利用鹌鹑-鸭嵌合体评估物种特异性对颅面部发育的贡献

本实验的总体目标是利用鹌鹑-鸭胚胎导管嵌合体，研究神经嵴细胞在颅面发育过程中产生物种特异性模式的机制。该方法首先从9.5期鹌鹑胚胎的中段及前段后脑区域解剖并移除一条神经褶组织；第二步是将鹌鹑供体的神经褶移植到鸭宿主胚胎中。

第三步包括解剖并移除一个9.5期鸭宿主胚胎的对应区域。最后一步是将环状神经褶植入鸭胚的中脑和前部后脑区域。最终，这些嵌合胚胎可通过原位杂交技术精确定位由神经嵴介导的基因表达变化，也可通过组织学分析揭示形态学上的改变。

我最初产生这种方法的想法时，正在旧金山的海洋海滩观看褐鹈鹕飞过。我意识到，神经嵴细胞一定是物种特异性模式的来源，因为它们会发育形成这些鸟类长喙骨骼的骨和软骨。尽管我未能找到褐鹈鹕的蛋，但我成功获得了北京白鸭的蛋。

鉴于旧金山拥有亚洲以外最大的唐人街，通过利用鹌鹑与鸭子在成熟速度和形态上的差异，该方法可帮助我们回答发育生物学中的关键问题，例如理解物种特有模式的起源。手术将由我实验室的博士后学者詹妮弗·菲什（Dr. Jennifer Fish）博士执行，研究生凯特·奥维茨（Kate Ovitz）将协助操作。使用本生灯加热巴斯德移液管的窄端，直至锥形部分的玻璃开始熔化。将其从火焰中移开，并拉伸管尖，直至移液管完全封闭。

确保拉细部分的外径在 0.7 至 1 毫米之间。然后从拉细处约 4 厘米位置折断封闭端。接着，将约 60 厘米长的橡胶管连接到移液管的开口端，并从另一端吹气。

在通过吹气对导管施加轻微压力时，应确保没有空气从移液管的连接处或其他末端通过。使用丙烷细管火焰枪，在移液管锥形起始处下方的一侧加热一个椭圆形区域。一旦玻璃开始向外弯曲，立即将移液管移开火焰，并通过橡胶管轻轻吹气。

这将导致玻璃受热部分形成一个香肠状的气泡。压力过大会导致玻璃气泡破裂，应避免这种情况。最终在移液管上形成的窗口应约为一厘米宽，一厘米半至两厘米长。

将拉细的一端朝上，用玻璃废液容器刮除气泡，同时轻轻通过管路吹气，以防止玻璃碎片进入移液管。然后使用丙烷火焰小心烧掉气泡残留的边缘，并对开口窗的两侧进行火焰抛光。接下来，将金刚石刻刀垂直握持，用其在移液管拉细端开始处1厘米的位置对拉细端进行划痕。

使用镊子在划痕处轻轻折断移液管。为去除尖端，请在解剖显微镜下检查，确保断裂面平整而非参差不齐。手持移液管的方式应如同握笔，并用食指按住距尖端约 9.5 毫米处的开口窗口。

将移液管靠近酒精灯火焰边缘，使玻璃软化。在解剖显微镜下，用镊子对管尖施加压力，将移液管细端向下弯曲成60度角。迅速而小心地用酒精灯对管尖进行火焰抛光。

完成的开口应呈圆形且无阻碍。注意，如果在火焰中停留时间过长，尖端会收缩并变得无法使用。现在用70%乙醇润滑一段2.5厘米长的橡胶管。

从底部向上将移液管的管身滑动，以覆盖开口窗口。然后将一个2 mL的乳胶吸头套在移液管的开口端。为维持内部气压，首先需准备宿主卵。

使用火焰 sharpened 钨针切割 Vitale 膜，并将膜拉过胚胎。然后用胶带重新密封卵子，方法与供体卵子相同。移除供体卵子窗口处的胶带，以切割供体胚胎的神经褶。

使用火焰 sharpened 钨针在神经管两侧制作切口。然后在移植物所需的前部和后部水平横切神经管，并将移植物从神经管其余部分小心分离。注意任何特定的解剖学细节，例如移植物的前部与后部形态，这将有助于正确地定位供体组织。

植入宿主时，务必确保钨针极为锋利。应使用快速而果断的划动，以完整且整体地移除组织。使用沙门氏移液管从供体胚胎中取出神经褶。吸取时尽量减少液体量，否则组织在转移过程中可能随液体漂走。

现在从宿主卵的窗口处移除胶带，使用萨满移液管将供体神经褶放置在宿主胚胎旁，紧邻将接受移植的神经管区域。接着，按照处理供体的方式，将宿主胚胎的神经褶从神经管上分离。注意切除与供体组织大小相等的移植物。

轻轻地将宿主组织从胚胎远处推开。然后用钝头钨针或微量移液管的圆润尖端，轻柔地将供体神经褶移入宿主神经管内，保持正确的前后轴和背腹轴方向。确保移植物嵌入神经管两侧，但务必避免刺破或损伤下方组织。

应小心轻柔地将无菌生理盐水滴加到宿主胚胎上。若出现任何干燥迹象，此时应小心重新封口并标记蛋壳，然后轻柔地将其放回高湿度培养箱中，使嵌合胚胎发育至所需阶段，以供后续分析。

用于分析时，将嵌合胚胎收集到新配制的冷Sarah固定液中。随后立即置于4°C条件下，在摇床上过夜固定。这将有助于利用抗鹌鹑抗体更灵敏地检测鹌鹑细胞。

通过实时定量 PCR 进行基因表达分析的另一个重要步骤是在 RNA 提取之前将胚胎和液氮冷冻。 Coil 和鸭子在大小和形状上表现出显著差异，因此它们的胚胎非常适合用于构建嵌合体系统。以研究 C 颅面发育。

该系统特别适用于研究神经嵴细胞的作用。在嵌合体鹌鹑胚胎中，供体鹌鹑的神经嵴细胞迁移到宿主鸭的下颌弓，参与面部骨骼的图式形成。从腹侧观察，使用抗鹌鹑抗体可看到呈绿色的鹌鹑供体细胞，其分布呈现类似鸭子的模式。

在12期嵌合胚胎中，供体神经嵴会形成大小和形状均类似于鹌鹑的下颌骨骼。一旦掌握熟练，每次移植操作可在约五分钟内完成。若操作时间过长，会增加胚胎脱水风险，导致存活率下降。

进行此操作时，应注意保持正确的姿势，放松肩部，并维持良好的手部位置。同时，应建立固定的操作流程，每次都将手术器械和试剂放置在相同的位置，以便能够始终注视显微镜，双手以自动化的方式进行操作。