Name: 一种超越BRET步骤:通过荧光激发无限制自发光（FUEL） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 学习FUEL荧光激发无限制自发光技术，通过发光细菌与纳米颗粒相互作用产生红色光子。该方法可应用于长距离无吸收体条件下的生物发光研究，为荧光技术提供新范式。

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作者谨此感谢以下机构提供的经费支持：纽约巴斯德基金会（资助 J.D.、C.S.、C.S.）、欧盟第七框架计划“Automation”（资助 S.L.S.）、法国卡诺研究所项目11（资助 J.D.、A.H.、A.R.、R.T.、S.L.S.）以及 IMNOS 项目（资助 R.T.、S.L.S.）、Conny-Maeve 慈善基金会（资助 S.L.S.）、欧洲分子影像学硕士项目（资助 I.T.）、法兰西岛大区（Region Ile de France）的 MODEXA 项目（资助 S.L.S.）、SESAME 项目（资助 S.L.S.）和 DimMalInf 项目（资助 S.L.S.、R.T.），以及法国国家科研署（ANR）“未来投资计划”（Grandes Investissement de l'avenir）中的生物与健康国家基础设施项目：法国生命生物成像（France LifebioImaging，FLI）法国生命成像（资助 R.T.、S.L.S.）、France Bioimaging（资助 J.D.、S.L.S）和巴黎巴斯德研究所。此外，作者谨此感谢 José Bengoechea 和 Herbert Schweizer 提供的试剂。同时，作者谨此感谢 Cindy Fevre 制备了抗体。

1. 试剂
<ol>
	<li>购买或培养发光细菌及适当的培养基，例如改良的 大肠杆菌 表达的 luxABCDE21, 费氏弧菌 Photobacterium sp. 肺炎克雷伯菌22.</li>
	<li>根据标准配方配制生理盐水（0.9% NaCl）和培养基溶液。 大肠杆菌 和 K. pneumoniae 在37 °C下于Luria Bertani（LB）培养基中培养， V. fischeri 和 Photobacterium 在含有0.5 M NaCl的LB培养基中，于22 °C条件下振荡培养。</li>
	<li>购买或获取荧光探针，如Q-tracker 705（40 nm直径，简称QD705）、Q-tracker 800（40 nm直径，简称QD800）、荧光聚苯乙烯微球（40 nm直径）、非荧光聚苯乙烯微球（48 nm直径），以及常规荧光染料。</li>
	<li>准备细菌标记所需的必要试剂。</li>
	<li>确保使用能够检测多种发射波长和曝光时间下信号的全动物生物发光成像仪，例如 IVIS Spectrum。对于本文所述的大多数实验，具备生物发光检测功能的酶标仪即可满足需求。</li>
</ol>
2. FUEL 的基本概述
<ol>
	<li>从标准培养皿上的单个菌落开始，培养发光细菌的过夜培养物。此处使用了V. fischeri。</li>
	<li>实验当天，接种新鲜的二级培养物，并使其生长至OD600达到1-1.5。为了获得可比较的结果，最好使用处于相似生长状态的细菌，以确保其产生强烈的信号。通过保持OD600恒定可实现这一目标。</li>
	<li>取每种培养物100 μl，分别加入5 μl QD705或生理盐水（PS），然后加入895 μl PS至标准比色皿中。将装好的比色皿放入IVIS Spectrum仪器中，在相应的滤光片组合下进行检测。此处使用了710-730 nm的发射滤光片。</li>
</ol>
3. 不同距离下的燃料效率
<ol>
	<li>在两个减小体积（1 ml）的塑料比色皿中，分别加入50 μl的QD705或97.2 μl的非荧光48 nm聚苯乙烯微球，总体积为1 ml PS。这可确保两种颗粒的单位总体积内具有相似的固体表面积。</li>
	<li>通过用标准黑色胶带或其它能够阻挡光线的不透明材料包裹第三个比色皿，制备一个光源比色皿。仔细在比色皿相对的两侧制作两个相同的光学窗口。</li>
	<li>将先前装好的比色皿直接放置在光源比色皿的两侧。从新鲜传代培养物中取1 ml的V. fischeri或其他发光菌种（i.e. 发光性E. coli或Photobacterium sp），加入光源比色皿中，并用不透明材料（如黑色纸张）覆盖，以减少任何光污染。</li>
	<li>使用适当的发射滤光片（如Total Light和710-730 nm发射滤光片），分别以10、30和30秒的曝光时间观察这三个比色皿。</li>
	<li>将两个外部比色皿逐步等距地移至离中心比色皿更远的位置，然后再次观察。重复此过程，直至最终面对面（中心比色皿与减小体积比色皿之间）距离达到3 cm。在每一步中，均采集荧光图像（450-480 nm激发，710-730 nm发射），以验证QD705的位置。</li>
</ol>
4. 探究潜在的 FUEL 配对
<ol>
	<li>取两个减小体积的比色皿，分别加入1 ml的溶液，其中一个含有目标荧光染料或荧光纳米颗粒，另一个含有PS或含非荧光纳米颗粒的PS作为阴性对照。在本研究中，如表1所述，考察了多种潜在的市售FUEL荧光染料和荧光纳米颗粒。</li>
	<li>向第三个遮光比色皿中加入1 ml新鲜的V. fischeri或其他发光细菌，该比色皿两侧相对位置设有两个物理尺寸相同的光学窗口。用不透光材料（如黑色纸片）覆盖该比色皿。</li>
	<li>将两个减小体积的比色皿置于遮光比色皿两侧，保持较短但相等的距离，并在适当的滤光条件下进行观察。本实验中采用的距离为0.7 cm。对其他荧光染料重复上述操作。</li>
</ol>
5. 靶向 FUEL
<ol>
	<li>制备针对发光细菌的生物素化抗体。例如，此处使用针对发光细菌的特异性一抗。 K. pneumoniae (α-Kp) 使用含有 EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin 的溶液进行生物素标记。</li>
	<li>使用脱盐柱在1,500 × g离心力下离心2分钟，去除抗体中的过量试剂。</li>
	<li>使用标准Bradford法测定蛋白浓度，并通过HABA法测定抗体生物素化程度。</li>
	<li>获取 α-Kp-biot 生物素化抗体（Ab）批次的制备：将 100 μl（10 mM，溶于 1× PBS）与 40 μl 混合 α-Kp 抗体，最终取代度为每抗体 16 个生物素残基，最终蛋白浓度为 10 mg/ml-1.</li>
	<li>通过多次过夜重复培养，按照相应方案用前述抗体靶向处理洗涤后的细菌。
	<ol>
		<li>具体而言，清洗 K. pneumoniae 在1×PBS中重悬，并用1×PBS调整浊度至4（OD值）约 4 × 108 CFU/ml-1 OD-1).</li>
		<li>每个重复实验中，加入 100 μl PBS 并孵育， α-Kp 抗体（10 μl） α-Kp-biotB 或 10 μl PBS 作为对照）以及 100 μl 细胞，30 °C 孵育 90 分钟。用 1x PBS 洗涤细胞 3 次，重悬于 196 μl PBS 中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用QD705链霉亲和素偶联物标记细胞，并将细胞均分为两等份。</li>
	<li>将一种溶液洗涤三次，然后重悬于适当体积中。</li>
	<li>将100 μl洗涤后和未洗涤的溶液分别加入黑色96孔板的各个孔中。在总光、490-510 nm和710-730 nm滤光片下测定相应的发光信号。荧光染料浓度可通过450-480 nm激发光和710-730 nm发射光进行测定。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明存在竞争性财务利益。J.D.、S.B.、K.L.R. 和 S.L.S. 参与了欧洲专利 EP10290158.4 和世界知识产权组织专利申请 WO/2011/117847 的申请。

通过将发光细菌与荧光纳米颗粒或量子点（QDs）混合，即可简单实现FUEL的基本演示。这两种组分在物理上相互分离，且保持在任何有效RET距离之外。更具挑战性的是FUEL信号的优化，包括 体外 和 体内. 在……之下 体外 条件，无论是否存在光吸收剂，通常添加过量的荧光染料足以最大化FUEL反应。然而，在高浓度下，静态猝灭或碰撞猝灭等现象可能导致荧光信号减弱。通过分别独立地改变发光源和荧光染料的浓度进行系列稀释实验，有助于优化所需浓度。FUEL体系的建立与优化在 体内 浓度的控制要困难得多，需要根据具体情况逐一解决。创建一个能让荧光实体被发光光源光学接触的条件可能具有挑战性。因此，从两种组分的直接共注射开始，可以在最佳条件下提供有关FUEL成功与否的信息。
目前已有用于用荧光物质（如Alexa系列和量子点）标记细菌和真核细胞的标准方案。这类标记通常需要通过抗体对细胞表面进行功能化或活化，但可能引发非预期效应，例如细胞活力降低或代谢活性改变。为克服这一问题，关键在于确定所需抗体或活化剂的最佳用量，在最大限度实现荧光标记的同时将细胞干扰降至最低。量子点（QDs）具有宽激发光谱、窄而可调的发射光谱以及产生大斯托克斯位移的潜力，因此在应用中具备优势。然而，量子点可能存在细胞毒性，在某些情况下并不理想。
FUEL 是许多 BRET 实验中存在的现象13 适用于多种发光和荧光光源。迄今为止，FUEL 产生的光子一直被视为非特异性相互作用的产物，或是由于 BRET 实验设计不佳而导致的不利背景信号。只有通过本文所展示的这类实验，我们才得以识别出这一不受欢迎信号的实用价值。在所示实例中，发光细菌充当了一种弥散性激发源，能够引发多种荧光物质产生典型的荧光响应。此外，由于具有较大的工作距离，可以合理推断：尽管 FUEL 可在不发生 BRET 的情况下构建，但通常情况下，BRET 的观测离不开 FUEL 的贡献。重要的是，由于 FUEL 无需靶向要求，因此可用于填补 BRET 与传统整体动物成像技术之间的空间成像空白。

对生物体（如病毒1,2、细菌3或小型哺乳动物4）进行基因改造以诱导或组成性表达生物发光，已取得高度成功并被广泛验证5-7。生物发光是一种涉及天然存在试剂的in vivo化学发光反应，其优势在于无需外部光源即可产生光信号。因此，生物发光成像避免了荧光成像中常见的自发荧光和非特异性信号干扰8。 Consequently，生物发光具有显著的信噪比，因为任何检测到的信号均完全来源于预定的光源。尽管许多模型已利用来自Photorhabdus luminescens的lux操纵子（发射峰位于480至490 nm之间）用于in vitro和in vivo应用9，但其在小型哺乳动物中的应用存在困难，原因在于成像条件本身的特性：血红蛋白等广泛存在的光吸收物质以及组织和骨骼等散射介质对蓝光至黄光波长范围具有强烈影响3。近年来开发并应用了经过改造的萤火虫荧光素酶（发射峰在617 nm），该工具显著克服了光学吸收问题10，但仍受光散射效应的影响。
作为回应，已有多种尝试利用生物发光共振能量转移（BRET）将发射信号红移至650–900 nm的理想光学窗口，该区域具有最小化的吸收和散射。11-13作为一种增强信号检测的工具，BRET利用生物发光源作为供体，外加的荧光团作为受体，但其应用成功较为有限。作为该现象的开创性实例， &#34;自发光量子点&#34; （SIQDs）14 由修饰的组成 海肾（Renilla reniformis） 结合于外部聚赖氨酸层的荧光素酶 市售量子点（QDs）。在加入底物后，所产生的生物发光反应会诱导QDs发出荧光，从而大量产生红光光子。然而，这些SIQDs的应用范围有限 体内 生理相关事件的可视化。这种有限的适用性可能是由于难以将双探针与目标器官、细胞或基因进行连接，因为SIQDs无法通过基因编码，因此需要对聚合物外壳进行二次修饰。为了提高其适用性，最近已采用了一种替代性的SIQDs，其中荧光素酶直接结合在发光核心上。15基于SIQD概念，通过连接实现了更适用的BRET系统 Cypridina 荧光素酶与吲哚菁染料16，可在小鼠体内特异性靶向肿瘤，并产生显著的红移，波长从460 nm红移至675 nm。为了实现非辐射能量转移，生物发光共振能量转移（BRET）遵循与其荧光 counterpart 相同的主要约束条件：供体的发射光谱与受体的激发光谱之间必须具有强烈的光谱重叠，且两个分子部分之间的工作距离必须在福斯特半径范围内（根据供体-受体对的不同，福斯特半径为5-14 nm，有效最大距离为福斯特半径的两倍）17这种距离依赖性极大地限制了可利用BRET作为检测增强手段来观察的事件类型。
最近发现并演示了一种新方法，该方法在体外（in vitro）和体内（in vivo）条件下均有效。该方法基于BRET技术发展而来，称为发光未结合激发荧光（Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence, FUEL）18,19，同样要求发光组分与荧光组分之间具有较强的光谱重叠。然而，与BRET不同的是，FUEL是一种完全辐射性的过程，其中发光源发射的光子被光学可及的荧光团吸收，随后根据荧光团的量子产率发射出红移的光子。与BRET类似，该方法也可用于克服在存在光学吸收物质情况下的成像限制。由于衰减降低以及光学散射效应减少，所产生的红移可使检测到的信号总体增强并提高特异性。已有报道表明，FUEL可发生于表达lux操纵子的生物发光大肠杆菌（Escherichia coli）与量子点（QDs）之间18,19。尽管在实验上与SIQDs相似，但两者存在一个根本性差异：在FUEL中，发光源无需与荧光团物理结合，从而允许对发光探针进行基因编码。由于已成功检测到发光细菌与量子点之间的FUEL现象，该技术有望被应用于表浅组织（如皮肤）和深层组织（如肺、肝）的感染检测，例如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和肺炎克雷伯菌（Klebsiellia pneumoniae）感染。
自从报道其实验意义以来，FUEL 已发展出一个稳健的数学模型20，可用于预测可接受的发光和荧光配对，并且其应用范围已扩展至光物理特性（如量子产率）的鉴定。以下我们将介绍 FUEL 的一些基本技术。首先，我们展示该现象在短距离（µm）和长距离（cm）工作范围内均存在的证据，这从根本上将 FUEL 与 BRET 区分开来。其次，我们通过研究多种荧光染料和荧光纳米颗粒，进一步拓展了可能的 FUEL 配对组合。第三，通过比较靶向与非靶向的 FUEL 配对，探究 FUEL 的应用潜力。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt; 表达 &lt;em&gt;lux&lt;/em&gt;ABCDE操纵子&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>由 Jos 惠赠&amp;eacute; A. Bengoechea，经Herbert P. Schweizer许可</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;肺炎克雷伯菌&lt;/em&gt; 52145&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>52145 是一种血清型 K2 参考菌株</td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB)&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>标准培养基</td></tr><tr><td>Q-Tracker 705&amp;nbsp;</td><td>生命科学</td><td>Q21061MP</td><td></td></tr><tr><td>Q-Tracker 800</td><td>生命科学</td><td>Q21071MP</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555</td><td>生命科学</td><td>S21381</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 568</td><td>生命科学</td><td>S11226</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 633</td><td>生命科学</td><td>S21375</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 700</td><td>生命科学</td><td>S21383</td><td></td></tr><tr><td>非荧光微球</td><td>Polysciences, Inc</td><td>15913</td><td></td></tr><tr><td>粉红色微球</td><td>生命科学</td><td>F8887</td><td>40 nm 直径</td></tr><tr><td>黄色微球</td><td>生命科学</td><td>F8888</td><td>40 nm 直径</td></tr><tr><td>Ivis Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>赛默飞世尔科技 Pierce</td><td>21425</td><td></td></tr><tr><td>Zeba 脱盐柱，7K 分子量截留值</td><td>赛默飞世尔科技 Pierce</td><td>21425</td><td></td></tr><tr><td>HABA 检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技 Pierce</td><td>28005</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 法</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>500-0201</td><td></td></tr></tbody></table>

超越bret：基于未结合发光激发的荧光（fuel）

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL)

未结合发光激发荧光（FUEL）是一种辐射性激发-发射过程，可增强信号和对比度 体外 和 体内. FUEL 与生物发光共振能量转移（BRET）具有许多相同的底层原理，但在发光源与荧光实体之间可接受的工作距离方面存在显著差异。尽管 BRET 的有效作用距离通常被限制在福斯特半径的两倍以内（一般小于 14 nm），而 FUEL 在无光学吸收体的情况下，可在微米（µm）甚至厘米（cm）级距离上发生。本文通过回顾该现象背后的相关原理，进一步拓展了 FUEL 的理论基础与应用范围，并展示了其与多种荧光染料及荧光纳米颗粒的兼容性。此外，本文还探讨了抗体靶向 FUEL 的实用性。所展示的实例表明，FUEL 可用于 BRET 无法实现的应用场景，填补了 BRET 与传统整体动物成像之间的空间距离空白。

共振能量转移（RET）是一种发光供体与荧光受体之间的非辐射相互作用，其中激发态的供体可通过强烈的偶极-偶极相互作用将能量传递给受体，从而诱导受体产生荧光响应13。RET 已被报道使用荧光23、化学发光24和生物发光13作为供体，其主要条件包括：1. 供体发射光谱与受体激发光谱之间具有显著的光谱重叠；2. 两个分子之间的取向适当；3. 供体与受体之间的距离不超过福斯特半径 R0 的 0.5 至 2 倍17。与 RET 不同，荧光能量非辐射转移（FUEL）是指当一个发光源（如生物发光细菌）发射出的光子被第二个实体（如荧光染料或荧光纳米颗粒）吸收并重新发射，从而使原始发光源的发射光谱发生红移。因此，FUEL 遵循类似于常规落射荧光条件的标准激发-发射过程，但无需使用聚焦激发光。这一点可通过简单混合发光细菌与高荧光量子点直接观察到。在存在 Vibrio sp. 的情况下，当溶液中加入 QD705 时，与非荧光聚苯乙烯微球对照相比，可观察到明显的红色信号增强（图 1A）。产生生物发光所需的组分，即醛类底物、荧光素酶和 ATP，均在细菌胞质内合成并储存（图 1B）。此外，酶促发光团的生成也发生在细菌胞质内。正如其他文献所报道，细菌内膜与外膜之间的距离通常大于 30 nm25–27，这一距离不足以支持显著的 RET 发生。同时，荧光纳米颗粒不会进入细菌胞质，因为细菌缺乏内吞作用或其他摄取机制。综上所述，这些限制因素表明，当发光细菌与荧光纳米颗粒混合时，FUEL 是主导的激发-发射现象。
如先前所示，FUEL 的作用范围超出了 RET 的范围。为了研究 FUEL 对距离的依赖性，可使用标准的减体积分光光度计比色皿，其中第一个比色皿含有荧光染料溶液，第二个比色皿含有适当的对照以校正散射效应，第三个比色皿则含有新鲜的发光溶液。必须用黑色胶带或其他不透明材料将中心比色皿包裹起来，仅在相对的两个面上留出至少两个相同的光学窗口，以减少来自发光源的任何潜在光污染。此外，另外两个比色皿需对称地放置在中心比色皿的两侧，且与中心比色皿的距离相等。最后，每次实验均应使用新鲜的发光溶液（通过细菌或化学发光产生），以确保最大程度的光发射。在正确放置后，应在所需的滤光片条件下采集发光信号。本实验中使用了“总光”和 710–730 nm 滤光片，但仅展示后者的数据。每次采集后，逐步将面对面距离从 1.0 cm 增加至 3 cm（图 2）。最后，将所有数据归一化至最强信号点。在本例中，该点出现在发光源与含有 QD705 的比色皿之间最短距离（D = 1 cm）处。采用此方法，可在最终采集点仍观察到有效的 FUEL 信号，表明在无任何光学吸收体的情况下，FUEL 的作用距离远超任何可能的共振能量转移范围，只能被解释为一种纯粹的辐射效应。对数据进行拟合发现，信号强度随距离 D 的变化呈现 D-1 至 D-2 的依赖关系。根据几何构型的不同，前者对应于电容器的距离依赖性，后者对应于点光源的平方反比定律。该结果与整体实验装置一致，考虑了比色皿孔径尺寸以及发光源与荧光染料之间的距离。
FUEL 不仅适用于量子点，还可使用多种荧光染料观察到，范围从 Alexa 系列到荧光微球表2）。为了与对照组具有可比性，应使用相同浓度的不同荧光染料，并保持纳米颗粒的总表面积恒定（表1通过将荧光染料和纳米颗粒与其相应的对照组（PS 或含非荧光聚苯乙烯微球的 PS）进行比较，可在每种荧光物质的发射波长最大值处观察到信号显著增强。信号相对增幅最大的情况出现在荧光发射波长最大值与发光源发射波长最大值相距最远时。这很可能是因为荧光信号具有较高的特异性，而发光源的发射光谱较宽所致。 相反，当两个发射峰未能良好分离时，FUEL信号的可靠性最低。有趣的是，尽管黄色微球的光谱差异极小，但仍能检测到明显的FUEL信号，这很可能归因于每个微球所含荧光团的数量较大（相当于350个荧光素分子）。此处展示的结果表明，在适当条件下，FUEL可由多种荧光团实现，从而使得探针的选择能够根据更具体的应用需求进行优化，适用于多种实验场景 体外 和 体内 条件。通过标准的双尾 Student t 检验确定所观察到的 FUEL 信号的显著性。因此，仅 Alexa555 被发现与所用的发光光源不兼容。
为了探究靶向作用对FUEL的影响，使用了生物素标记的抗体来靶向发光细菌和链霉亲和素连接的量子点（QDs）。重要的是，细菌或发光源需提供足够厚的层，以最大限度地减少发光体与其相应荧光团之间发生RET的可能性。在孵育并洗涤以去除未结合的抗体后，将生物素标记的细菌分别暴露于链霉亲和素偶联的QD705或非功能化的QD705（作为对照），然后将溶液分组，其中一组进一步洗涤以去除未结合的QD705。在此实验中，针对所有四种条件，均在全光、490-510 nm和710-730 nm滤光片下观察到相应的发光信号，尽管数据分析仅使用后两种滤光片。通过450-480 nm激发光和710-730 nm发射光滤光片比较QD705的存在情况。研究发现，当溶液处于未洗涤状态时，红移信号几乎没有差异（图3）。在此条件下，所测得的荧光信号也极为相似，表明在靶向与非靶向状态下存在的QD705数量基本相等。然而，对样品进行洗涤以去除未结合的QD705后，靶向细菌的相对红光信号相比非靶向对照几乎增加了两倍。通过荧光检测可验证QD705的存在与否。相比之下，经洗涤的靶向组其荧光强度比未洗涤组低近三倍，但红移信号仅减少了30%，提示在完全结合条件下，对细菌的靶向作用将导致红移发射增强。这一结果充分表明靶向FUEL在未来应用中的实用性。
<img alt="折叠变化与波长关系图；光激发示意图；含氧荧光素流动的发光现象。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51549/51549fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51549/51549fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 发光细菌与市售量子点之间的FUEL相互作用导致红光光子产量增加。 两个分光光度计比色皿中分别加入含有100 μl新鲜V. fischeri菌液（OD600为1-1.5）、895 μl生理盐水（PS）以及5 μl QD705或生理盐水（PS）的溶液，随后将比色皿放入IVIS Spectrum系统并采集发射光谱。由于QD705的存在，在710-730 nm发射滤光片下检测到的光子数•秒-1•厘米-2（p•秒-1•厘米-2）显著增加，表明红光信号增强（A）。在此情况下，细菌的双层膜阻止了发光组分（蓝色圆圈）与QD705（黑色圆圈）之间的相互作用。前者仅存在于细菌胞质内，而后者则自由分布于体相溶液中（B）。每种细菌溶液重复次数N=3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51549/51549fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="发光杆菌和大肠杆菌的归一化信号与距离关系图，突出显示QD705效应。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51549/51549fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51549/51549fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 证明FUEL可在完全排除共振能量转移的距离上发生。 分光光度比色皿中分别装入含有50 μl QD705和950 μl生理盐水（PS）的溶液，或97.2 μl非荧光性48 nm聚苯乙烯微球和902.8 μl PS的溶液，并对称放置于中央黑色比色皿的两侧，中央比色皿内含1 ml新鲜发光的 Photobacterium sp，OD600 为1-1.5。中央比色皿具有两个相同的光学窗口，允许发射的光子自由扩散。在距离（D）从1.0 cm到3 cm范围内采集图像，观察到红光的产生随距离增加而减少，表明FUEL可在共振能量转移无法达到的距离上发生。光强表现出与D-2相关的依赖性，类似于平方反比定律（左图）。对E. coli采用相同实验流程（右图）。所得趋势线符合细菌作为点光源发光的概念。共进行了三次独立的距离测量，每次使用不同的亚培养物。每个数据点均标有误差棒，在某些情况下误差棒小于表示归一化强度的符号。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51549/51549fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="生物发光与荧光图谱显示 Kp-QD705 分析；柱状图，数据比较。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51549/51549fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51549/51549fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 靶向（特异性）与非靶向（整体溶液）FUEL 的比较。K. pneumoniae 经生物素化抗体功能化后，分别暴露于链霉亲和素标记的（靶向）或未标记的（非靶向）QD705。将所得溶液等分，其中一组用 PBS 洗涤三次，然后重悬于初始体积的 PBS 中。随后将溶液分配至黑色 96 孔板的各个孔中，并在 490–510 nm（500 nm）和 710–730 nm（720 nm）发射滤光片下观察生物发光（以蓝色柱表示）。每个孔在 720 nm 滤光片下测得的 p•sec-1•cm-2 值，通过同一孔在 500 nm 滤光片下测得的 p•sec-1•cm-2 生物发光强度进行归一化处理。使用 450–480 nm 激发和 710–730 nm 发射滤光片测定表层荧光激发产生的相对荧光强度（以红色柱表示）。在未洗涤条件下（非靶向未洗和靶向未洗），生物发光或荧光信号几乎没有差异。这表明结合态和游离态的 QD705 被生物发光光子激发的程度相当。洗涤后，与对照组（非靶向洗涤）相比，QD705 标记的细菌（靶向洗涤）在相对红光信号上显示出近两倍的差异。非靶向洗涤组中 QD705 的缺失通过缺乏荧光信号得以确认，并验证了靶向洗涤组中 QD705 的标记效果。数据来自四次独立培养的 K. pneumoniae。为便于说明，图例标明了 QD705 激发的来源。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51549/51549fig3highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody align="center">
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">荧光染料</td>
			<td>浓度</td>
			<td>μl</td>
			<td>PS (μl)</td>
			<td>λmax 激发/发射 (nm)</td>
			<td>发射滤光片 (nm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:108px;">Alexa 555</td>
			<td style="width:116px;">37.2 µM</td>
			<td style="width:88px;">4.77</td>
			<td style="width:88px;">995.23</td>
			<td style="width:119px;">555/565</td>
			<td style="width:152px;">570 – 590</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:108px;">Alexa 568</td>
			<td style="width:116px;">37.2 µM</td>
			<td style="width:88px;">4.77</td>
			<td style="width:88px;">995.23</td>
			<td style="width:119px;">578/603</td>
			<td style="width:152px;">590 – 610</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:108px;">Alexa 633</td>
			<td style="width:116px;">37.2 µM</td>
			<td style="width:88px;">4.77</td>
			<td style="width:88px;">995.23</td>
			<td style="width:119px;">632/637</td>
			<td style="width:152px;">650 – 670</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:108px;">Alexa 700</td>
			<td style="width:116px;">37.2 µM</td>
			<td style="width:88px;">4.77</td>
			<td style="width:88px;">995.23</td>
			<td style="width:119px;">702/723</td>
			<td style="width:152px;">710 – 730</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:108px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:108px;">无荧光</td>
			<td style="width:116px;">2.62% 固含量</td>
			<td style="width:88px;">9.72</td>
			<td style="width:88px;">990.28</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:108px;">µSph 粉色</td>
			<td style="width:116px;">5% 固含量</td>
			<td style="width:88px;">4.77</td>
			<td style="width:88px;">995.23</td>
			<td style="width:119px;">580/605</td>
			<td style="width:152px;">610 – 630</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:108px;">µSph 黄色</td>
			<td style="width:116px;">5% 固含量</td>
			<td style="width:88px;">4.77</td>
			<td style="width:88px;">995.23</td>
			<td style="width:119px;">505/515</td>
			<td style="width:152px;">510 – 530</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:108px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:108px;">QD705</td>
			<td style="width:116px;">2 µM</td>
			<td style="width:88px;">5</td>
			<td style="width:88px;">995</td>
			<td style="width:119px;">465/705</td>
			<td style="width:152px;">710 – 730</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:108px;">QD800</td>
			<td style="width:116px;">2 µM</td>
			<td style="width:88px;">5</td>
			<td style="width:88px;">995</td>
			<td style="width:119px;">465/705</td>
			<td style="width:152px;">790 – 810</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. FUEL 演示中所用荧光染料的性质。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody align="center">
		<tr>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">对照</td>
			<td rowspan="2">滤光片</td>
			<td colspan="2">荧光染料</td>
			<td colspan="2">对照</td>
			<td rowspan="2">p 值</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>p·sec-1·cm-2</td>
			<td>SD</td>
			<td>p·sec-1·cm-2</td>
			<td>SD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A555</td>
			<td>PS</td>
			<td>580</td>
			<td>1.08 x 107</td>
			<td>3.31 x 106</td>
			<td>9.09 x 106</td>
			<td>1.75 x 106</td>
			<td>0.233</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A568</td>
			<td>PS</td>
			<td>600</td>
			<td>8.47 x 106</td>
			<td>4.23 x 106</td>
			<td>4.49 x 106</td>
			<td>9.71 x 105</td>
			<td>0.094</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A633</td>
			<td>PS</td>
			<td>660</td>
			<td>2.40 x 106</td>
			<td>1.25 x 106</td>
			<td>7.85 x 105</td>
			<td>2.39 x 105</td>
			<td>0.046</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A700</td>
			<td>PS</td>
			<td>720</td>
			<td>5.53 x 105</td>
			<td>2.46 x 105</td>
			<td>1.54 x 105</td>
			<td>6.05 x 104</td>
			<td>0.026</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MSph Yellow</td>
			<td>非荧光性 µspheres</td>
			<td>520</td>
			<td>1.19 x 108</td>
			<td>4.85 x 107</td>
			<td>5.79 x 107</td>
			<td>1.99 x 107</td>
			<td>0.057</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MSph Pink</td>
			<td>非荧光性 µspheres</td>
			<td>620</td>
			<td>2.37 x 107</td>
			<td>1.36 x 107</td>
			<td>2.16 x 106</td>
			<td>8.00 x 105</td>
			<td>0.026</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QD705</td>
			<td>非荧光性 µspheres</td>
			<td>720</td>
			<td>1.76 x 107</td>
			<td>7.33 x 106</td>
			<td>2.08 x 105</td>
			<td>7.16 x 104</td>
			<td>0.007</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QD800</td>
			<td>非荧光性 µspheres</td>
			<td>800</td>
			<td>7.79 x 106</td>
			<td>4.72 x 106</td>
			<td>3.60 x 104</td>
			<td>1.52 x 104</td>
			<td>0.023</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 与FUEL兼容的荧光团和荧光纳米颗粒的鉴定。

通过系统阐述荧光未结合发光激发（FUEL）的相关原理，并验证其与多种荧光染料及抗体靶向条件的兼容性，拓展FUEL技术的基础与应用范围。

超越BRET：基于未结合发光激发的荧光（FUEL）

荧光未结合发光激发（Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence, FUEL）是一种辐射性激发-发射过程，可产生增强的信号与对比度……

以下实验的总体目标是展示燃料的简单性，并观察由于辐射激发发射事件而产生的红光光子。通过将生物发光细菌与发光纳米颗粒结合以产生燃料来实现这一目标。接着，使用生物发光酶标仪观察由燃料产生的红光光子，实验结果表明，当生物发光细菌与量子点保持在相同溶液中时，能够产生大量红光光子。根据观察到的红光光子通量增加，该技术的意义在于对NCE居住性进入转移或Brett这一范式提出了质疑。文献中通常从单个菌落开始，在标准培养平板上启动发光细菌的过夜培养。实验当天使用费氏弧菌（Vibrio Fisher Eye）。启动新鲜的亚培养物，使其生长至在600纳米处的光密度（OD）达到1至1.5。为获得可比结果，应使用处于相似生长状态且能产生强烈信号的细菌。取每种样品各100微升，分别加入5微升荧光探针QD 705或生理盐水。然后将混合物加入895微升生理盐水中，并转移至标准比色皿。将装有样品的比色皿放入整体动物生物发光成像仪中，在相应的滤光片组下进行测量。此处使用710至730纳米发射滤光片，在不同距离下进行燃料实验。取两个低体积塑料比色皿，分别加入50微升QD 705，或在总体积为1毫升的生理盐水中加入97.2微升非荧光48纳米聚苯乙烯微球。这可确保两种颗粒的单位总体积内固体表面积相近。通过用标准黑色胶带或其它能够阻挡光线的不透明材料包裹第三个qve来制备光源qve。在vete相对的两侧小心制备两个相同的光学窗口。取一毫升来自新鲜传代培养的 Vibrio fii 或其他培养物的等分试样，加入光源vete中，并用黑纸等不透明材料覆盖，以减少任何光线污染。接下来，将先前装好的比色皿直接放置在成像仪光源两侧的插槽中。在相应的发射滤光片下观察三个Q vets，例如使用全光和710至730纳米发射滤光片，曝光时间分别为10、30和30秒。采用450至480纳米激发光和710至730纳米发射光获取荧光图像，以验证QD 7 0 5的位置。将两个外部量子检测器重新定位至距离中心量子检测器更远的等距位置。随后成像并采集荧光图像，再重复此过程，直至最终面对面的距离达到三厘米。取两个减小体积的比色皿，分别加入一毫升溶液：其中一个含有荧光染料 Fluoro Four 或感兴趣的荧光纳米颗粒，另一个含有生理盐水及非荧光纳米颗粒作为阴性对照。向一个已遮光的第三支比色皿中加入1毫升新鲜的 Vibrio FII 或其他发光细菌，该比色皿含有两个物理尺寸相等且位于相对两侧的光学窗口，并用不透光材料（如黑色纸片）将比色皿遮盖，纸片与比色皿保持较短但相等的距离。将两个减小体积的比色皿放置在已遮光的Q比色皿两侧，并在适当的滤光条件下观察；此处使用的间距为0.7厘米。随后，将另一组qd 7 0 5施加于细菌，重复上述步骤。与仅有细菌的情况相比，观察到红光光子数量显著增加。在没有任何吸收体的情况下，控制燃料的效应可以在长距离下发生。这种距离依赖性可以通过平方反比定律来表征。对于点源。将flora fours靶向细菌膜似乎对产生的总燃料信号量几乎没有影响。在此情况下，即使经过多次洗涤步骤，靶向的燃料仍能保持。观看本视频后，您应能充分了解如何通过多种方式重构燃料，以实现由辐射激发发射事件产生红光光子。

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