一步纯化双Strep-tag标记蛋白及其复合物的Strep-Tactin树脂交联方法：使用BS3（Bis(sulfosuccinimidyl) suberate）交联树脂

您好，我是来自芬兰赫尔辛基大学的 Christina McKennan。在表征特定蛋白质复合物时，其中一个挑战是确定其分子组成。这需要开发从细胞环境中分离和纯化该复合物的方法。

微生物研究领域涉及植物病毒与宿主的相互作用，因此我们关注感染过程中形成的多种病毒核蛋白复合物。过去，我们已成功利用亲和标签介导的纯化方法在实验室中研究了这些复合物。双链 strep 标签被证明是其中最有效的标签之一。

然而，我们观察到该方法在使用中存在某些局限性，其中之一是产量较低，因此我们希望改进此方法。大家好，我叫Mata，我将带领您完成本实验方案。但在开始之前，让我先为您概述一下该方法的基本原理。

我们采用链霉亲和素磁珠（strep tachin macro prep beads）来纯化双链霉亲和素标签蛋白与其生理结合伴侣之间的特异性复合物。图中绿色部分显示的是四聚体形式的链霉亲和素标签（strep strept tagged and tetramer），蓝色为双链霉亲和素标签蛋白，橙色为其结合伴侣，红色为两个链霉亲和素标签（strep tag）的拷贝。

在标准方法中，未结合的蛋白质以优雅的形态被洗脱去除。结合的复合物则通过粉红色所示的生物素进行竞争性洗脱。然而，在使用该方法时，我们观察到结合复合物的洗脱不完全，仅有部分复合物成功从链霉亲和素珠上解离。

这会导致目标蛋白回收率较低。为进一步分析带来困难，可通过使用含S-D-S-S-D-S的变性洗脱来提高目标蛋白的回收率。在变性的双链Strep-ttag诱饵蛋白周围会形成微球状细胞结构。

其结合伴侣以及解离的链霉亲和素单体。如果样品需要进一步通过质谱分析，则释放出的链霉亲和素造成的样品污染是不可接受的。为解决样品污染问题，我们开发了一种方法，即首先通过化学交联稳定链霉亲和素四聚体。

所得交联树脂用于纯化诱饵蛋白及其结合伴侣，使用 SDS 进行样品洗脱可确保高蛋白回收率，同时树脂的化学交联可确保在没有链霉亲和素标签蛋白释放导致的样品污染的情况下洗脱出带链霉亲和素标签的诱饵蛋白及其结合伴侣。将一支密封的微量离心管（内含 2 毫克 BS3 交联剂）平衡至室温。

通过切掉枪头末端来准备用于树脂转移的枪头，重新悬浮Strep Tact和Macro Prep树脂，短暂剧烈振荡后立即转移600 µL悬浮液至CoStar SpinX过滤柱中，在4,000 ×g下离心30秒。在室温下加入450 µL磷酸盐缓冲液（PBS）。此步骤的目的是用非反应性的磷酸盐替代伯胺三羟甲基氨基甲烷（Tris）。

弃去流穿液。通过反复倒置离心管数次来混匀管内物质。重复离心和洗涤步骤两次，最后将树脂悬浮于430 µL的PBS-pH 8中。

最后一次离心后，用含有100微升超纯水的移液枪头刺穿无菌微量离心管的封口箔，通过轻轻吹打使BS三号粉末溶于水中。一旦BS三号完全溶解，立即取20微升该溶液加入Spin X柱中。确保充分混匀柱内溶液。

将层析柱在室温下旋转孵育30分钟，确保树脂与BS三溶液充分混匀。为终止反应，加入6微升用盐酸调节至pH 7.5的3摩尔Tris溶液。再将层析柱在室温下旋转孵育15分钟，随后以4,000 RPM离心30秒。

室温下，将交联树脂重悬于 450 微升含 Tween 20 的 Tris 缓冲盐水中，弃去穿流液。重复离心和洗涤步骤两次。最后一步中，将树脂重悬于 450 微升 TBS 中。将树脂悬液转移至新管，用另取的 450 微升 TBS 重悬柱中残留的树脂，并转移至同一管中。

重复上一步骤一次，以确保树脂从柱子到管中的转移达到最大程度。将含有树脂悬液的管子在室温下静置10分钟，并调整体积至600微升。通过去除多余的TBS，树脂即可立即使用，或可在4摄氏度下保存而不冻结。

该方法适用于纯化任何带有双链霉素标签（twin strep tag）的融合蛋白及其相关复合物。该蛋白可来源于动物、植物或细菌，并可从全细胞裂解液或富集的细胞器组分中分离。在此示例中，我们从感染病毒的植物核组分中分离马铃薯A病毒的双链霉素标签蛋白VPG Pro：首先将1毫升诱饵蛋白样品在结合缓冲液中，于4°C、13,000 RPM离心10分钟。

将上清液转移至新的离心管中，以尽量减少内源性生物素化蛋白与链霉亲和素标签及树脂的结合。加入avidin，使其终浓度为100微克/毫升，并确保充分混匀。在4摄氏度下旋转孵育15分钟。

通过涡旋振荡重悬交联树脂，并立即使用杯状移液吸头将50 µL树脂悬液加入含有诱饵蛋白样品的离心管中。在4 °C下继续旋转孵育30分钟。将温控混匀仪设置为55 °C，并预热500 µL洗脱缓冲液，用于后续洗脱步骤；然后在4 °C下以2000 RPM离心1分钟。

弃去上清液，用一毫升预冷的洗涤缓冲液洗涤树脂。第一步，在四摄氏度下旋转五分钟。在最后一步中，重复离心和洗涤步骤三次。

将树脂重悬于250微升洗涤缓冲液二中，并将树脂悬液转移至一个新的离心柱中。将管中残留的树脂用另外250微升洗涤缓冲液二重悬，并转移至同一柱子中，在4摄氏度下以2000转/分钟离心3分钟。将柱子转移至一个新的2毫升离心管中，并弃去穿流液。

立即进行以下洗脱步骤。向离心柱中加入150 µL预热的洗脱缓冲液。将溶液置于恒温混匀仪中，在55 °C下孵育5分钟，以1400 RPM振荡，然后在室温下以4,000 RPM离心1分钟，弃去柱子。

纯化的靶蛋白现已可用于进一步分析，并可在-20摄氏度以下保存。图像显示，与SDS洗脱相比，使用生物素从链霉亲和素宏量纯化树脂上洗脱蛋白并不完全。Western印迹信号强度的差异反映了两种洗脱方法所获得的蛋白产量不同。尽管SDS洗脱比生物素洗脱效率高得多，但会导致样品被释放的链霉亲和素污染。

该图像显示了来自链霉亲和素琼脂糖树脂的 SDS 洗脱液的银染凝胶结果。注意左泳道中存在释放的链霉亲和素，而右泳道中则无。左侧样品来自未交联的树脂，右侧样品来自使用 BS³ 交联的树脂。根据这些结果，我们得出结论：使用 BS³ 进行交联可防止在 SDS 洗脱过程中链霉亲和素从树脂中释放。

在此示例中，我们使用与 BS³ 交联的链霉亲和素磁珠预装柱树脂来纯化诱饵蛋白 VPG PRO 及其结合伴侣。将部分纯化后的样品用于质谱分析以鉴定蛋白质。阴性对照中无特异性条带出现，证实了该下拉实验的特异性。

下方条带对应诱饵蛋白 VPG PRO，上方条带对应其结合伴侣 NIB，后者通过质谱鉴定确认。您好，我们刚刚向您展示了如何利用化学交联来克服与 Strep-Tactin 树脂中 Dena 和 illusion 相关的局限性。除了可用于纯化蛋白质-蛋白质复合物外，该方法还可用于纯化含有核酸的蛋白质复合物，包括那些经甲醛逆转交联的复合物。

最后，该方法可用于纯化链霉亲和素标签的膜蛋白。需使用去垢剂进行溶解。去垢剂可使这些疏水性蛋白保持在溶液中。

然而，它们的存在可能导致样品被释放的链霉亲和素污染。即使使用温和的生物素洗脱，我们认为树脂的交联可为样品污染问题提供一种解决方案。感谢观看，祝您的实验顺利。好的。