使用纳米压痕、X射线CT、FTIR和扫描电镜对多层鱼鳞（Atractosteus spatula）的表征

本实验的总体目标是通过X射线计算机断层扫描、纳米压痕、傅里叶变换红外光谱以及结合能谱分析的扫描电子显微镜，确定多层矿化鱼鳞的结构、化学成分和力学性能。首先，通过去除鱼鳞上的软组织，对单个鱼鳞进行制备，包括固定、切片以及逐级抛光，以完成分析前的样品准备。第二步是在鱼鳞横截面上利用金刚石Berkovich压头进行空间定位的纳米压痕测试，以测定局部纳米力学性能。

接下来，使用傅里叶变换红外（FTIR）显微镜观察鱼鳞的内层和外层，以鉴定各层中的主要官能团。最后一步是利用扫描电子显微镜上的能量色散X射线（EDX）探测器，将鱼鳞中纳米压痕位置的局部化学成分进行关联分析，并获取不同层及断裂表面压痕的图像。最终，通过结合这些不同的实验技术，从结构与性能关系的角度阐明矿化鱼鳞的天然设计原理。

与整体统计纳米压痕等其他现有测试方法相比，该技术的主要优势在于能够真正实现化学组成结构与局部力学性能之间的直接关联。我们已将该方法应用于研究结构生物材料中感兴趣区域的空间分布、化学组成结构以及力学性能。该技术还可广泛应用于水泥基材料、多相复合材料，以及任何在微米和纳米尺度上表现出异质性的各类非均质材料。

为了观察鱼鳞短轴的横截面，将鱼鳞置于直径为32毫米的样品模具中，并使用市售的塑料样品夹固定鱼鳞，以确保在环氧树脂包埋过程中样品方向正确。待样品在模具中固定后，将未固化的环氧树脂倒入样品上。按照制造商的说明使环氧树脂固化后，使用金刚石刀片高精度切割锯在样品中线位置对包埋好的样品进行切片。

样品加载至纳米压痕仪并进入后，使用软件控制将试样移至首个压痕位置，并在此位置开始进行四排平行的压痕，每排间距为15 µm，以获得具有统计学意义的数据集。随后，将纳米压痕的参数设置为最大载荷5 mN，加载和卸载速率为0.1 mN/s，保载时间为30秒，每排压痕之间的最小间距为5 µm。当批量压痕完成后，将纳米压痕仪在第一排和最后一排压痕位置分别创建定位标记压痕，其最大载荷为100 mN，这两个标记压痕应分别位于骨层之前的环氧树脂区域和骨层之后的区域。

纳米压痕实验后，将样品放回 PBS 溶液中以避免进一步脱水。牢固地安装样品，使其最长维度与探测器平行。设置好扫描仪后，使用对 X 射线透明的材料（如聚苯乙烯泡沫和对二甲苯）将安装好的样品固定在扫描仪载物台上。

将样品放置于旋转中心位置。在整个扫描过程中，选择能够使整个标尺位于视场范围内的最高分辨率，本例中为 7.5 微米。数据采集完成后，对 X 射线投影图像进行重建，以生成包含横截面图像的数据集。

然后使用软件获取最终的三维灰度图像。调整灰度范围至适当水平，以去除聚苯乙烯泡沫和戊二醛产生的伪影。对于抛光样品上纳米压痕的扫描电镜（SEM）或扫描电子显微成像，需使用双面导电碳胶带将样品固定在SEM样品台上，使压痕面朝上。接着，将样品放入SEM腔室，并将腔室抽至低真空模式。

将工作距离调整至3.0至5.0毫米之间。启动高电压，导航至样品上的目标区域，此处即为角质层和骨层中存在的结构。随后在5千伏至15千伏的高电压条件下，以3.9纳安的较低束流电流获取图像。

为提高分辨率，使用低真空背散射电子（BSE）探测器，在250倍至10,000倍放大倍数下，至少采集三个感兴趣区域的图像，以辅助识别生物矿物成分和密度的变化。随后，导航至抛光样品上的一个感兴趣区域，该区域应包含由每行压痕末端的基准标记指示的纳米压痕网格。确保高压至少为15千伏。

束流电流至少为3.9纳安，工作距离大于5.0毫米。然后使用EDX采集待分析区域的背散射电子图像。使用EDX分析软件。

拍摄同一图像，以帮助确定沿压痕线进行化学分析的区域。接下来，使用线分析技术，沿压痕线上从第一个压痕到最后一个压痕的感兴趣区域画一条线，以进行化学分析。根据压痕的数量，设定沿该线分布的分析点数量，使化学成分与力学性能之间具有直接的空间对应关系。

当线段定位准确且各点正确指定后，使用EDX软件启动线分析。在线分析完成后，从光亮样品表面指定线段上获得的点谱中识别出需要量化的元素。

确定目标元素后，执行背景校准以校正韧致辐射及其他效应的影响。选择软件中的解卷积分析选项，对指定线上的每个点进行定量分析，以确定各点的化学成分。最后，保存定量化学分析结果以及所分析指定线的图像，以辅助与纳米压痕法测得的ano层力学性能进行空间关联。该ano层的纳米压痕测得的平均模量为69.0 giga pascals，硬度为3.3 giga pascals。

纳米压痕测得骨层的平均模量为14.3吉帕，硬度为0.5吉帕。釉骨质层与骨层在化学组成上存在可量化的差异。骨层中的碳信号升高可能归因于矿化程度较低，这会导致碳含量增加，并降低背散射电子（BSE）图像的亮度。骨层与釉骨质层的傅里叶变换红外光谱（FTIR）显示，外层釉骨质层具有羟基磷灰石的特征峰，而内层骨层则表现出胶原蛋白的特征峰。

X射线计算机断层扫描显示，当鳞片重叠时，gwe层并未覆盖骨层。较亮的灰色gwe层密度更高、更坚硬且更刚硬，而较暗的灰色骨层密度较低且刚性较弱。在ging层中心附近观察到明显的凹坑，表明其具有非均匀性。

较低放大倍数的扫描电镜图像显示，蚀刻断裂表面的龈层呈现出分层排列的纳米结构，这与傅里叶变换红外光谱（FTIR）结果相一致。高倍扫描电镜图像显示，龈层中存在取向排列的纳米棒结构，而在骨层中则观察到类似纤维的纳米结构。该技术为生物材料和复合材料的进一步研究奠定了基础，可用于研究化学成分、结构和力学性能的空间分布，以及多相复合材料中的界面特性。好了，观看本视频后，您应能充分理解如何制备样品并开展分析，以在结构型生物材料中实现化学成分、结构与力学性能之间的空间关联。

这些技术也可用于研究其他类型的非均质多相材料，并可根据需要进行调整。