Name: 表征多层鱼鳞（中 Atractosteus锅铲）基于纳米压痕技术，X射线CT，红外光谱和SEM (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: 了解利用纳米压痕、X射线CT、红外光谱和SEM技术表征Atractosteus spatula多层鱼鳞的结构、化学组成与力学性能的方法。该技术可实现化学成分与局部力学性能的空间关联分析。

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作者感谢美国陆军工程研究与发展中心（ERDC）军事工程6.1基础研究计划以及ERDC定向研究中心项目为本研究提供的经费支持。作者还感谢ERDC岩土与结构实验室混凝土与材料分部的工作人员及设施对实验工作的支持。本论文发表已获得岩土工程部主任的许可。 &amp;#38; 结构实验室

1. 鱼鳞样本制备
本研究中，鳞片取自美国陆军工程研究与发展中心（ERDC）环境实验室，位于体侧中段（29th 尾部脊柱）取自一条长约600毫米的雀鳝（A. 解剖刀铲）。鱼鳞的获取遵循了ERDC和美国国立卫生研究院（NIH）的动物护理指南。
<ol>
	<li>材料 
	记录用于研究的鱼鳞在鱼体上的空间位置。务必遵守相关组织或政府机构关于获取生物样本的指导原则，例如 NIH 动物护理指南。将鱼鳞储存在适当的介质中，例如磷酸盐缓冲盐水溶液，以保持其水合状态并维持矿物质含量，尤其是在从鱼体上取下后。避免长期储存，以免导致矿物质流失，从而影响纳米压痕数据。使用中等硬度的刷子和镊子去除硬鳞上的任何软组织。</li>
	<li>样本固定与切片 
	使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）和纳米压痕技术检测鱼鳞短轴的横截面（图1）时，需先将鱼鳞固定在刚性介质中，例如由树脂和固化剂组成的双组分环氧树脂。建议选用通用型室温固化环氧树脂，且其放热峰温度较低；本研究中所用的商用通用环氧树脂峰值温度低于 55 °C。</li>
</ol>
<img alt="Microscopic anatomy diagram showing short-axis transverse section labeled with directional axes." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. X射线CT图像 A. 刮勺 显示本研究中所检查的短轴横断面的示意图 A. 刮勺 使用纳米压痕和傅里叶变换红外光谱（A：前部，P：后部，D：背部，V：腹部）。
<ol start="2">
	<li>
	<ol>
		<li>使用市售的塑料样品夹具，将鱼鳞固定在直径为 32 mm 的样品模具中。这可在环氧树脂包埋过程中保持样品的正确取向。</li>
		<li>样品固定在模具中后，将未固化的环氧树脂倒入样品上，然后按照制造商的说明使环氧树脂固化。</li>
		<li>环氧树脂固化后，使用金刚石刀片高精度切割锯沿样品中线对包埋好的样品进行切片。</li>
		<li>在蒸馏水中超声处理 15 分钟，以去除样品上的任何碎屑。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纳米压痕与傅里叶变换红外光谱（FTIR）的抛光 
	为获得如图 2所示的光滑平整表面以进行纳米压痕测试，建议采用以下抛光程序和参数，该建议基于与抛光设备制造商的讨论及测试样品的结果。然而，针对不同生物材料，可能需要根据材料去除速率等响应情况对参数进行调整。在抛光步骤之间，将样品置于蒸馏水浴中超声处理至关重要，以确保较粗抛光步骤产生的颗粒不会带入后续的精细抛光步骤中。</li>
</ol>
<img alt="嵌入塑料 holder 中的鱼鳞（环氧树脂包埋），显微镜制备样品，标尺为 250 μm。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 经抛光的 A. spatula 鱼鳞横截面（短轴切面）在环氧树脂中封片后的显微图像。
<ol start="4">
	<li>
	<ol>
		<li>使用15 µm碳化硅（SiC）抛光垫和水作为润滑剂进行粗抛光，在自动抛光头压力为7 lbf、转速为200转/分钟（rpm）的条件下，直至样品表面平整。</li>
		<li>将样品置于蒸馏水浴中超声清洗15分钟。</li>
		<li>使用6 µm碳化硅（SiC）抛光垫，以水为润滑剂，在转盘转速130 rpm、压力7 lbf的条件下进行中等抛光，持续5分钟。</li>
		<li>将样品置于蒸馏水浴中超声清洗15分钟。</li>
		<li>使用1 µm碳化硅（SiC）抛光垫，以水为润滑剂，在转盘转速130 rpm、压力7 lbf的条件下抛光5分钟。</li>
		<li>将样品置于蒸馏水浴中超声清洗15分钟。</li>
		<li>使用50 nm胶体二氧化硅悬浮液进行最终抛光，选用适合50 nm悬浮液的抛光垫，例如制造商推荐的高密度、非织造、低绒毛多孔聚氨酯抛光垫。在转速130 rpm、压力7 lbf的条件下抛光5分钟。</li>
		<li>将样品置于蒸馏水浴中超声清洗15分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 纳米压痕测试
<ol>
	<li>每次测试前，按照制造商的指南校准纳米压痕系统。校准应包括确定 Berkovich 压头的系统面积函数和框架刚度。此外，在此步骤中执行显微镜与压痕仪的校准，以确保压痕位置与所选显微镜位置相对应。</li>
	<li>将样品装入纳米压痕仪，并使用纳米压痕仪上的光学显微镜控制装置使样品聚焦。</li>
	<li>使用软件控制将样品移动至第一个压痕位置。理想情况下，该位置应位于釉质层边缘沿鳞片横截面中心线方向，在环氧树脂中约 10 µm 处。</li>
	<li>从此位置开始，进行 4 条平行排列的压痕，压痕间距为 15 µm，以获得具有统计学意义的数据集。将纳米压痕仪设置为最大载荷 5 mN，加载和卸载速率为 0.1 mN/sec，保载时间为 30 秒，每行压痕的最小间距为 5 µm。压痕行应设置为垂直于釉质层表面，并设定足够数量的压痕，使其横跨鳞片横截面，同时穿过骨层后在环氧树脂中再深入约 10 µm。</li>
	<li>当一批测试完成后，在第一和最后一个压痕位置使用纳米压痕仪创建基准压痕，最大载荷为 100 mN，分别位于釉质层前的环氧树脂中和骨层后的环氧树脂中。这些基准压痕对应每行压痕的起始点和终止点。</li>
	<li>完成纳米压痕后，将样品重新放回 PBS 溶液中，以避免进一步脱水。</li>
	<li>如果观察到材料响应与时间无关，则使用纳米压痕软件基于 Oliver-Pharr 方法13计算模量和硬度。否则，可能需要延长保载时间，以克服因卸载过快而引起的蠕变效应。</li>
</ol>
3. 空间分辨ATR-FTIR光谱法
将滑入式ATR附件连接到傅里叶变换红外（FTIR）显微镜上，是采集鱼鳞样品各层空间分辨FTIR光谱的一种推荐方法。ATR附件能够以非常小的空间分辨率（约10 μm2）采集高质量光谱，这是其他任何FTIR技术都无法实现的。这些实验中所使用的样品与用于纳米压痕实验的抛光样品相同（图2）。
<ol>
	<li>选择一个表面和尺寸适合所用傅里叶变换红外显微镜（FTIR显微镜）分析的样品，以确保通过ATR-FTIR显微光谱法获得高质量的光谱。</li>
	<li>准备傅里叶变换红外显微镜以采集数据。傅里叶变换红外显微光谱分析需要在与样品测量相同的采样条件下对FTIR信号进行校准。通常包括冷却检测器并使其稳定，以及在相同的环境条件下采集所有背景光谱和样品光谱。这一点尤为重要，因为空气中的CO2和水蒸气会显著影响FTIR光谱。同时必须确保仪器的光学系统已正确对准。</li>
	<li>采集适当的背景光谱，用于后续扣除样品信号。在本实验中，采用抛光的金镀膜显微镜载玻片作为傅里叶变换红外显微光谱分析的背景。</li>
	<li>使用合适的物镜对样品进行聚焦，并选择感兴趣的分析区域。</li>
	<li>找到感兴趣区域后，将ATR附件连接至FTIR显微镜物镜，抬升样品使其与ATR内反射元件实现紧密接触，然后采集样品光谱。</li>
	<li>采集完FTIR光谱后，执行必要的标准数据处理步骤。</li>
</ol>
4. X射线计算机断层扫描（CT）
<ol>
	<li>按照第1.1节所述获取并准备鳞片样品</li>
	<li>扫描仪设置
	<ol>
		<li>根据制造商的规格要求预热X射线源。</li>
		<li>将X射线电压和电流分别设置为50 kV和160 µA。</li>
		<li>将曝光时间设置为1,450毫秒。</li>
		<li>选择1.0 mm的铝滤光片。</li>
		<li>在装载样品前，当X射线源关闭时（暗场）和开启时（亮场）分别进行平场校正。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安装并装载样品 
	必须以确保鳞片在整个扫描过程中不会发生移动或偏移的方式进行固定。此外，这些样品必须使用对X射线几乎透明的材料进行安装。可使用聚苯乙烯泡沫和Parafilm的组合将鳞片牢固地固定在CT载物台上。
	<ol>
		<li>牢固安装样品，使其最长维度与探测器平行。</li>
		<li>将已安装的样品固定到扫描仪载物台上。</li>
		<li>调整样品位置，使其在整个扫描过程中位于旋转中心。</li>
		<li>选择允许整个鳞片处于视场（FOV）范围内的最高分辨率，在本例中为7.5 µm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采集设置 
	本研究中以0.25°的旋转步长和15帧的帧平均值进行扫描。若可接受较低分辨率，可增大步长和/或减少帧平均值以缩短总扫描时间。</li>
	<li>重建参数 
	获得数据集后，将X射线投影图像重建为包含横截面图像的数据集。除以下设置外，其余均采用Skyscan的NRecon软件默认设置。
	<ol>
		<li>将环形伪影校正设置为20。</li>
		<li>将束硬化校正设置为25%。</li>
		<li>调整CS静态旋转，使横截面图像保持水平。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像处理 
	使用Skyscan的CTAn 软件获得最终的三维灰度图像。适当调整灰度范围，以去除聚苯乙烯泡沫和Parafilm产生的伪影。</li>
</ol>
5. 扫描电镜成像与EDX分析
采用抛光法制备用于纳米压痕及微米/纳米结构表征的样品，并通过扫描电子显微镜（SEM）进行观察。使用低真空模式以尽量减少样品脱水以及施加导电涂层的需求。在抛光样品上结合SEM成像，利用能量色散X射线光谱法（EDX）进行局部化学分析。EDX分析在与纳米压痕测试相同的线/网格位置进行，以建立化学性质与力学性能之间的关联。此外，还通过SEM观察新鲜断裂表面，以更清晰地了解鱼鳞中生物矿化结构的形貌与取向。为了提高对断裂表面纳米级结构观察的分辨率，样品经溅射镀金（Au）处理，并在高真空模式下成像。以下将提供所用实验步骤的更多细节。
<ol>
	<li>抛光表面的扫描电镜成像
	<ol>
		<li>将抛光后的样品放入扫描电镜腔室，并将腔室抽至低真空模式，压力为0.1至0.5 mbar。</li>
		<li>将工作距离调整至约 5.0 mm。</li>
		<li>开启高压（HV），导航至样本上包含釉质层与骨基底层之间过渡区或其他感兴趣区域的部位。</li>
		<li>在15 kV高压和约3.9 nA束流电流下获取图像。</li>
		<li>聚焦图像并完成所有必要的对准和像散校正调整。</li>
		<li>使用低真空背散射电子（BSE）探测器，在相关放大倍数下（通常为250X至10,000X）至少采集三个感兴趣区域的图像，以辅助识别生物矿化成分和密度的变化即致密骨与多孔骨</li>
	</ol>
	</li>
	<li>断裂表面的扫描电镜成像
	<ol>
		<li>将新鲜断裂的样品固定到 90° 使用双面碳导电胶带将SEM样品台固定，使断裂面朝上。</li>
		<li>用金（Au）溅射镀膜，在断口表面形成一层亚纳米级厚度的导电层。</li>
		<li>将样品放入扫描电镜腔室，并将腔室抽至高真空状态。</li>
		<li>将工作距离调整至3.0至5.0 mm之间。</li>
		<li>开启高压，导航至样本上的目标区域。本案例中的主要关注区域是釉质层和骨层中存在的结构。</li>
		<li>在5 kV至15 kV的高压和0.24 nA的较低束流电流下获取图像，以提高分辨率。</li>
		<li>首先对样本进行聚焦并完成初步校准。</li>
		<li>将放大倍数提高至5,000倍以上，并从常规场发射透镜切换至浸没式/超高分辨率（UHR）透镜。</li>
		<li>进行超高分辨率对中及散光校正调整。</li>
		<li>使用镜筒探测器（TLD）在二次电子（SE）模式下，以适当放大倍数（通常为5,000X至250,000X）对至少三个感兴趣区域进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对抛光表面进行EDX分析（与SEM成像结合进行）。这些参数取决于材料性质，需要进行调整，以使EDX相互作用体积与纳米压痕相互作用体积的尺寸相近，如Moser所述。14.
	<ol>
		<li>导航至抛光样品上包含纳米压痕网格的感兴趣区域，该网格由每行压痕末端的基准标记指示。</li>
		<li>确保高压至少为15 kV，束流至少为3.9 nA，工作距离大于5.0 mm。</li>
		<li>使用EDX分析前，先获取待分析区域的背散射电子（BSE）图像。</li>
		<li>使用EDX分析软件采集相同图像，以帮助定位沿压痕线进行化学分析的区域。</li>
		<li>使用“线分析”技术，沿从第一个压痕开始到最后一个压痕结束的感兴趣线段放置一条线，以进行化学分析。</li>
		<li>指定沿直线放置的分析点数量。最好使用与现有压痕数量相同的分析点，以提供化学成分与力学性能之间的直接空间关联。</li>
		<li>当线条定位准确且指定的点正确时，使用EDX软件启动线分析。</li>
		<li>当线分析完成后，从在样品抛光表面指定线路上获得的点谱中识别出需要量化的元素。</li>
		<li>确定目标元素后，进行背景校准以校正韧致辐射及其他效应。</li>
		<li>选择该软件的去卷积分析选项，以对指定线路上的每个点进行定量分析，从而量化各点的化学成分。</li>
		<li>保存定量化学分析结果，并保存所分析指定线的图像，以辅助与纳米压痕法测得的力学性能进行空间关联。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

从实验角度来看，研究人员需要记住，在处理天然生物材料（如矿化鱼鳞）时，报告鱼鳞在鱼体上的空间位置至关重要，因为先前的研究表明，矿化鱼鳞的力学性能与其在鱼体上的位置有关4。
矿化生物材料的力学性能也被证明依赖于样品的水合状态4。当试图将充分水合的新鲜样品与公开文献中使用干燥化石样品的研究结果进行比较时，这一因素限制了该技术的适用性。因此，应避免过长的测试时间，以尽量减少脱水对样品在纳米压痕过程中力学性能的影响。建议针对具体材料开展预实验研究，以确保实验运行时间足够短，不会改变材料的力学行为。如果测试设备允许，湿细胞纳米压痕法是优选方法，可维持材料恒定的水合状态。
本研究中采用的纳米压痕方法通过卸载曲线计算弹性模量，该方法假设材料表现为线弹性各向同性材料。该技术可与多种压头尖端配合使用。然而，本研究采用了半角为65.35°的三面体Berkovich压头。其他类型的压头（如立方角压头，半角=35.36°）也适用于本文所述的实验流程，但由于立方角压头比Berkovich压头更尖锐，因此在远低于Berkovich压头所需载荷的条件下就可能在样品中引发裂纹。
抛光是获得光滑平整表面的关键步骤，其表面粗糙度需降至最低，以免影响纳米压痕测试结果。本文所述的抛光步骤为建议性操作流程，具体可能需要根据所使用的抛光设备类型进行调整。然而，确保获得准确纳米压痕数据的关键步骤是最大限度地降低表面粗糙度；对于本研究中的特定材料，需进行50&#160;nm的最终抛光，才能在所探测的压痕深度范围内获得光滑平整的表面。
压痕间距还可确保获得准确的纳米压痕数据，避免受到先前压痕所引起材料变形的影响。本研究中所用设备的纳米压痕仪用户手册建议，压痕间距至少应为20–30倍&#160;Berkovich压头的最大压入深度15对于替代材料，所需的压痕间距需根据已公开文献中讨论的施加载荷和最大压痕深度来确定。16,17此外，选择该材料的保载时间是为了克服所测试的不同材料相中出现的任何蠕变现象，从而可采用纳米压痕仪软件的Oliver-Pharr分析方法。然而，正如Oyen所讨论的18 当与时间相关的材料响应无法通过适当的保持时间消除时，可采用其他分析方法来处理生物材料。
为了从X射线CT获得高分辨率结果，必须优化多个设置。本文概述了一组针对具有特定尺寸和分层厚度的鱼鳞样本的非常具体的参数。对于不同尺寸的样本，需要调整这些设置以获得最高质量的数据集。选择每个参数的过程应在所用设备附带的用户手册中明确定义。扫描参数（电压、电流、曝光时间、滤光片选择）和重建参数（环状伪影、射束硬化）可能需要根据其他各种样本尺寸和几何形状进行调整。
X射线CT提供了整体形态的图像，识别出在鳞片互不重叠的区域，存在一层覆盖在骨性基质上的珐琅质层。X射线CT图像还显示，该珐琅质层在鳞片上的厚度不均匀，甚至存在完全缺失珐琅质层的凹坑结构。
有趣的是，与 SEM/EDX 化学分析在空间上相对应的纳米压痕数据揭示了两种区域之间存在明显的离散转变&#160;层，而非矿化鱼鳞中观察到的更渐变的过渡 P. senagalus （在 Bruet 中） 等. 2).
纳米压痕、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、能量色散X射线光谱（EDX）和扫描电子显微镜（SEM）相结合，提供了机械性能、化学成分和结构信息，证实外层为具有类似釉质形态和化学性质的釉质层。此外，这些技术还证实内层为骨性材料层。
综上所述，本研究中概述的方法确定了从整体结构到纳米结构及化学成分，对匙吻鲟（A. spatula）矿化鱼鳞进行分析的实验流程及相关结果。

研究人员正在研究结构型生物材料，并试图阐明这些材料的设计原理，这些设计原理使结构型生物材料相较于其单一组分具有更优异的力学性能，例如更高的韧性与强度。Pagrus major7、Polypterus senegalus2,6、Arapaima gigas3、Cyprinus carpio4 和 Atractosteus spatula1 等具甲鱼类鳞片的设计原理研究表明，有必要拓展现有实验方法的应用范围，以研究此类材料的结构响应与微观结构特征，因为目前尚无针对这类材料和实验的详细标准操作流程。
在所讨论的不同披甲鱼类鳞片中，A. spatula 是美国中部历史上的一种顶级掠食者8，其物种具有高度矿化的鳞片。与此前提及的体型相近的鱼类相比，该物种通过减少肌肉质量而增加皮肤质量，从而获得更优的防御捕食机制9。根据 Page 和 Burr10 的研究，A. spatula 是北美洲第三大淡水鱼类，体型更大的物种为白鲟（Acipenser transmontanus）和大西洋鲟（Acipenser oxyrhynchus）。目前对 A. spatula 高度矿化鳞片的研究尚属初步。Thompson 和 McCune11 提出，雀鳝鳞片的形态具有三层结构，包括最外层的釉质层、中间的松质骨层以及内层的板层骨层。然而，当前针对 A. spatula 鳞片的研究尚未将骨层进一步区分为松质骨和板层骨区域，而是将骨质部分整体视为单一的内层进行研究1,12。
本研究基于傅里叶变换红外光谱（FTIR）、扫描电子显微镜（SEM）、X射线计算机断层扫描（X-ray CT）和纳米压痕技术的结果，介绍了对A. spatula鳞片的微观结构、纳米结构、化学成分以及力学性能空间分布的研究方法。

<table><tbody><tr><td>环氧树脂</td><td>Buehler</td><td>701-501512</td><td></td></tr><tr><td>环氧固化剂</td><td>Buehler</td><td>703-501528</td><td></td></tr><tr><td>Samplkups</td><td>Buheler</td><td>20-8180</td><td></td></tr><tr><td>SamplKlips I</td><td>Buehler</td><td>20-4100-100S</td><td></td></tr><tr><td>高精度切割锯</td><td>Buehler</td><td>Isomet</td><td></td></tr><tr><td>UltraMet 2002 超声波清洗器</td><td>Buehler</td><td>B2510R-MT</td><td></td></tr><tr><td>抛光机</td><td>Buehler</td><td>49-1750-160</td><td></td></tr><tr><td>1,200 目（15 &amp;mu;m）碳化硅砂纸</td><td>Struers</td><td>40400012</td><td></td></tr><tr><td>4,000 目（6 &amp;mu;m）碳化硅砂纸</td><td>Struers</td><td>40400014</td><td></td></tr><tr><td>50 nm 胶体二氧化硅</td><td>Buehler</td><td>40-10075</td><td></td></tr><tr><td>适用于 50 nm 悬浮液的 Chemomet 抛光垫</td><td>Buehler</td><td>40-7918</td><td></td></tr><tr><td>纳米压痕仪</td><td>MTS</td><td>G200</td><td></td></tr><tr><td>FTIR 连续光谱显微镜</td><td>Thermo Nicollet</td><td>6700</td><td></td></tr><tr><td>X 射线计算机断层扫描仪</td><td>Skyscan</td><td>Skyscan 1173</td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜（SEM）</td><td>FEI</td><td>NovaNanoSEM 630</td><td></td></tr><tr><td>能谱仪（EDX）</td><td>Bruker</td><td>AXS Xflash detector 4010</td><td></td></tr><tr><td>溅射镀膜仪</td><td>Denton</td><td>Desk II</td><td></td></tr></tbody></table>

使用纳米压痕、x射线ct、ftir和扫描电镜对多层鱼鳞（atractosteus spatula）的表征

Characterization Of Multi-layered Fish Scales (Atractosteus spatula) Using Nanoindentation, X-ray CT, FTIR, and SEM

诸如矿化鱼鳞、腹足类贝壳、盘羊角、鹿角和龟壳等具有防护功能的生物材料，其层级结构提供了独特的设计原理，有望为未来防护材料与系统的研发提供指导。理解这些材料体系在微米和纳米尺度下（失效起始位置）的结构-性能关系至关重要。目前，纳米压痕、X射线计算机断层扫描（CT）和扫描电子显微镜（SEM）等实验技术为研究人员提供了将材料力学行为与其层级微结构相关联的手段1-6。然而，目前尚无针对矿化生物材料样品制备的明确定义的标准流程。本研究展示了利用纳米压痕、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、扫描电子显微镜（SEM）结合能谱X射线微区分析（EDX）以及X射线CT，对A. spatula多层鳞片中空间相关联的化学、结构和力学性能进行探测的方法。

图3展示了在约800 μm长的短轴横向截面上进行的空间相关纳米压痕/扫描电镜/能量色散X射线分析的平均结果。在约60 μm厚的釉质层中，纳米压痕仪测得的平均模量为69.0 GPa，硬度为3.3 GPa。在约740 μm厚的骨层中，纳米压痕仪测得的平均模量为14.3 GPa，硬度为0.5 GPa。
EDX检测出碳、氧、钙和磷元素，这些元素通常存在于矿化的鳞片中。然而，珐琅质层和骨层在化学组成上存在可量化的差异。骨层中观察到的碳信号升高可能归因于该区域矿化程度较低，导致碳含量略有增加，同时也引起了背散射电子（BSE）图像整体亮度的下降。具体而言，珐琅质层的钙磷平均原子浓度比为1.71，接近于理论值为1.67的羟基磷灰石。而骨层的平均钙磷比降至1.51，表明其矿化程度较珐琅质层有所降低。
FTIR 谱图在 图4 骨层和釉质层的主要官能团被鉴定为酰胺、羧基、磷酸基和羰基。具体而言，傅里叶变换红外光谱（FTIR）证实了外层（釉质层）中羟基磷灰石特征和内层（骨层）中胶原蛋白特征的肉眼观察结果。在3,500–3,000 cm⁻¹范围内出现的峰−1 由于1,550至1,500 cm⁻¹范围内的NH伸缩振动和NH弯曲振动−1 代表骨层中的酰胺基团。波数在1,470-1,365 cm⁻¹范围内的峰−1 表示酰胺取代的烷基。此外，在 1,641 cm⁻¹ 处出现特征性的 C=O 伸缩振动峰−1 在骨层上观察到 3,000–2,500 cm⁻¹ 范围内的峰。−1 代表羧基。骨层和釉质层的光谱均在约 1,079.33 cm⁻¹ 处产生一个明显的特征峰−1 表明磷酸基团的伸缩振动。
图5中的X射线CT图像显示，当鳞片相互重叠时，闪光质层并未覆盖骨层。较亮的灰色闪光质层代表密度更高、更坚硬且更刚性的相，而较暗的灰色骨层则代表密度较低且刚性较弱的相。此外，X射线CT图像有助于识别闪光质层厚度的非均匀性。事实上，在闪光质层中心附近可观察到明显的凹坑，这些区域完全未覆盖骨层。
用 H3PO4 蚀刻的断裂表面的扫描电镜图像（图6A）显示，釉质层具有呈层状排列的纳米结构。这种由纳米棒有序排列形成的结构与傅里叶变换红外光谱（FTIR）在釉质区域获得的羟基磷灰石特征信号相对应。
图6A 展示了典型低倍扫描电镜（SEM）显微照片，显示断裂表面，虚线清晰标示出闪鳞质层与骨层之间的过渡区域。图6B 展示了经 H3PO4 蚀刻后断裂表面的高倍扫描电镜图像。蚀刻后，外层闪鳞质中的取向纳米棒结构清晰可辨，而在骨层中则观察到类似纤维的纳米结构。
<img alt="弹性模量与元素分布数据的力学和化学成分分析图。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 纳米压痕测得的模量与硬度数据，与扫描电镜/能谱化学成分分析在空间上相关联。
<img alt="FTIR光谱比较；外层与内层；示意图；材料分析；反射率。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 从外层（釉质层）和内层（骨质层）采集的FTIR光谱。
<img alt="鱼鳞结构示意图；骨组织切片，闪石层分析；标注的横截面。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
图5. X射线CT图像显示覆盖在内层（骨质层）之上的外层（闪石层）表面存在凹坑。
<img alt="显示多层鱼鳞的电子显微镜图像；闪光质纳米棒及纤维结构分析。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6. (A) 典型断裂表面的低倍扫描电镜图像，(B) 外层（闪光质）纳米棒和内层（骨质）纤维的高倍放大图像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51535/51535fig6highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>

本文介绍了利用纳米压痕、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、扫描电子显微镜（SEM）和X射线计算机断层扫描（X射线CT）来研究Atractosteus spatula（A. spatula）多层鳞片中化学、结构和力学性能空间相关性的方法。实验结果用于探究防护性生物材料的设计原理。

使用纳米压痕、X射线CT、FTIR和扫描电镜对多层鱼鳞（Atractosteus spatula）的表征

具有保护功能的生物材料（如矿化的鱼鳞、腹足类动物贝壳、羊角、鹿角和龟甲）的层级结构……

本实验的总体目标是通过X射线计算机断层扫描、纳米压痕、傅里叶变换红外光谱以及结合能谱分析的扫描电子显微镜，确定多层矿化鱼鳞的结构、化学成分和力学性能。首先，通过去除鱼鳞上的软组织，对单个鱼鳞进行制备，包括固定、切片以及逐级抛光，以完成分析前的样品准备。第二步是在鱼鳞横截面上利用金刚石Berkovich压头进行空间定位的纳米压痕测试，以测定局部纳米力学性能。接下来，使用傅里叶变换红外（FTIR）显微镜观察鱼鳞的内层和外层，以鉴定各层中的主要官能团。最后一步是利用扫描电子显微镜上的能量色散X射线（EDX）探测器，将鱼鳞中纳米压痕位置的局部化学成分进行关联分析，并获取不同层及断裂表面压痕的图像。最终，通过结合这些不同的实验技术，从结构与性能关系的角度阐明矿化鱼鳞的天然设计原理。与整体统计纳米压痕等其他现有测试方法相比，该技术的主要优势在于能够真正实现化学组成结构与局部力学性能之间的直接关联。我们已将该方法应用于研究结构生物材料中感兴趣区域的空间分布、化学组成结构以及力学性能。该技术还可广泛应用于水泥基材料、多相复合材料，以及任何在微米和纳米尺度上表现出异质性的各类非均质材料。为了观察鱼鳞短轴的横截面，将鱼鳞置于直径为32毫米的样品模具中，并使用市售的塑料样品夹固定鱼鳞，以确保在环氧树脂包埋过程中样品方向正确。待样品在模具中固定后，将未固化的环氧树脂倒入样品上。按照制造商的说明使环氧树脂固化后，使用金刚石刀片高精度切割锯在样品中线位置对包埋好的样品进行切片。 样品加载至纳米压痕仪并进入后，使用软件控制将试样移至首个压痕位置，并在此位置开始进行四排平行的压痕，每排间距为15 µm，以获得具有统计学意义的数据集。随后，将纳米压痕的参数设置为最大载荷5 mN，加载和卸载速率为0.1 mN/s，保载时间为30秒，每排压痕之间的最小间距为5 µm。当批量压痕完成后，将纳米压痕仪在第一排和最后一排压痕位置分别创建定位标记压痕，其最大载荷为100 mN，这两个标记压痕应分别位于骨层之前的环氧树脂区域和骨层之后的区域。纳米压痕实验后，将样品放回 PBS 溶液中以避免进一步脱水。牢固地安装样品，使其最长维度与探测器平行。设置好扫描仪后，使用对 X 射线透明的材料（如聚苯乙烯泡沫和对二甲苯）将安装好的样品固定在扫描仪载物台上。将样品放置于旋转中心位置。在整个扫描过程中，选择能够使整个标尺位于视场范围内的最高分辨率，本例中为 7.5 微米。数据采集完成后，对 X 射线投影图像进行重建，以生成包含横截面图像的数据集。然后使用软件获取最终的三维灰度图像。调整灰度范围至适当水平，以去除聚苯乙烯泡沫和戊二醛产生的伪影。对于抛光样品上纳米压痕的扫描电镜（SEM）或扫描电子显微成像，需使用双面导电碳胶带将样品固定在SEM样品台上，使压痕面朝上。接着，将样品放入SEM腔室，并将腔室抽至低真空模式。将工作距离调整至3.0至5.0毫米之间。启动高电压，导航至样品上的目标区域，此处即为角质层和骨层中存在的结构。随后在5千伏至15千伏的高电压条件下，以3.9纳安的较低束流电流获取图像。为提高分辨率，使用低真空背散射电子（BSE）探测器，在250倍至10,000倍放大倍数下，至少采集三个感兴趣区域的图像，以辅助识别生物矿物成分和密度的变化。随后，导航至抛光样品上的一个感兴趣区域，该区域应包含由每行压痕末端的基准标记指示的纳米压痕网格。确保高压至少为15千伏。束流电流至少为3.9纳安，工作距离大于5.0毫米。然后使用EDX采集待分析区域的背散射电子图像。使用EDX分析软件。拍摄同一图像，以帮助确定沿压痕线进行化学分析的区域。接下来，使用线分析技术，沿压痕线上从第一个压痕到最后一个压痕的感兴趣区域画一条线，以进行化学分析。根据压痕的数量，设定沿该线分布的分析点数量，使化学成分与力学性能之间具有直接的空间对应关系。当线段定位准确且各点正确指定后，使用EDX软件启动线分析。在线分析完成后，从光亮样品表面指定线段上获得的点谱中识别出需要量化的元素。确定目标元素后，执行背景校准以校正韧致辐射及其他效应的影响。选择软件中的解卷积分析选项，对指定线上的每个点进行定量分析，以确定各点的化学成分。最后，保存定量化学分析结果以及所分析指定线的图像，以辅助与纳米压痕法测得的ano层力学性能进行空间关联。该ano层的纳米压痕测得的平均模量为69.0 giga pascals，硬度为3.3 giga pascals。纳米压痕测得骨层的平均模量为14.3吉帕，硬度为0.5吉帕。釉骨质层与骨层在化学组成上存在可量化的差异。骨层中的碳信号升高可能归因于矿化程度较低，这会导致碳含量增加，并降低背散射电子（BSE）图像的亮度。骨层与釉骨质层的傅里叶变换红外光谱（FTIR）显示，外层釉骨质层具有羟基磷灰石的特征峰，而内层骨层则表现出胶原蛋白的特征峰。X射线计算机断层扫描显示，当鳞片重叠时，gwe层并未覆盖骨层。较亮的灰色gwe层密度更高、更坚硬且更刚硬，而较暗的灰色骨层密度较低且刚性较弱。在ging层中心附近观察到明显的凹坑，表明其具有非均匀性。较低放大倍数的扫描电镜图像显示，蚀刻断裂表面的龈层呈现出分层排列的纳米结构，这与傅里叶变换红外光谱（FTIR）结果相一致。高倍扫描电镜图像显示，龈层中存在取向排列的纳米棒结构，而在骨层中则观察到类似纤维的纳米结构。该技术为生物材料和复合材料的进一步研究奠定了基础，可用于研究化学成分、结构和力学性能的空间分布，以及多相复合材料中的界面特性。好了，观看本视频后，您应能充分理解如何制备样品并开展分析，以在结构型生物材料中实现化学成分、结构与力学性能之间的空间关联。这些技术也可用于研究其他类型的非均质多相材料，并可根据需要进行调整。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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