Name: 通过40W的Elvax缓释给药的大鼠视网膜:对慢性疾病的治疗 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 学习使用Elvax 40W缓释给药系统治疗大鼠视网膜慢性疾病的方法。本技术通过制备药物-树脂复合物实现直接给药，并经视网膜电图验证疗效，为眼科研究提供经济有效的治疗方案。

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本研究得到了澳大利亚研究理事会通过视觉科学卓越研究中心（ARC Centre of Excellence in Vision Science，编号 CE0561903）、国家健康与医学研究理事会（编号 1049990）以及阿布鲁佐大区多轴专项计划“高等教育网络”——2007-2013 年阿布鲁佐大区欧洲社会基金计划行动 4.II.iii 的支持。

所有实验均遵循《眼科与视觉研究动物使用ARVO声明》，并经拉奎拉大学动物伦理委员会和澳大利亚国立大学动物实验伦理委员会批准。本研究全程使用成年大鼠（P100-200）。
1. 准备共聚物树脂颗粒
<ol>
	<li>在通风橱内，将20粒Elvax 40W小球放入一个小玻璃烧杯中。</li>
	<li>向烧杯中加入100%乙醇，确保完全浸没所有小球。</li>
	<li>用Parafilm封住烧杯口，在室温下用100%乙醇浸泡小球7-10天。注意：从这一步开始，不得使用金属或塑料器具接触或储存树脂。</li>
</ol>
2. 准备注入用药物溶液
<ol>
	<li>将所选药物溶解于 0.1% 二甲基亚砜（DMSO）中，配制成终体积为 40 µl 的药物溶液。树脂负载的药物浓度应为单次给药剂量浓度的三倍。</li>
</ol>
3. 准备并装载药物-树脂复合物
<ol>
	<li>将20个洗涤后的沉淀转移至另一个小玻璃烧杯中，加入4 ml二氯甲烷，溶解约45分钟。溶解过程中用Parafilm封住烧杯口。</li>
	<li>通过将快绿FCF（Fast Green FCF）溶解于0.1% DMSO中，配制成浓度为0.001 mg/ml的溶液。</li>
	<li>取一支移液器，吸取40 µl先前配制的药物溶液；另取一支移液器，加入40 µl快绿溶液。</li>
	<li>将两种溶液同时加入烧杯中，用玻璃搅拌棒快速混合，直至绿色染料均匀分布于整个混合物中。</li>
	<li>立即将烧杯置于干冰上冷冻10分钟，以快速冻结树脂。</li>
	<li>设置一个“蒸发室”以蒸发溶剂。取一个较大的容器，装入约三分之一高度的硫酸钙小颗粒，在颗粒中挖出一个凹坑，小心地将烧杯放入凹坑中，使颗粒高度达到烧杯的一半，以在蒸发室内稳定烧杯。</li>
	<li>用Parafilm封住外部较大的容器。</li>
	<li>将蒸发室转移至冰箱中，于-20 °C保存2至3周。</li>
</ol>
4. 为外科植入准备药物-树脂复合物
<ol>
	<li>从冷冻柜中取出蒸发室。将固态药物-树脂块转移至置于冰上的玻璃皿中。</li>
	<li>借助显微镜或放大镜，使用环钻或打孔工具从块状物上切下一小块，直径约 0.05 mm，长度约 0.1 mm。</li>
	<li>将剩余的块状物用防冻材料（例如，铝箔）包裹，并于 -20 °C 保存，直至后续使用。</li>
</ol>
5. 将载药树脂复合物外科植入大鼠眼内
<ol>
	<li>准备动物进行手术。通过腹腔注射给予氯胺酮（100 mg/kg 体重）和赛拉嗪（12 mg/kg 体重）混合物以实施麻醉。观察动物直至完全麻醉。注意：动物应失去自主运动（呼吸除外），并丧失角膜反射和脚趾夹捏反射。</li>
	<li>将完全麻醉的动物转移至手术台。使用散瞳剂（mydriaticum）例如,&#160;硫酸阿托品）以及局部麻醉药（例如,&#160;在手术眼滴加盐酸丁卡因滴眼液。术中使用人工泪液保持角膜湿润。手术全程使用一次性针头和无菌器械。</li>
	<li>使用钝性弯镊在瞳孔充分散大后固定眼球。在距角膜缘约2 mm处，用25 G针头在手术显微镜下刺入全层，到达玻璃体腔。</li>
	<li>使用精细的尖头镊子将制备好的药物-树脂复合物插入穿刺伤口中例如，镊子）能够穿透穿刺部位。</li>
	<li>作为预防细菌感染的措施，将抗生素软膏涂抹于眼部，以防止炎症发生，并在动物恢复期间防止角膜干燥。</li>
	<li>观察动物直至其完全恢复。在动物恢复意识之前，不得使其无人看管。在动物完全恢复之前，不得将其放回其他动物群体中。若动物出现应激或不适迹象，应根据已批准的伦理方案使用镇痛剂。</li>
	<li>按照常规实验步骤进行组织的采集与分析。</li>
	<li>实验结束后，通过腹腔注射戊巴比妥钠（60 mg/kg 体重）与2%盐酸利多卡因溶液处死动物。</li>
</ol>
注意：盐酸利多卡因可减轻局部不适。

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</ol>

作者无任何披露事项。

本文展示了一种利用药物-树脂复合物实现向视网膜缓慢释放药物的方法。&#160;我们的目标是提供一种相对低成本且易于在小型动物模型中应用的技术方法。
由于APB的功能是作为谷氨酸类似物，它将阻断眼睛中的视网膜反应。结果显示，在植入后一周，APB导致了视网膜反应的阻断。这表明APB已成功释放到玻璃体和视网膜中，并且其作用仅限于植入药物-树脂复合物的眼部。药物的完全效应在植入后一周变得明显（图1B）。图1A&#160;显示，在植入后1天，仅在植入眼的106φ光强下，b波出现显著降低。这可能表明，在这一早期时间点，只有对较高光强度有反应的视锥细胞&#160;通路&#160;&#160;受到了影响。&#160;为了确定树脂向视网膜递送APB的持续时间，应进一步考察更多时间点。建议在植入后的0至7天内增加记录时间点，例如在植入后第3天和第5天，以明确视网膜反应完全消失的具体时间。此外，还应在7天之后继续进行记录，以确定APB释放的持续时间。如果APB持续缓慢地释放到玻璃体中，视网膜反应将持续...

糖尿病和高血压等慢性疾病的治疗面临诸多挑战，因为这些疾病通常需要长期甚至终身治疗。这促使了缓释药物递送系统的开发，以减少频繁给药的需求。胰岛素泵的开发已证明了这类缓释方法的有效性，可减少糖尿病患者所需的胰岛素注射次数。影响眼部尤其是其内层组织的慢性疾病，通常需要通过侵入性手段频繁给药。一种影响人类眼睛的慢性疾病是年龄相关性黄斑变性（AMD）。该病累及中央视网膜，即位于眼球后部、负责启动视觉的一层神经组织。AMD 是西方国家失明的首要原因1。治疗视网膜疾病的一个特殊挑战在于，药物必须到达眼球深层组织，而这通常需要侵入性递送方式。目前药物通常通过玻璃体内注射方式递送至玻璃体腔和视网膜。然而，每次注射均存在发生注射后并发症的风险，包括眼内炎、视网膜脱离、白内障和玻璃体积血2。随着药物重复注射，此类风险随之累积。
减少多次注射的需求将对年龄相关性黄斑变性（AMD）的治疗带来显著益处。针对AMD的湿性形式（其特征是新生血管生长），目前 established 的治疗策略是使用血管内皮生长因子（VEGF）抑制剂来靶向抑制血管内皮生长因子3。目前，这类药物需通过反复的玻璃体内注射给药。类似地，在治疗糖尿病视网膜病变常见并发症——黄斑水肿时，也需通过重复注射给予糖皮质激素4。若能采用缓释方式递送这些药物，确实可降低注射后并发症的风险。
缓释药物递送系统的概念最初通过使用硅橡胶载体将小分子递送至动物组织而被提出5自那时以来，其他缓释方法已被开发用于递送更大的分子，其中多种方法已在眼部进行过测试。颗粒载体，如可生物降解微球、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米颗粒和磷脂囊泡（脂质体），可作为有效的递送载体6,7PLGA 纳米颗粒与脂质体已在一项研究中进行比较 体外 环境在随时间经巩膜递送抗癌药物方面的能力7两种载体均能有效实现药物的缓慢释放。然而，该研究仅在体外进行 体外 环境。Bochot 等 (2002)8 测试了脂质体向视网膜递送分子的有效性 体内他们已证明脂质体可成功将小型寡核苷酸递送至兔视网膜。作者认为，脂质体在视网膜疾病的治疗中可能具有应用价值。8然而，这些囊泡具有在玻璃体中漂浮的特性，可能导致视力模糊或受损9.
Okabe et al. (2003)10 采用由 33% 乙烯-醋酸乙烯酯组成的不可生物降解聚合物圆盘，在兔体内给予倍他米松。他们将圆盘植入巩膜囊袋中，证实药物可有效释放至玻璃体和视网膜，持续时间长达一个月10。然而，在该特定方案中，植入物相对较大且质地较硬，需要更复杂的手术操作，包括较大的巩膜切口以及缝合。
早期的一项研究通过将不同聚合物载体植入兔眼角膜，考察了组织对这些载体的反应，发现经酒精洗涤的乙烯-醋酸乙烯酯共聚物不会引起炎症或刺激。这些复合物可长时间持续向动物组织递送较大分子量的化合物，某些情况下递送时间可超过100天，具体时长取决于所载药物11。其中一种共聚物树脂已实现工业化生产，商品名为Elvax 40W（含40%重量比的乙烯-醋酸乙烯酯共聚单体，并添加‘W’型酰胺助剂以改善颗粒处理性能）。该共聚物树脂为惰性物质，在室温和体温条件下均保持稳定，未见引起生物组织过敏或毒性的报道。该树脂已在多种实验模型中成功递送多种药物，用于研究不同系统的功能，例如乳腺导管系统12、初级听觉皮层13,14以及蛙类视觉系统15。该树脂还曾用于眼部，向发育中的龟类16,17、鸡胚18,19以及成年雪貂视网膜20递送药物。在大鼠中枢神经系统中，该树脂仅被应用于脑部研究21-23，而其在大鼠眼部的应用尚未见报道。
与其他方法相比，使用这种共聚物树脂向视网膜缓慢递送药物的优势在于，它是一种稳定的化合物，不会在眼部引起炎症或刺激。与颗粒载体不同，药物-树脂复合物在植入后通常不会影响视力，因为它通常停留在给药部位，而不会在玻璃体中漂浮。该方法仅需将复合物简单植入靠近角膜缘的玻璃体腔内，且植入后无需缝合。近年来，已出现多种新型递送系统，如包封细胞技术（ECT）24,25、水凝胶26和微膜27。然而，本研究中所采用的药物-树脂复合物的制备与递送方法操作简便且成本低廉，因此在基础研究环境中更具优势。使用该复合物实现长期药物治疗的主要挑战在于确定最佳药物浓度，以在减少玻璃体内注射次数的同时最大化治疗效益。
本文旨在演示药物-树脂复合物在成年大鼠视网膜长期治疗中的应用。通过使用谷氨酸类似物2-氨基-4-磷酸丁酸（APB）作为药物，验证该递送方式的有效性。APB通过模拟视网膜中的内源性神经递质谷氨酸，阻断ON型双极细胞的光反应28。当APB与其受体结合并与谷氨酸竞争时，可抑制光反应。在以往的生理学研究中，APB被用于调控视网膜功能，并通过视网膜电图（ERG）等电生理方法测量其效应。既往研究已将APB用于发育期视网膜的短期29和长期处理；后者包括每日一次玻璃体内注射，持续30天30。所有注射均采用相同剂量的APB（0.092 mg溶于无菌生理盐水中，浓度为50 µM），该剂量依据先前研究推荐28,29,31。我们选择APB来测试药物-树脂复合物作为缓释载体向眼内递送药物的可行性。本研究所述方法与此前报道的药物-树脂复合物制备方法类似16,32，但进一步详细描述了其在成年大鼠眼中的具体应用。将负载APB的树脂植入眼内后，进行视网膜电图（ERG）检测，以确定APB是否消除了视网膜的光反应，从而判断APB是否已成功释放至玻璃体和视网膜组织中。

<table><tbody><tr><td>Elvax 40W 颗粒</td><td>Du Pont, DE, 美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, 美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-氨基-4-膦酰丁酸（APB）</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, 美国</td><td>A1910</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, 美国</td><td>34856</td><td></td></tr><tr><td>快绿FCF</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, 美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>干燥剂，硫酸钙</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, 美国</td><td>238910</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮，Ilium Ketamil</td><td>Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, 澳大利亚</td><td></td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪，Ilium Xylazil-20</td><td>Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, 澳大利亚</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸阿托品，Minims 滴眼液</td><td>Bausch &amp; Lomb Pty. Ltd., NSW, 澳大利亚</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸丁卡因，Minims 滴眼液</td><td>Bausch &amp; Lomb Pty. Ltd., NSW, 澳大利亚</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯霉素，Chlorsig 软膏</td><td>Aspen Pharma Pty. Ltd., NSW, 澳大利亚</td><td></td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥，Lethabarb</td><td>Virbac Australia Pty. Ltd., NSW, 澳大利亚</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸利多卡因，Ilium Lignocaine-20</td><td>Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, 澳大利亚</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uni-Core 打孔工具</td><td>World Precision Instruments Inc., FL, 美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>World Precision Instruments Inc., FL, 美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术显微镜，Zeiss OPMI 99</td><td>Zeiss, 西德</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 G 胰岛素针头</td><td>Terumo Corp., 东京, 日本</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont 镊子</td><td>World Precision Instruments Inc., FL, 美国</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过elvax 40w对大鼠视网膜进行缓释药物递送：对慢性疾病治疗的意义

关键词：缓释给药，elvax 40w，大鼠视网膜，慢性疾病，眼内给药，药物递送系统

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

视网膜疾病难以治疗，因为视网膜位于眼球深部。通常需要采用侵入性给药方法来治疗这些疾病。慢性视网膜疾病，如视网膜水肿或新生血管形成，通常需要多次玻璃体内注射才能有效控制病情。然而，随着药物重复注射，相关风险也随之增加。因此，有必要建立替代性给药方法，以尽量减少重复注射带来的风险。已有若干研究开发出可通过缓慢释放化学物质入眼的材料，实现长期药物递送。在本研究中，我们阐述了使用Elvax 40W（一种共聚物树脂）作为药物载体向成年大鼠视网膜递送药物的方法。该树脂经制备并载入药物后，将药物-树脂复合物植入玻璃体腔，使其随时间推移缓慢释放药物。本方法采用2-氨基-4-膦酰丁酸（APB）进行测试，APB是一种谷氨酸类似物，可阻断视网膜的光反应。结果表明，APB从树脂中缓慢释放，并在植入后7天内成功抑制了视网膜反应。这表明，利用该共聚物树脂实现缓释给药对治疗视网膜疾病是有效的，经进一步测试后可能具有治疗应用前景。

采用全视野视网膜电图（ERG）检测APB对视网膜的作用。有关ERG操作的详细信息，请参见以下研究33,34。简言之，在麻醉动物后，将金电极置于眼球角膜上，参考电极置于两眼之间的前额头皮处，以记录视网膜的电活动。刺激信号由电子闪光装置产生，光强范围为10至106 光异构化事件，代表每根视杆细胞中被激活的光敏分子数量。在本实验中，分别于手术后第1天和第7天进行ERG记录。每只动物的右眼植入药物-树脂复合物，而对侧左眼则作为未经治疗的内部对照。
图1 显示了随着每个视杆细胞的光异构化量（φ）增加，b波振幅的变化情况。在对照眼中，随着闪光强度的增加，b波的振幅也随之增大。图1A 给出了植入后1天的视网膜反应记录。植入眼的振幅变化模式与对照眼相似。在106 φ时，两眼之间的振幅差异变得显著不同（p &lt;0.0001）。这表明在这一早期阶段，药物-树脂复合物对视网膜反应尚无影响，直到闪光强度达到较高水平。图1B 展示了植入后...

本文详细介绍了如何使用 Elvax 40W 作为向成年大鼠视网膜递送药物的缓释方法。文中描述了制备、载药及将药物-树脂复合物递送至眼部的实验方案。

通过Elvax 40W对大鼠视网膜进行缓释药物递送：对慢性疾病治疗的意义

关键词：缓释给药，Elvax 40W，大鼠视网膜，慢性疾病，眼内给药，药物递送系统

视网膜疾病难以治疗，因为视网膜位于眼球深处。通常需要侵入性给药方法来治疗这些……

以下实验的总体目标是展示一种相对简单且具有成本效益的方法，以提供持续的药物递送系统，用于治疗眼部慢性疾病。该方法首先制备共聚物树脂颗粒，作为所选药物的载体；第二步，将药物溶液与D混合，形成药物-树脂复合物。接下来，将药物-树脂复合物植入眼内，以确保药物直接递送至视网膜。通过电视网膜检影法获得的结果显示药物成功递送。因此，该技术的应用前景可拓展至慢性视网膜疾病的治疗，因其能够向靶组织直接提供缓释递送。因此，与现有的其他方法（如纳米颗粒、水凝胶和微膜）相比，该技术的主要优势在于操作相对简便且成本低廉，因而可在科学实验室环境中实现。第一步是制备共聚物树脂颗粒。为此，将20 LVA X 40 W颗粒放入一个小玻璃烧杯中。向烧杯中加入足量的100%乙醇，以浸没所有沉淀物。用培菲膜覆盖烧杯，并在室温下浸泡7至10天。完成后，将20个洗涤过的沉淀物转移至通风橱内的另一个玻璃烧杯中。加入 4 毫升二氯甲烷覆盖，并在沉淀物溶解的同时使其溶解约 45 分钟。配制 40 微升您所选药物的溶液，浓度为单次给药所需浓度的三倍。接着，配制 40 微升的亮蓝 FCF 溶液。准备一个干冰容器，用于后续步骤中快速冷冻树脂。准备好后，用移液器吸取40 µL的药物溶液。再用第二支移液器吸取40 µL的快绿溶液。加载后，将两种溶液同时加入烧杯中。使用玻璃搅拌棒快速混合，直至绿色染料在混合物中均匀分布，随后立即将烧杯置于干冰上冷冻10分钟，以快速冻结树脂。接下来，设置蒸发室以蒸发溶剂，并将较大的容器填充至其容量的三分之一。使用硫酸钙颗粒，在颗粒中挖一个凹槽，小心地将烧杯放入凹槽中，使颗粒达到烧杯高度的一半。用封口膜覆盖外部较大的容器，并将蒸发室转移至冰箱中，在负20摄氏度下保存两到三周。为准备用于植入的药物树脂复合物，从冰箱中取出蒸发室，将固化的药物树脂块转移至置于冰上的玻璃培养皿中。使用显微镜的八分之一刻度，利用TR精修工具或打孔工具从组织块上切下一小块，其直径约为0.05毫米，长度约为0.1毫米。所有样品获取完毕后，将剩余组织块用防冻材料包裹，并于-20摄氏度保存以备后续使用。开始前，通过夹捏脚趾确认麻醉动物是否处于适当的麻醉状态。接下来，将动物转移至手术台。手术全程使用一次性针头和无菌器械，应提前准备好。滴入药液以扩张拟手术眼的眼瞳，并给予局部麻醉剂以保持角膜湿润。在瞳孔完全散大后，整个手术过程中均应使用人工泪液。借助手术显微镜，使用一对钝头弯镊固定眼球，并配合25号针头操作。在距离角膜缘约两毫米处进行全层穿刺，以到达玻璃体。使用精细镊子将预先制备好的药物-树脂复合物插入穿刺伤口内。术后涂抹抗生素软膏，以预防细菌感染。观察动物直至其完全恢复。请注意，根据所给予眼部的药物，可能需要使用镇痛剂。应依据所选药物的不良反应情况，必要时按照批准的伦理方案，并遵循项目负责人（PI）指定兽医的建议，使用镇痛

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医学

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