Name: 对链球菌-Tactin树脂交联的双（磺基）辛二酸酯（BS3）双链球菌标记蛋白及其复合物的一步纯化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 27 s
Description: 了解使用BS3交联Strep-Tactin树脂一步纯化双Strep标记蛋白及其复合物的方法。该技术可实现高纯度回收，适用于质谱分析病毒核糖核蛋白复合物。

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我们衷心感谢 Sini Miettinen、Minna Pöllänen 和 Taru Rautavesi 提供的技术支持。感谢 Helka Nurkkala 提供表达双Strep标签GFP的HEK 293细胞，以及 Pekka Evijärvi 提供录音设备。本工作由芬兰科学院资助，资助编号为 138329、134684 和 258978。

1. 使用双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯（BS3）交联Strep-Tactan聚甲基丙烯酸酯树脂
<ol>
	<li>将一支密封的微量离心管（内含 2 mg BS3 交联剂）平衡至室温。注意：BS3 为危险物质，操作时需佩戴防护手套和护目镜。</li>
	<li>通过短暂剧烈振荡重悬 Strep-Tactin 聚甲基丙烯酸酯树脂（100 mM Tris-HCl，pH 8.0；1 mM EDTA；150 mM NaCl 中的 50% 悬浮液），然后使用切去尖端的移液器吸头立即将 600 µl 悬浮液转移至离心柱中。</li>
	<li>在室温下以 1,500 × g 离心 30 秒，弃去穿流液，并向柱中加入 450 µl 磷酸盐缓冲盐水（PBS）。</li>
	<li>重复上一步骤 2 次，以完全用 PBS 替代 Tris 缓冲液，最后一次离心后使树脂悬浮于 430 µl pH 8.0 的 PBS 中。</li>
	<li>用含有 100 µl 超纯水的移液器吸头刺穿装有 BS3 的微量离心管铝箔封口，通过轻柔吹打使 BS3 粉末溶解于水中，立即取 20 µl 该溶液加入离心柱中。交联反应中 BS3 的终浓度约为 1.2 mM。</li>
	<li>在室温下旋转孵育柱子 30 分钟，检查树脂是否与 BS3 溶液充分混合。</li>
	<li>为终止反应，加入 6 µl 3 M Tris-HCl（pH 7.5），并在室温下继续旋转孵育 15 分钟。</li>
	<li>在室温下以 1,500 × g 离心 30 秒，弃去穿流液，用 450 µl 含 Tween 20 的 Tris 缓冲盐水（TBST）重悬交联后的树脂。重复离心和洗涤步骤 2 次。最后一步中，用 450 µl TBS 重悬树脂。</li>
	<li>使用切去尖端的移液器吸头将树脂悬浮液转移至新的离心管中。用另外 450 µl TBS 重悬残留在柱中的树脂，并转移至同一管中。重复此步骤一次，以确保将树脂从柱中最大程度转移至管中。</li>
	<li>将管子在室温下静置 10 分钟，通过去除过量 TBS 将体积调整至 600 µl。该树脂可立即使用（推荐），或在 4 °C 下保存，避免冷冻。</li>
</ol>
2. 双Strep标签诱饵蛋白及其相关复合物与交联Strep-Tactin聚甲基丙烯酸酯树脂的结合
<ol>
	<li>在 4 °C 条件下，以 17,000 × g 离心 1 ml 结合缓冲液中的诱饵蛋白样品 10 分钟，然后将上清液转移至新的离心管中。</li>
	<li>为最大限度减少内源性生物素化蛋白与 Strep-Tactin 树脂的结合，加入亲和素（avidin），使其终浓度达到 100 µg/ml，并在 4 °C 下旋转孵育 15 分钟。
	<ol>
		<li>若步骤 1.10 中的交联树脂在 4 °C 下长期储存，需在 4 °C 下以 400 × g 离心 1 分钟收集树脂，弃去上清液，并用 1 ml TBST 洗涤树脂。重复离心和洗涤步骤两次，第一次使用 TBST，第二次使用 TBS。在 4 °C 下以 400 × g 离心 1 分钟后，通过去除过量 TBS 将树脂调整至原始体积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过涡旋重悬交联的 Strep-Tactin 树脂。立即使用剪口移液枪头将 50 µl 树脂悬液加入含有诱饵蛋白样品的离心管中，并在 4 °C 下旋转孵育 30 分钟。</li>
	<li>等待期间，将恒温混匀仪设定至 55 °C，并预热 500 µl 洗脱缓冲液，用于后续步骤 3.1。</li>
	<li>在 4 °C 下以 400 × g 离心 1 分钟。弃去上清液，用 1 ml 预冷的洗涤缓冲液 #1 在旋转器上 4 °C 洗涤树脂 5 分钟。重复离心和洗涤步骤三次。最后一次步骤中，将树脂重悬于 250 µl 洗涤缓冲液 #2 中。</li>
	<li>将树脂悬液转移至新的离心柱中。将离心管中残留的树脂用另外 250 µl 洗涤缓冲液 #2 重悬，并转移至同一离心柱中。</li>
	<li>在 4 °C 下以 400 × g 离心 3 分钟，弃去穿流液，并将离心柱转移至新的 2 ml “海豚鼻”离心管中。立即进行下述洗脱步骤。</li>
</ol>
3. 特异性蛋白质复合物的洗脱
<ol>
	<li>向离心柱中加入150 µl 来自步骤2.4的预热洗脱缓冲液。</li>
	<li>在55 °C下于恒温混匀仪中孵育5分钟，转速为1,400 rpm。</li>
	<li>在室温下以1,500 × g离心1分钟。</li>
	<li>弃去离心柱，将纯化的目标蛋白储存于≤ -20 °C。</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="598">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;">磷酸盐缓冲液（PBS）</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:299px;">10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:299px;">2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">NaCl</td>
			<td style="width:299px;">137 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">KCl</td>
			<td style="width:299px;">2.7 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;">pH 调至 7.4，除非另有说明（第 1.4 节中为 pH 8.0）</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;">Tris 缓冲盐水（TBS）</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Tris-HCl，pH 7.4</td>
			<td style="width:299px;">50 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">NaCl</td>
			<td style="width:299px;">150 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;">含 Tween 20 的 Tris 缓冲盐水（TBST）</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Tris-HCl，pH 7.4</td>
			<td style="width:299px;">50 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">NaCl</td>
			<td style="width:299px;">150 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Tween 20</td>
			<td style="width:299px;">0.1% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;">结合缓冲液</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Tris-HCl，pH 8.0</td>
			<td style="width:299px;">25 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">NaCl</td>
			<td style="width:299px;">550 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">NaF</td>
			<td style="width:299px;">5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">EDTA</td>
			<td style="width:299px;">0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">甘油</td>
			<td style="width:299px;">10% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">PMSF</td>
			<td style="width:299px;">0.1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;">洗涤缓冲液 #1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Tris-HCl，pH 8.0</td>
			<td style="width:299px;">25 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">NaCl</td>
			<td style="width:299px;">500 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">NaF</td>
			<td style="width:299px;">5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">EDTA</td>
			<td style="width:299px;">0.4 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Igepal CA-630</td>
			<td style="width:299px;">0.2% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">甘油</td>
			<td style="width:299px;">5% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">PMSF</td>
			<td style="width:299px;">0.1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;">洗涤缓冲液 #2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Tris-HCl，pH 8.0</td>
			<td style="width:299px;">25 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">NaCl</td>
			<td style="width:299px;">150 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;">洗脱缓冲液</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Tris-HCl，pH 8.0</td>
			<td style="width:299px;">25 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:299px;">SDS</td>
			<td style="width:299px;">1% (w/v)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 本研究中使用的缓冲液。

<ol><li>Voss, S., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+of+a+flexible+loop+in+streptavidin+leads+to+higher+affinity+for+the+Strep-tag+II+peptide+and+improved+performance+in+recombinant+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification.</a> Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).</li>
<li>Schmidt, T. G., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Strep-tag+system+for+one-step+purification+and+high-affinity+detection+or+capturing+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins.</a> Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).</li>
<li>Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+Strep-tag+purification+for+the+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells.</a> Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).</li>
<li>Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP70+and+its+cochaperone+CPIP+promote+potyvirus+infection+in+Nicotiana+benthamiana+by+regulating+viral+coat+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions.</a> Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).</li>
<li>Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+histone+modifications+in+plant+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of histone modifications in plant leaves.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li>
<li>Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+one-step+protein+purification+from+plant+material+using+the+eight-amino+acid+StrepII+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope.</a> Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).</li>
<li>Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+biochemical+characterization%2C+and+subcellular+localization+of+allantoate+amidohydrolases+from+Arabidopsis+and+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean.</a> Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).</li>
<li>Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contamination+from+an+affinity+column%3A+an+encounter+with+a+new+villain+in+the+world+of+membrane-protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).</li>
<li>Hendrickson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+core+streptavidin+determined+from+multiwavelength+anomalous+diffraction+of+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).</li>
<li>Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+surface+hydrophobic+stripe+in+the+coiled-coil+domain+of+type+I+keratins+mediates+tetramer+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability.</a> J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).</li>
<li>Singh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structure+of+human+von+Willebrand+factor+studied+using+small+angle+neutron+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering.</a> J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).</li>
<li>Weldon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+immunogenicity+of+stabilized+trimeric+soluble+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin.</a> PLoS One. 5 (9), (2010).</li>
<li>Wang, W., Barger, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+quaternary+structure+and+cysteine+residues+in+the+activity+of+human+serine+racemase%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochem%22%5BJournal%5D)">Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase.</a> BMC Biochem. 12, 63(2011).</li>
<li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+a+beautiful+friendship%3A+cross-linking%2Fmass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li>
<li>Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+cross-linking+and+target+elution+protocols+used+for+immunoprecipitation+significantly+modulate+signal-to+noise+ratio+in+downstream+2D-PAGE+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis.</a> Proteome Sci. 9, 45(2011).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

上述方案可用于在不含生物素或强变性剂的任何合适缓冲液中纯化任意感兴趣的双Strep标签诱饵蛋白及其相关复合物。在本方案的当前版本中，结合与洗涤步骤是在高盐和非离子型去污剂存在的相对严格条件下进行的。尽管这能够减少背景干扰，但脆弱的蛋白质复合物可能在这些条件下发生解离。为了保留此类低亲和力复合物，可降低结合缓冲液和洗涤缓冲液中的盐浓度，并减少或省略其中的非离子型去污剂。
双Strep标签系统的主要优势在于，这种小分子（3 kDa）串联标签与改造后的链霉亲和素（Strep-Tactin）具有高亲和力1,2，即使在批次模式下也能实现目标蛋白及其复合物的高效一步纯化。由于双Strep标签与Strep-Tactin结合牢固，树脂可在中等严格条件下进行洗涤，例如使用高浓度去污剂和/或高盐浓度，从而获得更高纯度的目标蛋白。然而，这种强结合也存在缺点。即使对于仅带有一个Strep-tag II（氨基酸序列WSHPQFEK）的蛋白，从树脂上的竞争性洗脱有时也可能困难。例如，使用10 mM 脱硫生物素（desthiobiotin）从St...

近年来，Strep-tag 技术已广泛应用于生物医学研究的多个领域，包括蛋白质组学和结构生物学。这种蛋白质纯化技术依赖于将重组蛋白与短的 Strep-tag 肽段融合，随着携带有 Strep-Tactin 的亲和基质的出现，该技术日趋成熟。Strep-Tactin 是链霉亲和素（streptavidin）的一种基因工程改造变体，具有更强的肽段结合能力1,2。含有两个 Strep-tag II 拷贝的融合蛋白（称为 twin-Strep-tag 或 SIII-tag）对 Strep-Tactin 基质的亲和力高于仅含单个 Strep-tag 的蛋白，从而可更高效地纯化重组蛋白及其结合伙伴。然而，twin-Strep-tag 蛋白与 Strep-Tactin 之间的高亲和力也存在缺点：使用过量生物素进行竞争性洗脱可能不完全，导致目标蛋白得率降低。另一种更有效的替代方法是使用 SDS 洗脱，但这会导致树脂中释放出 Strep-Tactin，造成样品污染，因而无法用于蛋白质组学分析。本文介绍一种克服该局限性的技术：首先通过化学交联稳定树脂偶联的 Strep-Tactin 四聚体，然后利用 SDS 从交联后的树脂中洗脱 twin-Strep-tag 蛋白及其相关复合物。由此可在不造成 Strep-Tactin 污染的前提下获得足够的蛋白得率，从而允许后续进行质谱分析。
该方法适用于纯化任何具有表面暴露SIII标签3或双Strep标签（氨基酸序列分别为WSHPQFEK(GGGS)3 WSHPQFEK和SAWSHPQFEK(GGGS)2 GGSAWSHPQFEK）的重组融合蛋白。目标蛋白可来源于动物、植物或细菌，并可从全细胞裂解液或富集的细胞器组分中分离。作为示例，本文描述了从感染马铃薯A病毒（PVA）的本氏烟（Nicotiana benthamiana）植物的核组分中纯化SIII标签蛋白VPg-Pro的过程4。核组分的制备方法如前所述5，但进行了以下修改：不使用甲醛处理细胞，所有缓冲液中的丁酸钠被5 mM氟化钠替代，完全蛋白酶抑制剂被PMSF替代，提取缓冲液#2中的Triton X-100浓度降低至0.3%（v/v），并通过蔗糖垫（提取缓冲液#3）离心获得的细胞核沉淀重悬于1.45 ml预冷的结合缓冲液中，在4 °C下旋转孵育1.5小时。所得的核提取物含有SIII标签的诱饵蛋白及其相关复合物（即诱饵蛋白样品），随后按照下述方案进行处理（见第2节）。

<table><tbody><tr><td>双磺基琥珀酰亚胺基辛二酸酯（BS3），无需称重格式，8 × 2 mg</td><td>Pierce/Thermo Scientific</td><td>21585</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com">www.fishersci.com 警告：有害物质。可引起严重的呼吸道、皮肤和眼睛刺激。佩戴防护手套和眼部保护装置。&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Strep-Tactin MacroPrep 树脂（50% 悬浮液）</td><td>IBA</td><td>2-1505</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Spin-X 离心管滤器，醋酸纤维素膜，孔径 0.45 &amp;mu;m，非无菌</td><td>Costar (Corning)</td><td>8163</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>圆底管（Dolphin-nose tubes）</td><td>Costar (Corning)</td><td>3213</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>亲和素&amp;nbsp;</td><td>IBA</td><td>2-0204</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

一步纯化双strep-tag标记蛋白及其复合物的strep-tactin树脂交联方法：使用bs3（bis(sulfosuccinimidyl) suberate）交联树脂

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

利用携带工程化链霉亲和素（Strep-Tactin）的树脂进行Strep标签融合蛋白的亲和纯化，已成为在生理条件下分离蛋白复合物的常用方法。含有两个Strep-tag II拷贝的融合蛋白（称为双Strep标签或SIII标签）相较于仅含单个Strep标签的蛋白，对Strep-Tactin具有更高的亲和力，从而实现更高效的蛋白纯化。然而，这一优势被以下事实所抵消：使用生物素洗脱双Strep标签蛋白时可能不完全，导致蛋白回收率低。通过使用十二烷基硫酸钠（SDS）进行变性洗脱可显著提高回收率，但这会导致树脂中释放出Strep-Tactin污染样品，使该方法无法适用于后续的蛋白质组学分析。为克服这一局限，我们开发了一种方法：首先使用Bis(sulfosuccinimidyl) suberate（BS3）对树脂偶联的Strep-Tactin四聚体进行共价交联以实现稳定化，然后使用该交联树脂通过单步批量纯化方式纯化目标蛋白复合物。使用SDS高效洗脱可确保良好的蛋白回收率，同时由于无Strep-Tactin污染，可进一步通过质谱法进行下游蛋白分析。作为概念验证，本文描述了一种利用经BS3交联的Strep-Tactin聚甲基丙烯酸树脂从感染病毒的本氏烟（N. benthamiana）植物细胞核中纯化SIII标签病毒蛋白VPg-Pro的实验方案。该方案同样适用于纯化任何感兴趣的双Strep标签蛋白，并鉴定其生理状态下的结合伴侣蛋白。

纯化流程在图1中以示意图形式展示，同时展示了其他现有纯化方法所存在的问题。
<img alt="使用Strep-Tactin、SDS-PAGE和LC-MS/MS分析进行蛋白质纯化的流程图。" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/51536/51536fig1highres.jpg" width="650" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 纯化流程的示意图。该实验流程包括：利用BS3对树脂偶联的Strep-Tactin四聚体进行共价交联以稳定其结构，使带有双Strep标签的诱饵蛋白及其相关复合物结合到交联后的树脂上，洗去未结合的蛋白质，用1% SDS进行变性洗脱，特异性结合的蛋白复合物随后通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析。诱饵蛋白中的两个红色球体代表双Strep标签。右侧插图框中列出了...

本文描述了一种高效纯化双Strep标签融合蛋白及其特异性复合物的方法，该方法采用经Bis(sulfosuccinimidyl) suberate（BS3）共价交联修饰的链霉亲和素（Strep-Tactin）树脂。该方法具有速度快、目标蛋白回收率高和纯度高等优点，并可兼容后续的质谱分析。

一步纯化双Strep-tag标记蛋白及其复合物的Strep-Tactin树脂交联方法：使用BS3（Bis(sulfosuccinimidyl) suberate）交联树脂

在带有工程化链霉亲和素（Strep-Tactan）的树脂上对Strep标签融合蛋白进行亲和纯化，已成为一种广泛应用的方法，用于……

您好，我是来自芬兰赫尔辛基大学的 Christina McKennan。在表征特定蛋白质复合物时，其中一个挑战是确定其分子组成。这需要开发从细胞环境中分离和纯化该复合物的方法。微生物研究领域涉及植物病毒与宿主的相互作用，因此我们关注感染过程中形成的多种病毒核蛋白复合物。过去，我们已成功利用亲和标签介导的纯化方法在实验室中研究了这些复合物。双链 strep 标签被证明是其中最有效的标签之一。然而，我们观察到该方法在使用中存在某些局限性，其中之一是产量较低，因此我们希望改进此方法。大家好，我叫Mata，我将带领您完成本实验方案。但在开始之前，让我先为您概述一下该方法的基本原理。我们采用链霉亲和素磁珠（strep tachin macro prep beads）来纯化双链霉亲和素标签蛋白与其生理结合伴侣之间的特异性复合物。图中绿色部分显示的是四聚体形式的链霉亲和素标签（strep strept tagged and tetramer），蓝色为双链霉亲和素标签蛋白，橙色为其结合伴侣，红色为两个链霉亲和素标签（strep tag）的拷贝。在标准方法中，未结合的蛋白质以优雅的形态被洗脱去除。结合的复合物则通过粉红色所示的生物素进行竞争性洗脱。然而，在使用该方法时，我们观察到结合复合物的洗脱不完全，仅有部分复合物成功从链霉亲和素珠上解离。这会导致目标蛋白回收率较低。为进一步分析带来困难，可通过使用含S-D-S-S-D-S的变性洗脱来提高目标蛋白的回收率。在变性的双链Strep-ttag诱饵蛋白周围会形成微球状细胞结构。其结合伴侣以及解离的链霉亲和素单体。如果样品需要进一步通过质谱分析，则释放出的链霉亲和素造成的样品污染是不可接受的。为解决样品污染问题，我们开发了一种方法，即首先通过化学交联稳定链霉亲和素四聚体。所得交联树脂用于纯化诱饵蛋白及其结合伴侣，使用 SDS 进行样品洗脱可确保高蛋白回收率，同时树脂的化学交联可确保在没有链霉亲和素标签蛋白释放导致的样品污染的情况下洗脱出带链霉亲和素标签的诱饵蛋白及其结合伴侣。将一支密封的微量离心管（内含 2 毫克 BS3 交联剂）平衡至室温。通过切掉枪头末端来准备用于树脂转移的枪头，重新悬浮Strep Tact和Macro Prep树脂，短暂剧烈振荡后立即转移600 µL悬浮液至CoStar SpinX过滤柱中，在4,000 ×g下离心30秒。在室温下加入450 µL磷酸盐缓冲液（PBS）。此步骤的目的是用非反应性的磷酸盐替代伯胺三羟甲基氨基甲烷（Tris）。弃去流穿液。通过反复倒置离心管数次来混匀管内物质。重复离心和洗涤步骤两次，最后将树脂悬浮于430 µL的PBS-pH 8中。最后一次离心后，用含有100微升超纯水的移液枪头刺穿无菌微量离心管的封口箔，通过轻轻吹打使BS三号粉末溶于水中。一旦BS三号完全溶解，立即取20微升该溶液加入Spin X柱中。确保充分混匀柱内溶液。将层析柱在室温下旋转孵育30分钟，确保树脂与BS三溶液充分混匀。为终止反应，加入6微升用盐酸调节至pH 7.5的3摩尔Tris溶液。再将层析柱在室温下旋转孵育15分钟，随后以4,000 RPM离心30秒。室温下，将交联树脂重悬于 450 微升含 Tween 20 的 Tris 缓冲盐水中，弃去穿流液。重复离心和洗涤步骤两次。最后一步中，将树脂重悬于 450 微升 TBS 中。将树脂悬液转移至新管，用另取的 450 微升 TBS 重悬柱中残留的树脂，并转移至同一管中。重复上一步骤一次，以确保树脂从柱子到管中的转移达到最大程度。将含有树脂悬液的管子在室温下静置10分钟，并调整体积至600微升。通过去除多余的TBS，树脂即可立即使用，或可在4摄氏度下保存而不冻结。该方法适用于纯化任何带有双链霉素标签（twin strep tag）的融合蛋白及其相关复合物。该蛋白可来源于动物、植物或细菌，并可从全细胞裂解液或富集的细胞器组分中分离。在此示例中，我们从感染病毒的植物核组分中分离马铃薯A病毒的双链霉素标签蛋白VPG Pro：首先将1毫升诱饵蛋白样品在结合缓冲液中，于4°C、13,000 RPM离心10分钟。将上清液转移至新的离心管中，以尽量减少内源性生物素化蛋白与链霉亲和素标签及树脂的结合。加入avidin，使其终浓度为100微克/毫升，并确保充分混匀。在4摄氏度下旋转孵育15分钟。通过涡旋振荡重悬交联树脂，并立即使用杯状移液吸头将50 µL树脂悬液加入含有诱饵蛋白样品的离心管中。在4 °C下继续旋转孵育30分钟。将温控混匀仪设置为55 °C，并预热500 µL洗脱缓冲液，用于后续洗脱步骤；然后在4 °C下以2000 RPM离心1分钟。弃去上清液，用一毫升预冷的洗涤缓冲液洗涤树脂。第一步，在四摄氏度下旋转五分钟。在最后一步中，重复离心和洗涤步骤三次。将树脂重悬于250微升洗涤缓冲液二中，并将树脂悬液转移至一个新的离心柱中。将管中残留的树脂用另外250微升洗涤缓冲液二重悬，并转移至同一柱子中，在4摄氏度下以2000转/分钟离心3分钟。将柱子转移至一个新的2毫升离心管中，并弃去穿流液。立即进行以下洗脱步骤。向离心柱中加入150 µL预热的洗脱缓冲液。将溶液置于恒温混匀仪中，在55 °C下孵育5分钟，以1400 RPM振荡，然后在室温下以4,000 RPM离心1分钟，弃去柱子。纯化的靶蛋白现已可用于进一步分析，并可在-20摄氏度以下保存。图像显示，与SDS洗脱相比，使用生物素从链霉亲和素宏量纯化树脂上洗脱蛋白并不完全。Western印迹信号强度的差异反映了两种洗脱方法所获得的蛋白产量不同。尽管SDS洗脱比生物素洗脱效率高得多，但会导致样品被释放的链霉亲和素污染。该图像显示了来自链霉亲和素琼脂糖树脂的 SDS 洗脱液的银染凝胶结果。注意左泳道中存在释放的链霉亲和素，而右泳道中则无。左侧样品来自未交联的树脂，右侧样品来自使用 BS³ 交联的树脂。根据这些结果，我们得出结论：使用 BS³ 进行交联可防止在 SDS 洗脱过程中链霉亲和素从树脂中释放。在此示例中，我们使用与 BS³ 交联的链霉亲和素磁珠预装柱树脂来纯化诱饵蛋白 VPG PRO 及其结合伴侣。将部分纯化后的样品用于质谱分析以鉴定蛋白质。阴性对照中无特异性条带出现，证实了该下拉实验的特异性。下方条带对应诱饵蛋白 VPG PRO，上方条带对应其结合伴侣 NIB，后者通过质谱鉴定确认。您好，我们刚刚向您展示了如何利用化学交联来克服与 Strep-Tactin 树脂中 Dena 和 illusion 相关的局限性。除了可用于纯化蛋白质-蛋白质复合物外，该方法还可用于纯化含有核酸的蛋白质复合物，包括那些经甲醛逆转交联的复合物。最后，该方法可用于纯化链霉亲和素标签的膜蛋白。需使用去垢剂进行溶解。去垢剂可使这些疏水性蛋白保持在溶液中。然而，它们的存在可能导致样品被释放的链霉亲和素污染。即使使用温和的生物素洗脱，我们认为树脂的交联可为样品污染问题提供一种解决方案。感谢观看，祝您的实验顺利。好的。

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