加PTU稀释1:1000，并剧烈涡旋震荡。以DMSO作为溶剂对照。使用大孔径塑料移液管，将DMSO用E3B和PTU按1:1000比例稀释，每孔加入3个胚胎至96孔板中，每种条件准备3个孔。避免将胚胎置于外周孔中，以防止长时间处理过程中培养基蒸发。操作需迅速，以防胚胎干燥，吸去每孔中的培养基，加入 200 µL 充分混匀的处理溶液。肉眼确认所有胚胎均浸没在溶液中，且未贴附在孔壁上。将胚胎在受精后72小时于28.5摄氏度下孵育。通过向每个孔中加入10微升浓度为4毫克/毫升的三卡因（trica）来麻醉胚胎。将96孔板放置于电动载物台上，并使用Zeiss Zen Blue 2011软件进行操作。通过选择样品载具选项并选择 96 孔板，对载物台进行校准。然后选择校准，并按照分步说明操作：使用 10 倍物镜以及明场（BF）模式，识别一个阳性对照胚胎，并为明场和 GFP 通道适当设置曝光参数，确保荧光信号未使相机饱和。聚焦于单个胚胎，并设置显微镜采集共三层 Z 轴图像，包括当前焦平面以上 50 微米和以下 50 微米各一层图像。接下来，设置软件参数以使用 GFP 和明场（BF）通道采集拼接图像。在采集选项卡下，选择高级设置，选择拼接区域，然后选择拼接图像。选择圆形。选择多孔板选项中的载体并设置90%的填满系数，以对选定的孔进行多图像采集，使每个孔90%的区域在合成图像中可见。在选项中，选择所需的重叠范围，例如5%至10%，以便图像之间形成平滑的拼接。然后开始成像，使用20倍物镜和明场（BF）设置手动采集图像，并识别阳性对照胚胎。按照之前的方法设置明场（BF）和绿色荧光蛋白（GFP）参数并采集图像。该图显示了96孔板中各个孔的复合图像。每幅图像由59个单独的图像组成，图像间重叠区域为5%。请注意，活体斑马鱼在每个孔中的方向是随机的。然而，我

semi-automated-imaging-tissue-specific-fluorescence-zebrafish

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

组织特异性荧光的斑马鱼胚胎半自动成像

本文描述了一种利用钛宝石飞秒激光振荡器的双光子吸收效应，对含有笼锁型荧光蛋白的单个细胞进行光激活的方法。为了对光激活的细胞进行命运图谱绘制，采用免疫组织化学技术。该技术可应用于任何类型的细胞。...

斑马鱼单细胞命运图谱绘制

来源： Zhang, X., 等斑马鱼胚胎体内可视化与活体分析生物材料相关性的模型 金黄色葡萄球菌 感染。 视频实验杂志 (2019)本视频展示了注射了金黄色葡萄球菌（Staphylococcus...

斑马鱼胚胎中生物材料相关细菌感染的荧光成像

当胚胎被包埋在低浓度琼脂糖的光学透明聚合物管中时，可通过光片显微镜在数天内连续观察斑马鱼的发育过程。...

斑马鱼长期光片显微镜成像的多层封片技术

成像细胞器及其他亚细胞结构的动态行为 体内 可以揭示它们在生理和疾病状态下的功能。本文介绍了对两种细胞器——中心体和线粒体——进行遗传标记的方法，并利用宽场显微镜和共聚焦显微镜对活体斑马鱼胚胎中这些细胞器的动态行为进行成像。...

活体斑马鱼胚胎中亚细胞结构的成像

有丝分裂对每一种生物都至关重要，其缺陷常导致癌症和发育障碍。利用本成像方案并以斑马鱼作为模型系统，研究人员可以在活体脊椎动物中观察有丝分裂过程，以及当有丝分裂过程出现异常时所产生的多种缺陷。...

活体斑马鱼胚胎中观察有丝分裂及其动态过程

纤毛发育对正常器官形成至关重要。本方案描述了一种优化的方法，用于标记和观察斑马鱼的纤毛细胞。...

通过整体荧光标记联合方案可视化斑马鱼中的多纤毛细胞 原位 杂交与免疫荧光

斑马鱼胚胎和幼鱼的显微注射是一种在多种斑马鱼模型中至关重要的技术，但也具有挑战性。本文介绍了一系列微尺度工具，可用于在显微注射和成像过程中辅助稳定和定向斑马鱼样本。...

用于优化斑马鱼幼鱼显微注射与成像的微结构装置

本方案展示了在早期斑马鱼胚胎冷冻切片上进行连续免疫荧光和免疫组织化学染色的方法，从而实现对特定细胞群体中蛋白共定位的精确分析。...

石蜡切片斑马鱼胚胎的连续免疫荧光与免疫组织化学染色

本方案描述了一种对斑马鱼早期眼部发育进行整体标记和多维成像的方法。我们介绍了利用激光扫描共聚焦显微镜进行标记、包埋和四维（4D）成像的操作步骤，并讨论了优化数据采集的注意事项，以深入解析视杯形态发生机制。...

斑马鱼视杯形态发生的四维成像

本方案利用光片成像技术研究斑马鱼幼虫的心脏收缩功能，并通过细胞追踪和交互式分析深入了解心脏力学特性。...

4D光片成像技术观察斑马鱼心脏收缩

本文描述了一种在完整卵膜内利用光片显微镜对早期斑马鱼胚胎进行成像的样品制备策略。该方法分析了胚胎在原肠胚形成70%期和胚芽期时于卵膜内所采取的不同方位，并详细阐述了如何利用光片显微系统在整个胚胎范围内获得细胞尺度分辨率的成像策略。...

早期斑马鱼胚胎的光片显微成像与样品制备策略

学习利用半自动荧光显微镜成像技术检测斑马鱼胚胎中雌激素响应细胞的组织特异性活性。该方法使用X-E-R-E-G-F-P转基因品系，通过96孔板培养和 motorized stage 扫描，实现高通量活体成像。

斑马鱼胚胎中组织特异性荧光的半自动化成像

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