利用光镊对单个RNA分子进行纳米操控

以下实验的总体目标是演示对一种RNA结构进行单分子力学解折叠实验。第一步，构建一个流动室并将其安装到仪器上。第二步，将微米级珠子与目标RNA样品混合，然后将两种不同尺寸的珠子加载到流动室中。

最后，可通过流动室和光镊操控微珠，使其相互接触，从而评估多种单分子相互作用。最终，这种纳米操控技术可用于研究RNA在二级和三级结构水平上的折叠过程。该方法有助于解答RNA折叠领域中的关键科学问题，例如RNA是如何折叠与去折叠的？

它如何响应环境变化而在不同构象之间转换？它又如何与其他分子相互作用？今天的实验将由我的研究生 Williams Stevenson 先生来完成。首先，在一个 1 号盖玻片上钻六个直径为 2 毫米的孔，以制作一个流动腔室。

然后使用激光雕刻机在两片双面聚酰亚胺胶带中各切割出三条宽度为2毫米的狭缝。将其中一片胶带粘附到盖玻片上，确保胶带上的孔与盖玻片上的孔对齐。将另一片胶带粘附到一个干净且未钻孔的盖玻片上。

取下两段胶带的保护层，然后将一根拉制的玻璃微量移液管和两根双向管放置在盖玻片其中一个通道的两侧。接着将两片盖玻片叠合，利用两层胶带固定微量移液管和旁路管。为制作流动室，将流动室安装在金属框架的背面，使室上的孔与流体通道对齐。

然后将框架翻转，通过聚乙烯管将通道连接至装有选定缓冲液的10毫升注射器。接着将整个腔室安装到双物镜之间的光镊装置上，确保腔室前端带有流体通道的一侧朝向右侧。随后后撤左侧物镜，将框架的黄铜插针插入光镊装置的安装孔中，并拧紧螺丝以固定腔室位置。

使用弹力绳将仪器从桌面上抬升。在将磁珠输送至流动池的反应位点前，需将仪器置于声学屏蔽箱内。首先，将一份经膝状处理的RNA样本与抗-D、经二氧乙二醇包被的磁珠（dig oxygen ENC包被磁珠）或dig磁珠混合，随后在室温下孵育15分钟。

孵育期间，将链霉亲和素包被的磁珠悬浮液吸入1毫升注射器中，并将注射器连接至通向流体腔底部通道的流体管路。推动注射器，将链霉亲和素磁珠加载至腔室中，然后使用电机控制软件将光镊移至底部旁路管口附近，并移动整个腔室。随后操作轨迹球，控制光镊捕获一个链霉亲和素磁珠。

使用电机控制软件将小球移至微移液管尖端附近。接着，拉动连接微移液管的注射器，将小球吸入微移液管内，然后轻轻推动注射器，向中间通道施加流体，冲走所有残留的链霉亲和素小球。将消化小球样品混合物送入腔室的上通道，并按照刚刚演示的方法捕获一个消化小球。

然后使用光镊将生物素标记的微球靠近链霉亲和素标记的微球。施加流体以清洗中间通道，进而捕获连接在一对微球之间的单个分子。

将捕获的dig珠垂直放置在strep珠上方。接着，操控光镊将dig珠向下移动靠近strep珠，同时在显示器上打开力-距离曲线窗口以实时观察力的变化。最后，接触后将dig珠垂直远离strep珠，记录两者分离过程中的受力变化。

一旦RNA分子通过其5'端和3'端被固定在微珠之间，便可反复进行拉伸和松弛。双链手柄的弹性表现为非线性的力-伸长曲线。手柄之间RNA结构的协同性折叠与去折叠在力-伸长曲线上表现为具有负斜率的突然破裂（rips）和回折（zips）；发夹结构的重新折叠则在力-伸长曲线上表现为一个回折（zip）。

重要的是，同一分子每次展开和重新折叠时可能对应不同的作用力。这种趋势在转变力的分布中表现得尤为明显。可以使用反馈机制来维持对RNA分子施加的恒定作用力。在被动模式下，光镊和微移液管的位置均固定不变，RNA发夹结构的折叠表现为分子延伸长度的缩短，而展开则表现为延伸长度的增加。

当RNA折叠成发夹结构并缩短其延伸长度时，被捕获的微珠会远离光镊中心，从而增加受力。当RNA被拉伸为单链时，微珠则向光镊中心移动，导致受力减小。利用该技术，可以观测并操控RNA的折叠路径。

利用皮牛顿力和纳米级分辨率，可大量获取单个分子的状态寿命和转变力，从而推导出RNA折叠的速率常数和自由能。在尝试该操作时，需牢记在捕获单个分子时要有耐心。在两个微珠之间找到单个分子连接的概率非常低。

因此，许多对微珠可能完全不会粘附在一起。