体外聚集测定使用tau蛋白的蛋白质

该程序的总体目标是监测和比较未修饰和高磷酸化 tau 蛋白种类的聚集动力学。这是通过首先通过 zippers 辅助催化剂系统生成未修饰和高磷酸化的 tau 蛋白来实现的。第二步是将聚集分析设置为适用于两种不同仪器中的任何一种。

tau 聚集过程由两种不同硫代的荧光监测。黄素模具，黄素 S 和黄素 T.最后一步是绘制和比较聚集曲线。最终，硫代黄素荧光从结合到聚集的 TA 物种的动力学变化用于显示体外 tau 纤维化的高磷酸化依赖性增强。

您好，欢迎来到我们的 JOV 文章。使用高磷酸化 tau 蛋白的体外聚集测定。我叫 Minko，实验将以 byway 进行和演示。

对于此协议，上个月制作的相当新鲜的聚合缓冲区。在使用前，将 DIO 3 etol 添加到 1 毫摩尔中也需要过滤的 Theo Flavin 茶或 S 储备溶液。Hein 原液，均可储存在零下 20 摄氏度，毛巾蛋白储存在零下 80 摄氏度。

将毛巾拉到冰上，然后根据需要使用聚集缓冲液调整其浓度以保持一致性。用聚集缓冲液和 20， 800 G 的热量在 4 摄氏度下旋转毛巾 10 分钟。现在将旋替物转移到另一支管中，并将其保存在冰上，直到需要组装聚集反应。

在 1.5 毫升微量离心管中设置聚集混合物。根据该表，100 微升足够一份反应物。根据反应次数计算总体积，并将其增加 10% 以解决移液错误。

如果需要，可以用 raonic acid 或聚集缓冲液代替胡椒粉。通过倒置混合反应并将它们转移到 37 摄氏度，没有植被。每 24 小时后，用补充的 1 毫摩尔 DTT 补充反应物，以确保在还原环境中测量荧光。

将光谱荧光计预热约 10 分钟。这将提高计算机软件中测量的一致性。选择仪器控制中心中的实时显示模式。

将激发波长设置为 450 纳米，狭缝为 2 纳米，将发射波长设置为 510 纳米，狭缝为 5 纳米。然后返回仪器控制中心并选择恒定波长分析。按上部框架中的 add 键可添加一组波长。

将标准误差的采集参数设置为 1，将最大试验数设置为 3。然后单击 add.接下来，单击 go 打开数据显示窗口。

现在，在数据显示窗口中，单击 start act（开始作）以打开 New sample（新样品）对话框，然后选择 unknown（未知）作为 sample type（样品类型）。然后准备反应，以 98 的浓度测量每 100 微升一次。微升聚集缓冲液和两微升 3 毫摩尔黄素 S 或 T 移液混合物数次，以确保良好混合。

将所有 200 微升一种混合物转移到 FA 3 qve 中，并将其加载到位。然后舔运行收集荧光数据从兽医中取出溶液后，用蒸馏水冲洗 3 次，并在气流中干燥。该分析包括 aion 反应中的荧光染料，这允许连续测量，最好使用自动垫孔板读数仪进行。

常规的 for 参数也有效，但受手动作速度的限制。在 96 孔不透明黑色板中设置聚集混合物。对于 360 微升的一孔体积，200 微升足以进行每个时间点测量。

用移液将每个反应充分混合。在 37 摄氏度下孵育 96 孔板，每 24 小时补充一毫摩尔的 DTT，以确保每个时间点的还原环境。要进行测量，请至少提前 10 分钟在计算机软件中打开多功能酶标仪和计算机。

将温度设置为 37 摄氏度并选择荧光强度模式。然后将激发波长设置为 450 纳米，将发射波长设置为 5 纳米和 10 纳米。将 96 孔板插入抽吸器中，然后按读取键。

测量后，在分析数据之前立即将板放回培养箱中，可以使用紧凑型分光光度计进行连续模式测定。在 1.5 毫升微量离心管中设置聚集混合物。200 μL 反应足以测量一个时间点。

倒置试管以混合。在 37 摄氏度或室温下设置反应，并每 24 小时补充 1 毫摩尔的 DTT 进行测量。像无模具终端测定一样设置尿路仪和软件。

将整个混合物转移给兽医，将其放入样品室的样品架中，然后盖上盖子。单击运行以适当的时间间隔收集荧光数据。如果这个间隔很短，比如 30 或 60 秒，则可以在两次测量之间将 Q 兽医留在机器中，直到到达最后一个时间点。

完成后，将反应从 vete 放回其样品管中，并将试管放回培养箱中。按照前面的指示使用重组 tau 和 P tal 对 vete 进行精益。建立了两种不同的方案来比较 tau 和 p tal 聚集的动力学，利用黄素 t 和 s 在与淀粉样蛋白聚集体（包括 tau 和 p tal）结合时（有或没有荧光染料）时的强烈荧光发射。

在聚集反应中，高磷酸化持续增强 tau 聚集。通常，T 和 p tal liga 在显着减慢之前的前 30 分钟内迅速上升，包括黄素。聚集反应中的 T 导致聚集速率显着延迟。

Theof Flavian s 和 t 在反应 160 分钟后都接近平台期。另一方面，生物黄素 s 并没有导致聚集的明显减慢。按照此程序，可以使用该测定法进行额外的中枢神经系统对神经变性或其他易聚集蛋白的亚型或其他聚集蛋白，以了解蛋白质化在其发展后的发病机制中的贡献。

这种制备高磷酸盐顶部蛋白 PA 的技术方式用于该领域的研究，探索我们的治疗方法和药物开发。