Name: 体外聚集测定使用tau蛋白的蛋白质 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 学习使用体外聚集测定法研究tau蛋白的聚集动力学，通过硫黄素荧光监测未修饰和过度磷酸化tau蛋白的纤维化过程。该方法为阿尔茨海默病研究提供了重要的实验基础。

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本工作由美国国家衰老研究所（AG039768）资助 MHK。我们感谢 Thomas Sharkey 博士和 Honggao Yan 博士慷慨提供仪器，同时感谢 Sean Weise 和 Yan Wu 提供的技术支持。

1. 试剂的准备
<ol>
	<li>配制聚集缓冲液（20 mM Tris，pH 7.4，100 mM NaCl，1 mM EDTA）。室温保存，可稳定数月。使用前补充 1 mM 二硫苏糖醇（DTT）。 
	注意：基于 HEPES 的缓冲液（10 mM HEPES，pH 7.5，0.1 mM EDTA，5 mM DTT）在 tau 蛋白聚集实验中也可获得类似结果。</li>
	<li>配制硫黄素 T 或硫黄素 S 储存液（3 mM，溶于聚集缓冲液中），使用 0.22 μm 无菌滤器过滤。置于铝箔包裹的离心管中，–20 °C 保存，可稳定数月。</li>
	<li>配制肝素储存液（300 μM，溶于聚集缓冲液中）。–20 °C 保存，可稳定数月。</li>
	<li>配制二硫苏糖醇（DTT）储存液（1 M，溶于水中）。分装至 1.5 ml 离心管中，–20 °C 保存。在进行聚集实验前，将 1 M 溶液于室温解冻。从此 1,000 倍浓缩储存液中，用去离子水稀释配制 100 mM 工作液，并置于冰上待用。</li>
	<li>从 –80 °C 冰箱中取出 tau 蛋白样品，在冰上解冻。用聚集缓冲液将 tau 蛋白调整至预定浓度。在 4 °C 条件下，以 20,800 × g 离心 10 分钟，去除预先形成的大型聚集体。此预离心步骤可提高后续每批蛋白样品荧光检测结果的一致性。将上清液转移至另一离心管中，置于冰上待用，准备进行聚集反应体系的组装。</li>
</ol>
2. 无染料末端检测法
注意：本实验的聚集反应在不含荧光染料的条件下进行。混合所有组分后，让反应进行至预设的时间点。然后从聚集反应体系中取出等分试样，与硫磺素T（ThT）或硫磺ine S（ThS）混合，以实现淀粉样蛋白结合，随后进行荧光检测。初始聚集反应体系的体积取决于所需时间点的数量。该方法可能需要较大量的tau蛋白，但操作快速、直接，可在荧光光度计或多功能酶标仪中完成（参见讨论部分）。以下是以ISA SPEX FluoroMax-2紧凑型荧光光谱仪进行荧光定量的逐步操作步骤。
<ol>
	<li>在1.5 ml离心管中按照表1配制聚集反应混合液。每列代表一个100 μl反应体系所需的组分，足以进行一次时间点的检测。根据具体实验所需的时间点数量调整总体积。为避免移液误差，每种组分额外增加10%。此处所示含肝素的典型反应体系可用花生四烯酸或聚集缓冲液替代。向反应体系中加入DTT至终浓度为1 mM。若整个反应持续超过一天，需每天补充新鲜DTT（终浓度1 mM），以维持还原性环境。</li>
	<li>轻轻颠倒混匀数次。将每个反应体系置于37 °C培养箱或水浴中。Tau蛋白聚集过程无需振荡。</li>
	<li>在测量荧光前，先开启荧光分光光度计（先开光源，再开计算机）。 
	注意：氙弧灯可立即使用，但为获得最佳结果，建议仪器预热约10分钟后再进行荧光读数。</li>
	<li>启动计算机上的软件。
	<ol>
		<li>在仪器控制中心中选择实时显示模式，设置激发波长为450 nm（狭缝宽度2 nm），发射波长为510 nm（狭缝宽度5 nm）。关闭实时显示窗口，返回仪器控制中心。</li>
		<li>选择恒定波长分析，在上方框架中点击Add>>按钮添加波长设置。将标准误差设为1，最大尝试次数设为3，然后点击添加。点击开始！以打开数据展示窗口。</li>
		<li>在数据展示窗口中，点击开始采集以打开新建样品对话框。将样品类型设为“未知”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向每100 μl聚集反应混合液中加入98 µl聚集缓冲液和2 µl 3 mM硫黄素T。反复吹打混匀。</li>
	<li>将全部混合液转移至比色皿（FCA3，外径尺寸 w × l × h = 12.5 mm × 12.5 mm × 45 mm）。将比色皿放入样品室的样品架中，并盖上盖子。点击运行以采集荧光数据。记录数据。</li>
	<li>取出比色皿，倾倒出溶液。用蒸馏水冲洗比色皿3次。通过向比色皿内外吹入空气将其干燥。</li>
</ol>
3. 在 SpectraMax M2 酶标仪上进行含染料的连续模式检测
注意：本实验与之前的方法不同之处在于，聚集反应中包含了荧光染料 ThT 或 ThS。这使得可以对同一组反应进行连续监测。由于反应体系需重复使用，因此该方法更适合使用自动化的多孔板读板仪（如下方所示的 SpectraMax M2 操作）。常规荧光计也可使用，但由于操作为手动，对快速聚集反应的检测频率在一定程度上受限。
<ol>
	<li>按照表2在96孔板（96孔黑色实底板，每孔体积360 μl，平底）中配制聚集反应混合液。每列对应一个200 μl反应体系所需的试剂，足以完成一次时间点的检测。通过反复移液充分混匀。在实验期间每天补充新鲜的1 mM DTT。</li>
	<li>将96孔板置于37 °C孵育。</li>
	<li>每次荧光检测前，打开多功能酶标仪和计算机，预留约10分钟使仪器充分稳定。</li>
	<li>启动计算机上的软件，设置温度为37 °C，选择荧光强度（FI-Top Read）模式，激发波长设为450 nm，发射波长设为510 nm。</li>
	<li>将96孔板插入仪器抽屉中，按下READ键开始检测。</li>
	<li>检测完成后取出孔板，放回37 °C培养箱继续孵育。将数据复制并粘贴至Excel表格中，用于数据分析和作图。</li>
</ol>
4. 使用染料在小型荧光分光光度计上进行连续模式检测
<ol>
	<li>按照表3在1.5 ml离心管中配制聚集反应混合液。每一列代表一个200 μl反应所需的组分，足以进行一次时间点的测定。</li>
	<li>轻轻颠倒离心管数次以混匀。</li>
	<li>打开荧光分光光度计，并按照步骤2.3和2.4设置软件。</li>
	<li>将全部混合液转移至比色皿中。将比色皿放入样品室的样品架上，并盖上盖子。点击运行以采集荧光数据。记录数据。</li>
	<li>通过点击运行并记录数据，在适当的时间间隔持续读数。若需高频监测聚集过程（例如，每30或60秒一次），应将反应液保留在比色皿和仪器中，直至测量完成，或有足够时间更换反应液或比色皿。</li>
	<li>取出比色皿并倾倒溶液。用蒸馏水冲洗比色皿3次。通过向比色皿内外吹入空气使其干燥。</li>
</ol>

我们无任何披露事项。

本方案展示了可检测磷酸化依赖性tau蛋白快速聚集动力学的不同实验条件和仪器。在终点实验中，于每个时间点从主反应体系中取出部分反应液，加入荧光染料ThT，随后检测淀粉样蛋白结合诱导的荧光信号26。第二种方法为含染料模式，即在ThT或ThS存在的条件下进行tau蛋白聚集反应，使该类反应适用于对tau蛋白聚集体生长的实时自动监测。上述每种方法均有其优缺点。
终末模式反应仅使用诱导tau蛋白聚集所需的组分进行。将反应液与硫黄素T（ThT）稀释并混合会显著减缓荧光增强的速率，实质上在进行荧光定量时停止了反应。因此，该方法也适用于手动操作。然而，由于加入ThT后反应实际上已终止，绘制聚集曲线可能需要大量tau蛋白。该方法的另一个潜在局限是频繁接触反应混合物可能引入微生物或蛋白水解污染，或导致蛋白质氧化。相比之下，含染料模式允许在ThT或硫黄素S（ThS）存在下生成淀粉样蛋白，聚集进程可被连续监测而无需干扰反应体系。这一特性在建立自动化检测平台时尤为有利。然而，不同染料可能产生特异性响应。事实上，ThT显著延缓tau和磷酸化tau（p-tau）的聚集，而ThS则影响甚微（比...

阿尔茨海默病（AD）是一类被称为tau蛋白病（tauopathies）的神经退行性疾病中的一种。tau蛋白病的核心病理特征是神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中出现的神经原纤维缠结（NFTs）1-4。NFT的密度与认知功能障碍3,5以及神经元丢失6密切相关。NFT主要由高度磷酸化的tau蛋白（以下简称“p-tau”）组成，这些蛋白形成直形或成对螺旋纤维（PHF）7,8。Tau蛋白是一种微管相关蛋白，被认为有助于轴突运输，这对神经元信号传导和物质运输至关重要9,10。在正常大脑中，每个tau分子含有2至3个磷酸基团，但在tau蛋白病患者中，其磷酸化水平可增加数倍11。多种激酶可能参与tau蛋白的过度磷酸化过程，包括GSK3β（糖原合成酶激酶3β）和CDK5（周期蛋白依赖性激酶5）12,13，但引发病理性磷酸化的直接诱因仍不明确14。发生在微管结合基序内或附近的异常磷酸化会导致tau蛋白从微管上解离15，并引起tau蛋白错误定位至胞体-树突区，在该区域p-tau聚集成直形或成对螺旋纤维，最终可聚合形成NFT包涵体。tau蛋白过度磷酸化、NFT形成与神经退行性变之间的紧密关联，促使人们普遍认为p-tau缠结会引发凋亡及其他细胞毒性反应，因而被认为是tau蛋白病导致神经退行性变的根本原因16,17。基于这一假说，已开展药物筛选和早期临床试验18。然而，该假说也面临挑战19,20。例如，SantaCruz 等研究表明，即使已有tau分子继续形成NFT，通过抑制突变人源tau的表达仍可改善转基因小鼠的认知功能21。在果蝇（Drosophila）模型中，NFT被发现能够隔离有毒的胞质tau，从而保护 underlying 神经元细胞22,23。显然，无论NFT是否具有致病作用，都将极大影响tau蛋白病治疗策略的发展方向。
在高浓度下，重组或正常脑源性tau蛋白会自发地但缓慢地聚合形成类似PHF的结构 体外，这通过多种β折叠结构偏好性荧光染料的结合、电子显微镜观察以及光散射光谱得以证实 24-27加入肝素或花生四烯酸（人脑中含量丰富的脂肪酸）可显著加速成对螺旋丝（PHF）的形成，且该过程具有tau蛋白亚型依赖性和诱导剂浓度依赖性。 28-32有趣的是，从阿尔茨海默病（AD）脑组织中纯化的过度磷酸化tau蛋白，或通过完全磷酸化制备的过度磷酸化tau蛋白 体外 磷酸化反应聚集更快且更高效 26,33-35这些结果与 p-tau 的病理作用高度一致。 体外 基于p-tau聚集的系统因此可作为阿尔茨海默病药物筛选的有力工具。
鉴于tau蛋白聚集与阿尔茨海默病（AD）的进行性神经退行性变密切相关，以及近期针对AD另一关键组织学标志物Aβ斑块的药物研发相继失败 36-38，针对调控tau蛋白聚集的药物研发兴趣日益增长。事实上，已有多个研究团队开始采用不同通量水平进行药物筛选，使用 体外 以tau蛋白聚集反应作为主要检测方法。多种化学物质被发现对tau蛋白的聚集具有抑制或逆转作用。 体外 39-42然而，目前所有tau蛋白聚集调节剂的筛选均使用未经修饰的tau蛋白，忽略了磷酸化这一关键病理标志，这引发了人们对这些化合物在阿尔茨海默病治疗中特异性和有效性的担忧。
开发用于生化表征和阿尔茨海默病（AD）药物筛选的聚集检测方法时，一个主要障碍是难以获得足量具有病理生理相关性的高磷酸化tau蛋白。我们利用“拉链辅助催化系统”（Zippers-Assisted Catalysis system），在大肠杆菌（E. coli）中将tau蛋白的1N4R亚型与GSK-3β激酶共同表达为亮氨酸拉链融合蛋白，成功克服了这一难题（Sui et al.，已投稿；最终产物中的tau和p-tau见图1；另见43中对p-tau的初步质谱表征结果）。在一组针对tau蛋白不同磷酸化位点的九种特异性抗体中，有八个位点检测到阳性信号（数据未显示）。下文将描述可区分未修饰tau蛋白与p-tau蛋白聚集动力学差异的实验方案及仪器操作方法。这些检测方法是在已发表的检测方案基础上改进而来，通过硫磺素T（ThT）或硫磺素S（ThS）与淀粉样蛋白（tau聚集体）结合后荧光信号的增强进行检测26。第一种为“终末法”、无染料检测模式：聚集反应在不含淀粉样染料的条件下组装并孵育；在不同时间点取出各反应体系的等分试样，与含ThT的缓冲液等体积混合，以终止聚集反应并使ThT结合tau聚集体，随后使用IAP FluoroMax-2荧光分光光度计测定荧光强度。第二种为“含染料”连续监测法：在聚集反应体系中直接加入ThT或ThS，整个实验过程中可手动或借助多孔板读数仪连续测定荧光信号。此外，我们还介绍了一种在连续检测模式下使用接近生理浓度的tau和p-tau进行聚集实验的方法，该条件下磷酸化的影响仍可被清晰检测到。下文将逐步说明各项操作流程，并展示这些检测方法的代表性结果。随后将讨论每种方法的优缺点及其在药物筛选中的潜在应用。
在高浓度下，tau蛋白会自发聚集形成类淀粉样结构。然而，在实验室中，通常使用肝素（平均分子量为6,000 g/mol）和花生四烯酸等诱导剂来加速tau蛋白的纤维化过程。本文所示示例包含30 µM肝素。tau蛋白淀粉样聚集的形成可通过硫黄素T（ThT）或硫黄素S（ThS）与淀粉样结构结合后产生的荧光进行监测。ThT在结合tau聚集物后，其荧光发生红移（激发波长：450 nm；发射峰值：485 nm）。而ThS在未结合淀粉样结构前，在450 nm激发下于510 nm处仅有微弱发射荧光，但在存在如聚集态tau蛋白等淀粉样蛋白时，其荧光强度显著增强44。这两种染料均可有效检测tau蛋白及磷酸化tau蛋白（p-tau）的聚集。由于ThT具有较强且相对较宽的发射峰（见图2），在510 nm处的荧光单位仅降低30%。为方便起见，无论使用哪种染料，我们均采用相同的激发/发射波长组合（即，450 nm/510 nm）来监测tau蛋白的聚集过程。
Tau 蛋白的聚集反应可在有或无染料的条件下进行，具体取决于实验目的和 Tau 蛋白的可获得性。以下展示了两种反应模式。此外，我们还演示了两种不同仪器的操作方法——单样品荧光光谱仪（ISA-SPEX FluoroMax-2）和多孔板读板仪（SpectraMax M2）。读者可根据自身具体需求和仪器条件对这些实验方案进行适当调整。

<table><tbody><tr><td>Trizma&amp;nbsp;base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MAL-7581-06</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Invitrogen</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>硫黄素 T</td><td>Sigma</td><td>T3516</td><td>避光保存</td></tr><tr><td>硫黄素 S</td><td>Sigma</td><td>T1892</td><td>避光保存</td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Corning</td><td>3917</td><td></td></tr><tr><td>ISA SPEX FluoroMax-2</td><td>Horiba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2 多功能微孔板读板仪</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 Tau 单克隆抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB3494</td><td>&amp;ndash;80 &amp;deg;C 保存</td></tr></tbody></table>

体外 使用过度磷酸化 tau 蛋白的聚集实验

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

阿尔茨海默病是一组被称为tau蛋白病（tauopathies）的神经退行性疾病中的一种，其特征是神经元内出现以神经原纤维缠结（NFTs）形式存在的过度磷酸化tau蛋白沉积。NFT的密度与认知功能障碍及其他神经退行性症状密切相关，因此推动了以tau蛋白聚集为靶点的治疗策略的研发。然而迄今为止，tau蛋白聚集检测通常使用不含病理相关磷酸化修饰的重组或合成tau蛋白。本文描述了两种以重组的过度磷酸化tau蛋白为研究对象的检测方法。这些方法可扩展用于高通量筛选能够调节过度磷酸化tau蛋白聚集体动力学或稳定性的化合物。利用过度磷酸化tau蛋白亚型，有望发现治疗阿尔茨海默病及其他tau蛋白病的新型治疗药物。

利用重组的 tau 蛋白和磷酸化 tau 蛋白（p-tau）（图 1），我们建立了两种不同的实验方案，通过硫黄素 T（ThT）和硫黄素 S（ThS）在结合淀粉样蛋白聚集体（包括 tau 和 p-tau）时产生强烈荧光的特性，来比较 tau 与 p-tau 的聚集动力学（图 2）。无论在聚集反应中是否加入荧光染料，我们均观察到过度磷酸化显著促进 tau 蛋白的聚集（图 3–5）。这种促进作用与肝素无关（数据未显示）。在典型反应中，tau 和 p-tau 在反应开始后的前 30 分钟内迅速形成寡聚体，随后聚集速率显著减慢（图 3 和图 5），且在整个实验过程中，p-tau 始终表现出更高的荧光强度单位。在聚集反应中加入 ThT 会导致聚集速率明显减缓（图 4）。两种蛋白在反应启动约 160 小时后均接近平台期。而 ThS 则不会引起聚集过程的显著减慢（图 5）。
<p class="jove_content" fo:keep-tog...

未修饰和过度磷酸化的tau蛋白被用于两个实验 体外 通过聚集实验揭示依赖于过度磷酸化的快速聚集动力学。这些实验为未来筛选能够调节过度磷酸化tau蛋白形成纤维倾向的化合物奠定了基础，而此类纤维正是阿尔茨海默病进展的关键因素。

体外 使用过度磷酸化 Tau 蛋白的聚集实验

阿尔茨海默病是一类被称为tau蛋白病的神经退行性疾病中的一种，其特征是神经元中出现……的沉积

本实验的总体目标是监测并比较未修饰 tau 蛋白与高磷酸化 tau 蛋白的聚集动力学。首先，利用拉链辅助催化系统生成未修饰和高磷酸化的 tau 蛋白；第二步是建立适用于两种不同仪器中任意一种的聚集检测体系。通过两种不同的硫黄素染料——硫黄素S和硫黄素T的荧光来监测tau蛋白的聚集过程。最后一步是绘制并比较聚集曲线。最终，利用硫黄素荧光与聚集态TA物种结合后产生的动力学变化，展示tau蛋白纤维化在体外依赖于过度磷酸化的增强效应。您好，欢迎阅读我们的 JoVE 文章《使用高磷酸化 Tau 蛋白进行体外聚集实验》。我叫 Minko，本实验将由 way 进行操作与演示。本方案需要使用近一个月内配制的、相对新鲜的聚集缓冲液。使用前需加入DIO三乙醇至终浓度为1毫摩尔，并准备好经过滤的硫黄素T或S储备溶液。上述储备溶液均可保存于-20摄氏度，而目标蛋白则应保存于-80摄氏度。将毛巾置于冰上，然后根据需要使用聚集缓冲液调整其浓度以保持一致。将毛巾与聚集缓冲液在 4°C 下以 20,800 G 离心 10 分钟。随后将上清液转移至另一支离心管中，并置于冰上保存，直至进行聚集反应体系的配制。在1.5毫升微量离心管中配制聚集反应混合物。根据表格，每份反应物取100微升即可。根据反应数量计算总体积，并额外增加10%以弥补移液误差。如有需要，罐中的胡椒可用雷尼酸或聚集缓冲液替代。通过倒置混合反应体系，并将其转移至37摄氏度条件下，无需光照培养。每隔24小时，向反应体系中补充一毫摩尔的DTT，以维持还原环境，用于荧光检测。将光谱荧光仪预热约10分钟，以提高计算机软件中测量结果的一致性。在仪器控制中心中选择实时显示模式。将激发波长设为 450 纳米，狭缝宽度设为 2 纳米，发射波长设为 510 纳米，狭缝宽度设为 5 纳米。然后返回仪器控制中心，选择恒定波长分析。按下上方框架中的添加键，以添加一组波长。将标准误差的采集参数设置为1，最大试验次数设置为3，然后点击“添加”。接着点击“运行”以打开数据展示窗口。现在在数据展示窗口中，单击“开始”以打开新样品对话框，并选择“未知样品”作为样品类型。然后准备反应，每100 µL取一次测量值，加入98 µL聚集缓冲液和2 µL 3 mM硫黄素S（Thioflavin S）或T，用移液器反复吹打混合物数次，以确保充分混匀。将其中一种混合物的全部 200 微升转移至一个 FA 三联小瓶中，并将其加载到指定位置。然后点击运行以收集荧光数据。从比色皿中移除溶液后，用蒸馏水冲洗三次，并用气流干燥。该检测在阴离子反应中包含荧光染料，可实现连续测量，最好使用自动多孔板读板仪进行。常规的参数设置虽然同样有效，但受限于手动操作的速度。在96孔不透明黑色板中配制聚集反应混合液。每孔360微升，每次检测时间点取200微升即足够。用移液器充分混匀每个反应。将96孔板在3

in-vitro-aggregation-assays-using-hyperphosphorylated-tau-protein

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