Name: 动态钙的自动分析 2 +在图像序列信号 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: 了解自动感兴趣区域分析技术，用于猪冠状动脉内皮细胞钙信号研究。该方法通过自动化处理提高钙瞬变参数分析的速度与准确性，减少人为误差，为心血管生理学研究提供可靠工具。

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本研究部分得到了美国国立卫生研究院基金项目 HL-085887、HL-092992、S10RR027535 和 MOP-93676 的资助。

1. 血管解剖与成像
<ol>
	<li>按照 Martens 等27 所述方法，采集家猪幼体组织。将采集的猪右心室置于含有 HEPES 缓冲生理盐水溶液（PSS）的聚二甲基硅氧烷（PDMS）底解剖皿中。
	<ol>
		<li>在体视显微镜辅助下，使用镊子和弹簧剪刀从周围组织中分离并取出左前降支冠状动脉的一段（长约 8 mm，直径约 0.5 mm），去除血管段周围的 cardiac 组织层。注意：操作时应避免刺破血管壁。</li>
		<li>将一块 PDMS 块（1 × 0.5 × 0.5 cm）放入解剖皿中，并用针将其固定在皿底。将直径约 40 μm 的钨丝切成十二段，每段长约 0.3 cm，制成微针，并将这些微针放入解剖皿中。使用镊子将血管段一端用一根微针固定在 PDMS 块上。</li>
		<li>小心地将小型弹簧剪刀插入血管腔内，沿血管一侧纵向剪开，使血管完全展开。将展开的血管段放置成内皮面向上的方向。</li>
		<li>使用剩余的微针将展开血管段的边缘固定在 PDMS 块上，使其形成一个平坦的矩形。注意：微针顶部应弯成 90°，并插入至与块表面齐平。操作时应小心拉伸血管样本，避免过度拉伸；最终宽度应约为未拉伸初始宽度的 1.5 倍&#160;。</li>
		<li>配制少量（约 1 ml）Fluo-4 AM 负载溶液：将溶解于 DMSO 的 Fluo-4 AM（10 µM）与 Pluronic（0.03%）混合于 HEPES 缓冲 PSS 溶液中（成分，单位为 mM：134 NaCl、6 KCl、1 MgCl、10 HEPES、10 葡萄糖），然后将整个 PDMS 块浸入该负载溶液中，在室温避光条件下孵育约 40 分钟。</li>
		<li>负载完成后，用 HEPES 缓冲 PSS 溶液清洗 PDMS 块 5–10 分钟。</li>
		<li>将 PDMS 块安装在厚度为 50–100 µm 的垫片上，置于含 HEPES 缓冲 PSS 的玻璃底培养腔中。注意：可使用金属针作为垫片，并确保血管段朝下且不接触垫片。</li>
		<li>将培养腔放置在配备共聚焦成像系统的倒置显微镜载物台上，聚焦于内皮细胞层。</li>
		<li>使用共聚焦图像序列采集软件，在 20 倍放大倍数和约每秒 8 帧的帧率下，连续采集约 3 分钟的基础相对荧光时间序列图像&#160;。</li>
		<li>记录约 3 分钟的基础荧光后，将 HEPES 缓冲 PSS 溶液更换为等体积（约 1 ml）含 P 物质（Substance P，100 pM）的 HEPES 缓冲 PSS 溶液，并继续记录 3 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 自动化分析
<ol>
	<li>将共聚焦采集软件获得的荧光钙活动图像序列渲染为8位灰度的“.tif”格式文件，不包含比例信息。</li>
	<li>打开ImageJ，点击文件菜单中的“open”，在资源管理器窗口中选择相应的图像序列，以在ImageJ中查看图像序列。</li>
	<li>使用矩形ROI工具估算图像序列中活动空间扩散的上下边界，从而确定合适的ROI直径。注：矩形平均直径是选择ROI直径的合适依据。</li>
	<li>在计算机硬盘上创建一个新文件夹，并将图像序列添加到该文件夹目录中。</li>
	<li>在ImageJ中，点击“plugins”窗口，然后点击“LC_Pro”以启动分析。</li>
	<li>输入ROI直径值，并选择滤波阈值（0.05或0.01）。</li>
	<li>勾选“drug treatment”复选框，并输入加药前和加药后的时间点值（单位：秒）。</li>
	<li>点击“ok”，并在文件浏览器窗口中输入图像序列所在目录。</li>
</ol>
3. 图形输出
<ol>
	<li>从 <a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.org/</a> 下载 R 3.0.2 版本。</li>
	<li>打开 R 的 32 位版本。</li>
	<li>点击“文件”，然后选择“打开脚本”，并选中用于生成图形化实验报告的 'traceplot.R' R 脚本。</li>
	<li>通过选择“包”、“安装包”，然后选择相应的包，安装 calibrate 和 gplots 包。</li>
	<li>点击“文件”，然后选择“更改工作目录”命令，使用资源管理器窗口选择对应于 LC_Pro 分析输出的目录。</li>
	<li>点击脚本窗口，然后执行“运行全部”命令以运行该脚本。</li>
</ol>

<ol><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).</li>
<li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Delisle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+four+dimensions+of+calcium+signalling+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes.</a> Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).</li>
<li>Dupont, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics%3A+spatio-temporal+organization+from+the+subcellular+to+the+organ+level%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level.</a> Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).</li>
<li>Hayashi, H., Miyata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+intracellular+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of intracellular Ca2.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 31 (1), 1-10 (1994).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. 23, (2009).</li>
<li>Hong, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+spikes+in+rat+suprachiasmatic+nucleus+neurons+induced+by+BAPTA-based+calcium+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes.</a> PloS One. 5 (3), (2010).</li>
<li>Kuga, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+calcium+waves+traveling+through+astrocytic+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo.</a> J Neurosci. 31 (7), 2607-2614 (2011).</li>
<li>Mumtaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+agonist+induced+Ca2%2B+signalling+in+intact+endothelial+cells+studied+confocally+in+in+situ+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries.</a> Cell Calcium. 49 (1), 66-77 (2011).</li>
<li>Paredes, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
<li>Silei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+calcium+levels+by+the+fluorescent+Ca2%2B+indicator+Calcium-Green%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 5 (2), 132-134 (2000).</li>
<li>Simpson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+%5BCa2%2B%5Dc%3A+basic+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations.</a> Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).</li>
<li>Gaspers, L. D., Thomas, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in liver.</a> Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).</li>
<li>Hellman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Ca2%2B+oscillations+in+pancreatic+%C3%9F-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells.</a> Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).</li>
<li>Kansui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+spontaneous+Ca2%2B+events+in+endothelial+cells+reflect+signalling+through+myoendothelial+gap+junctions+in+pressurized+mesenteric+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries.</a> Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Tatsumi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+intracellular+calcium+concentration+in+guinea-pig+myenteric+neurons+by+using+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+res%22%5BJournal%5D)">Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2.</a> Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).</li>
<li>Lorenz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pixel-based+criteria-oriented+analysis+of+time-lapse+Ca2%2B-fluorescence+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images.</a> J Neurosci Meth. 127 (2), 157-166 (2003).</li>
<li>Mukamel, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Reidl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+component+analysis+of+high-resolution+imaging+data+identifies+distinct+functional+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains.</a> Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).</li>
<li>Wegner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+of+elementary+calcium+release+events+using+the+%C3%A1+trous+wavelet+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform.</a> Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).</li>
<li>Cheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplitude+distribution+of+calcium+sparks+in+confocal+images%3A+theory+and+studies+with+an+automatic+detection+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method.</a> Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).</li>
<li>Picht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SparkMaster%3A+automated+calcium+spark+analysis+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).</li>
<li>Abramoff, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophoton+Int%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Francis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+region+of+interest+analysis+of+dynamic+Ca2%2B+signals+in+image+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+dynamic+endothelial+Ca2%2B+signals+by+the+TRPA1+channel+activator+AITC+in+rat+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries.</a> Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).</li>
<li>Taylor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Ca2%2B+signal+modalities+in+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium.</a> Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).</li>
<li>Martens, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucous+solids+and+liquid+secretion+by+airways%3A+studies+with+normal+pig%2C+cystic+fibrosis+human%2C+and+non-cystic+fibrosis+human+bronchi%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在细胞和多细胞水平上解析复杂的Ca2+信号需要严谨的实验与分析方法。本文描述了一种方法，通过对Ca2+依赖性荧光的时间分辨共聚焦图像序列进行自动化分析，识别并量化完整细胞区域中具有统计学意义的Ca2+信号。在所展示的具体案例中，从猪心脏中分离出一段动脉，将其固定并展开以暴露内皮层，加载Ca2+指示剂Fluo-4 AM后进行共聚焦成像，并使用定制算法LC_Pro进行分析。该算法旨在：1）检测并追踪统计学噪声以上（p &#60; 0.01）的动态Ca2+变化位点；2）在活性位点中心自动定义感兴趣区域（ROI）；3）分析ROI内的平均荧光强度，以确定特定事件的参数。该方法通过减少人为误差和偏差、显著缩短离线分析时间，并提供整个视野中信号的完整索引以识别代表性谱型或模式，克服了生物信号研究中的主要局限性。LC_Pro的输出结果进一步通过R脚本处理，为单个实验生成包含高质量图形输出的完整参数报告。
正确执行所述技术需要注意多个步骤。组织解剖过程（步骤 1.1.1）必须谨慎进行，以避免...

Ca2+ 是一种普遍存在的第二信使信号分子，细胞质中的 Ca2+ 水平受到严格调控。细胞内 Ca2+ 信号十分复杂，包括孤立的瞬时信号、振荡以及传播性波动1-4。Ca2+ 信号在空间和时间上的精确控制被认为是生理信号特异性的基础，因此，对 Ca2+ 信号模式的分析在多个研究领域中均受到广泛关注5。
Fluo-4 和 Fura-2 等 Ca2+ 指示剂染料通常用于通过荧光显微镜测量细胞内 Ca2+ 信号5-12。通常，时间依赖性的 Ca2+ 信号通过用户定义的区域（即感兴趣区域，ROI）内的平均荧光随时间的变化来评估5,6,13-16。目前，手动 ROI 分析既耗时又费力，因为需要用户识别大量 ROI 并执行重复性计算17-19。这些方法还可能引入较大的人为误差，包括人为信号模式的引入以及低幅度或弥散性信号的遗漏18,20。
以往已采用多种统计方法实现自动化的感兴趣区域（ROI）检测算法，以确定最佳的ROI放置位置，但这些方法通常仅限于线扫描或伪线扫描图像的分析，从而将时间上的空间分析限制在单一维度17,19-22。此外，许多现有算法尚不足以涵盖Ca2+释放事件的多样性，这些事件从周期性、局灶性的瞬时信号到传播性钙波均有分布23,24。在许多实验系统中，显著的图像伪影常常存在，干扰了信噪比的判别，进一步增加了生理学Ca2+信号全面评估的复杂性。
此前，已开发并验证了一种用于检测钙离子（Ca2+）信号瞬变的自动化感兴趣区域（ROI）检测算法，该算法作为美国国立卫生研究院（NIH）ImageJ 软件（National Institutes of Health, Bethesda, MD）的插件实现25,26。该算法名为 LC_Pro，旨在识别和分析二维时间序列图像中包含 Ca2+ 信号瞬变的感兴趣区域（ROI）。本文提供了一个实用的实验方案，并以猪冠状动脉内皮组织中该算法的应用为例进行代表性演示，同时结合使用开源统计分析软件 R 进行后续处理，以生成可用的图形化结果。

<table><tbody><tr><td>解剖皿</td><td>Fisher Sci</td><td>#08-772-70</td><td></td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）</td><td>Fisher Sci</td><td>#NC9644388</td><td>弹性体试剂盒，需模制成培养皿</td></tr><tr><td>HEPES缓冲的PSS</td><td>Sigma</td><td>#H3375-250G</td><td>HEPES酸</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Nikon Inst.</td><td>#MNA42000</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11223-20</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>钨丝</td><td>Scientific Inst Svcs</td><td>#406</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Tech.</td><td>#F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Life Tech.</td><td>#P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>金属固定针</td><td>Fine Science Tools</td><td>#26002-10</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养腔</td><td></td><td></td><td>定制设计</td></tr><tr><td>转盘共聚焦显微镜</td><td>Perkin Elmer</td><td>RS-3</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html">下载地址：http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>ImageJ 的 LC_Pro 插件</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html">下载地址：http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>R 软件</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.r-project.org/">下载地址：http://www.r-project.org/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>R traceplot 脚本</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing">下载地址：https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

图像序列中动态ca2+信号的自动化分析

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

细胞内 Ca2+ 信号通常使用荧光 Ca2+ 指示剂染料和显微镜技术进行研究。然而，Ca2+ 成像数据的定量分析耗时较长，且容易引入偏差。目前已开发出基于感兴趣区域（ROI）检测的自动化信号分析算法，用于一维线扫描测量，但尚无现有算法能够整合二维图像序列中 ROI 的优化识别与分析。本文介绍了一种用于图像序列中 ROI 快速获取与分析的算法。该算法通过将椭圆拟合到去噪后的信号，以确定最佳 ROI 位置，并计算 Ca2+ 信号的振幅、持续时间和空间扩散等参数。该算法已作为 ImageJ（NIH）软件的免费插件提供。结合为开源统计分析软件 R 编写的分析脚本，该方法可构建一个高通量的实验结果快速统计分析流程。作者认为，采用此分析方案将有助于更全面、无偏倚地表征生理性的 Ca2+ 信号传导。

为了对共聚焦图像序列中的 Ca2+ 动态进行自动化分析，开发并实施了一种自定义算法 LC_Pro。如图 1所示，该算法采用顺序处理模块：A) 检测并追踪高于统计学噪声（p &lt; 0.01）的动态 Ca2+ 变化位点；B) 在活性位点中心自动定义感兴趣区域（ROI）；C) 计算 ROI 内的平均荧光强度，以确定特定事件参数。通过计算机生成的已知强度和位置的高斯脉冲，展示了该算法的图形概览（图 2）。将信号脉冲（图 2A 和 B）利用标准正态分布的 z 分数转换为二值图像，并对高于信号阈值的像素位置拟合最优椭圆（图 2C）。采用椭圆排序算法确定最佳 ROI 定位（图 2D）。随后测量 ROI 平均荧光强度随时间的变化，并计算信号参数，包括幅度、持续时间和空间扩散范围（图 2E）。该分析方法被应用于评估完整血管内皮细胞中的 Ca2+ 动态。...

本文展示了一种基于二维延时图像序列中正信号区域拟合最优椭圆并对其进行排序的新型感兴趣区域分析方案。该算法可帮助研究人员以最少的用户输入和偏差，全面分析生理性的Ca2+信号。

图像序列中动态Ca2+信号的自动化分析

细胞内 Ca2+ 信号通常使用荧光 Ca2+ 指示剂染料和显微镜技术进行研究。然而，Ca2+ 的定量分析……

以下实验的总体目标是利用自动化的ROI分析来检测猪冠状动脉中的内皮细胞钙活性。该目标通过解剖并打开猪冠状动脉，以测量内皮细胞钙活性作为第二步来实现。对所获得的钙信号测量数据进行自动化ROI分析，最终输出钙活性的汇总结果。接下来，对输出结果运行相应的软件脚本，以进行统计分析并图形化呈现钙活性分析结果，从而获得基于自动ROI分析和统计处理的钙信号瞬态参数。该技术相较于现有方法（如手动ROI分析）的主要优势在于自动化分析速度更快、覆盖更全面，且更不易受人为误差影响。在此步骤中，将收获的猪右心室组织置于含有大量缓冲生理盐水溶液的A-P-D-M-S底部解剖皿中。在体视显微镜下，从周围心肌组织中分离出左前降支冠状动脉的一段。注意避免刺穿血管壁。接着，将PDMS块放入解剖皿中，并用针将其固定在底部。向培养皿中加入缓冲液。然后将直径约为40微米的钨丝切成12段，每段长0.3厘米，制成微针，并将其放入培养皿中。用镊子将血管段的一端用一根微针固定在基块上。小心地将小型弹簧剪插入血管腔内，沿血管一侧纵向剪开，以完全展开血管。随后，将打开的血管段内皮面朝上放置。使用剩余的微针将打开的血管段边缘固定在标本台（block）上，使血管呈平坦的矩形。然后制备1毫升Fluo-4 AM染色液。将整个组织块置于染色液中，在室温避光条件下孵育约40分钟。染色后，用HEPES缓冲PSS溶液洗涤组织块5至10分钟。随后，将组织块置于载玻片底部培养腔室中的50至100微米厚间隔片上，腔室内含有HEPES缓冲PSS溶液。将腔室置于配备共聚焦成像功能的倒置显微镜载物台上，使用共聚焦图像序列采集软件对内皮细胞层进行聚焦，以20倍放大倍数和每秒8帧的帧率，连续采集3分钟基础相对荧光的时间序列图像。在记录3分钟基础荧光后，将Heaps缓冲的PSS溶液替换为等体积的含100皮摩尔P物质（substance P）的Heaps缓冲PSS溶液，并继续记录3分钟。在此过程中，将共聚焦采集软件获得的荧光钙活动图像序列导出为8位灰度TIFF格式文件，不包含比例信息。然后打开 ImageJ。在文件菜单中点击“打开”，并在资源管理器窗口中选择相应的图像序列。为了在 ImageJ 中查看图像序列，使用矩形 ROI 工具确定一个合适的感兴趣区域（ROI），以估算图像序列中活动空间分布的上下边界。接下来，在计算机硬盘上创建一个新文件夹，并将图像序列添加到该文件夹目录中。在 Image J 中，点击插件窗口，然后点击 lc pro。要开始分析，请输入 ROI 直径值，并在“word”一词后选择滤波阈值。单击药物处理复选框，并输入给药前后的具体时间点数值。然后单击“确定”，在文件浏览器窗口中输入图像序列目录。在此步骤中，下载 R 版本 3.0.0.2 并进行安装。然后打开 R 的 32 位版本。接着点击文件，再打开脚本，并选择用于生成图形化实验报告的 trace plot RR 脚本。通过选择软件包来安装 calibrate 和 gpls 软件包。安装软件包，随后选择适当的软件包。点击文件，然后选择更改目录命令，并使用资源管理器窗口选择与 lc pro 分析输出相对应的目录。接着点击脚本窗口，然后选择运行全部命令以在此处运行脚本。显示了一个输入图像序列的时间推移图像，该序列为先进行基础采样间隔，随后进行P物质刺激采样间隔。基础状态和刺激状态下的最佳裂解时间推移图像序列由lc Pro软件生成，此处展示了每个自动定位的感兴趣区域（ROI）对应的时间依赖性缩放强度曲线。来自对照组和P物质刺激事件的峰值振幅、半峰宽度持续时间以及最大空间扩散的直方图由代表性实验结果生成。使用R语言对lc Pro的输出结果进行图形化处理。值得注意的是，P 物质刺激增加了事件数量，并通过 Mann-Whitney U 检验发现中位振幅和持续时间出现显著的向右偏移。在进行该操作时，需注意尽量减少由于焦平面移动或对比度设置不当所导致的图像伪影，因为这可能会显著影响分析结果。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

动态钙的自动分析<sup&gt; 2 +</sup&gt;在图像序列信号

详细介绍在离体器官中对平滑肌进行高分辨率 Ca2+...

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