Name: 保利的静电纤维支架（甘油 - 十二双）工程神经组织从小鼠胚胎干细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 学习利用静电纺丝技术制备聚甘油-十二双酸酯长纤维支架，用于小鼠胚胎干细胞的培养与神经分化。该方法为组织工程和再生医学提供了新型生物材料解决方案。

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本工作在佛罗里达国际大学生物医学工程系的设施中完成。

1. 静电纺丝收集器设置
<ol>
	<li>将铝箔剪成矩形片状。</li>
	<li>将矩形片折叠成矩形条状，并用胶带将其垂直固定在一块平板金属板上（图1）。注意：纤维膜的尺寸取决于条带的长度和宽度，因此可根据需要调整条带的尺寸。</li>
</ol>
2. 聚合物溶液的制备
<ol>
	<li>在烧杯中将甘油与十二烷二酸（DDA）按1:1的摩尔比在120 °C下混合反应100小时，以获得PGD聚合物。</li>
	<li>在15 ml离心管中，按1.5:3:95.5的质量比将聚环氧乙烷（PEO）和明胶溶解于65%乙醇中，盖紧管盖，并在60 °C烘箱中加热搅拌1小时，直至形成均一溶液（基础溶液）。</li>
	<li>用于静电纺丝时，将PGD聚合物与基础溶液按4:6的质量比混合。注意：PGD浓度对纤维直径有显著影响。使用30%-50%的PGD可制备出长度超过5 cm且纤维直径增大的纤维。</li>
	<li>向聚合物溶液中加入0.1%的核黄素，充分混匀。</li>
</ol>
3. 电纺丝
<ol>
	<li>将聚合物溶液注入带有18 G钝头不锈钢针头的5 ml标准注射器中。</li>
	<li>将注射器插入注射泵。</li>
	<li>将高压电源的接地端连接至金属板，正极导线连接至针头。</li>
	<li>调节针头与铝箔条之间的距离至15 cm。</li>
	<li>将注射泵放置成与水平方向约成15°角，以防止纤维在铝箔条前端聚集。</li>
	<li>启动注射泵，并将泵的流速调节至0.6 ml/hr。</li>
	<li>开启高压电源，并将工作电压设定为14.6 kV。</li>
</ol>
4. 纤维处理
<ol>
	<li>收集完成后，将纤维膜暴露于紫外光下 60 分钟以进行交联。</li>
	<li>将纤维膜从铝箔条转移至 100&#160;mm 培养皿中，并再次暴露于紫外光下 20 分钟以进行灭菌。</li>
	<li>在生物安全柜中，使用手术刀将纤维膜切割成大小相同的圆形片状，并将这些片状物放入 24 孔板中。</li>
	<li>进行细胞预接种处理时，将纤维样品浸入 1 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）中，并在 37 °C 下孵育过夜。</li>
	<li>次日，小心吸除 PBS，每孔加入 1 ml 分化培养基（DMEM/F12、N2 和 FGF2）（参见材料表中的配方），并在 37 °C 下孵育 3 小时。</li>
	<li>小心吸除分化培养基，每份纤维样品中加入 0.2 ml Matrigel，在 37 °C 下孵育 30 分钟。注意：也可使用层粘连蛋白（laminin）进行纤维涂层处理。向纤维中加入 0.2 ml 浓度为 20 µg/ml 的层粘连蛋白，在室温下孵育 3 小时。</li>
	<li>小心移除各孔中多余的 Matrigel，用 2 ml 分化培养基冲洗一次。注意：纤维样品现已准备好用于细胞培养。</li>
</ol>
5. 纤维上的细胞接种
<ol>
	<li>向mES细胞培养皿中加入1 ml的Accutase，于37 °C孵育10分钟。</li>
	<li>10分钟后，mES细胞从培养皿上脱落。向培养板中加入4 ml分化培养基，收集悬浮的mES细胞至15&#160;ml离心管中，并反复吹打细胞约15次以分散细胞团块。</li>
	<li>以400 x&#160;g离心5分钟，弃上清，将细胞重悬于4 ml分化培养基中。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。取200 µl细胞悬液转移至15 ml离心管中，用分化培养基稀释10倍&#160;。取15 µl稀释后的细胞悬液加入已放置盖玻片的血细胞计数板计数室中。在显微镜下计数血细胞计数板中央1 mm方格及其四个角的方格内的细胞数。注意：每毫升细胞数 = 每个方格平均细胞数 ×&#160;稀释倍数 ×&#160;104</li>
	<li>每孔接种约5 × 104个mES细胞。将细胞悬液缓慢滴加至纤维样品中央，避免液体流向孔边缘，以防溶液从纤维膜上流失。</li>
	<li>每孔加入1 ml分化培养基，将培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中，以促进细胞贴附、生长和分化。</li>
	<li>每隔一天吸除各孔中的旧培养基，更换为1 ml新鲜分化培养基。</li>
</ol>
6. 细胞活力
<ol>
	<li>吸出每孔中的旧培养基。</li>
	<li>混合 1/10th 将Resazurin荧光试剂与培养基按体积混合，每孔加入1 ml。</li>
	<li>37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育2 4小时，避免直接光照。</li>
	<li>孵育4小时后，从每个孔中转移100 µl 3倍浓度的试剂至96孔板中，随后即可使用荧光分光光度计在激发波长560 nm、发射波长590 nm的滤光片条件下测定样品。</li>
</ol>
7. 实时 PCR
<ol>
	<li>培养14天后，向样品中加入裂解缓冲液，从纤维样品上的细胞中提取总RNA。</li>
	<li>使用4 µl总RNA，在20 µl反应体系中通过逆转录合成cDNA。</li>
	<li>在每个光学管中配制PCR反应混合液：10 µl Master Mix（2x）、0.2 µl染料、8 µl无核酸酶水、1 µl cDNA和1 µl引物（本研究使用的引物列于表1中）。</li>
	<li>设置PCR程序：a. 95 °C 2分20秒，1个循环；b. 95 °C 3秒→60 °C 1分钟，40个循环；c. 95 °C 15秒，1个循环；d. 60 °C 1分钟，1个循环；e. 95 °C 15秒，1个循环。选择比较CT法以确定相对基因表达水平。</li>
	<li>PCR结束后，使用StepOne软件分析实时PCR结果，并将结果导出至Excel。</li>
</ol>

<ol><li>Migneco, F., Huang, Y. -C., Birla, R. K., Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly+%28glycerol-dodecanoate%29%2C+a+biodegradable+polyester+for+medical+devices+and+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Poly (glycerol-dodecanoate), a biodegradable polyester for medical devices and tissue engineering scaffolds.</a> Biomaterials. 30, 6479-6484 (2009).</li>
<li>Reneker, D. H., Yarin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+jets+and+polymer+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Electrospinning jets and polymer nanofibers.</a> Polymer. 49, 2387-2425 (2008).</li>
<li>Wang, Y., Ameer, G. A., Sheppard, B. J., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tough+biodegradable+elastomer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A tough biodegradable elastomer.</a> Nature biotechnology. 20, 602-606 (2002).</li>
<li>Panunzi, S., De Gaetano, A., Mingrone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approximate+linear+confidence+and+curvature+of+a+kinetic+model+of+dodecanedioic+acid+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+And+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Approximate linear confidence and curvature of a kinetic model of dodecanedioic acid in humans.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology And Metabolism. 289, (2005).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apparatus+for+preparing+electrospun+nanofibers%3A+designing+an+electrospinning+process+for+nanofiber+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Internationa+l%22%5BJournal%5D)">Apparatus for preparing electrospun nanofibers: designing an electrospinning process for nanofiber fabrication.</a> Polymer Internationa l. 56, 1361-1366 (2007).</li>
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<li>Li, W. -J., Mauck, R. L., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibrous+scaffolds%3A+production%2C+characterization%2C+and+applications+for+tissue+engineering+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibrous scaffolds: production, characterization, and applications for tissue engineering and drug delivery.</a> Journal of Biomedical Nanotechnology. 1, 259-275 (2005).</li>
<li>Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+of+polymeric+nanofibers+for+tissue+engineering+applications%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: a review.</a> Tissue engineering. 12, 1197-1211 (2006).</li>
<li>Lim, S. H., Mao, H. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+scaffolds+for+stem+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">Electrospun scaffolds for stem cell engineering.</a> Advanced drug delivery reviews. 61, 1084-1096 (2009).</li>
<li>Lowery, J. L., Datta, N., Rutledge, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+fiber+diameter%2C+pore+size+and+seeding+method+on+growth+of+human+dermal+fibroblasts+in+electrospun+poly+%28epsilon-caprolactone%29+fibrous+mats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of fiber diameter, pore size and seeding method on growth of human dermal fibroblasts in electrospun poly (epsilon-caprolactone) fibrous mats.</a> Biomaterials. 31, 491-504 (2010).</li>
<li>Tillman, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+stability+of+electrospun+polycaprolactone-collagen+scaffolds+in+vascular+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The in vivo stability of electrospun polycaprolactone-collagen scaffolds in vascular reconstruction.</a> Biomaterials. 30, 583-588 (2009).</li>
<li>Ju, Y. M., Choi, J. S., Atala, A., Yoo, J. J., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilayered+scaffold+for+engineering+cellularized+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bilayered scaffold for engineering cellularized blood vessels.</a> Biomaterials. 31, 4313-4321 (2010).</li>
<li>McCullen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+collagen+polymerization+of+layered+cell-seeded+electrospun+scaffolds+for+bone+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ collagen polymerization of layered cell-seeded electrospun scaffolds for bone tissue engineering applications.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 16, 1095-1105 (2010).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

目前用于静电纺丝的简单收集器存在局限性，而旋转收集器又结构复杂，这些因素均使其难以获得某些应用所需的纤维膜长度和尺寸。此外，将纤维从接地收集器转移至培养皿或其他基底上也是一大挑战5。本报告介绍了一种新设计的收集器，该收集器仅通过将一条铝箔带连接到接地收集器上即可制成，能够一次性获得最大尺寸达10 cm × 20 cm的大型纤维膜。图1和图2展示了用于制备长度达10 cm、且纤维膜宽度可控的静电纺丝装置的示意图。在针尖与收集器之间的静电场作用下，静电纺丝纤维被拉伸并跨越铝箔带与接地收集器之间的区域，形成平整的纤维膜，且可轻松转移至其他基底。静电纺丝纤维可提供多孔纤维结构，使细胞能够在真正三维环境中跨越并附着于多根纤维上。本研究中制备的纤维膜尺寸足够大，使其成为伤口愈合和神经再生等多种应用的理想候选材料。
通过调控静电纺丝过程中的多个变量，可调节纤维的直径。这些变量包括聚合物浓度、施加电压的大小、聚合物输送速率、针头与收集器之间的距离等6-8。在本研究中，分别配制了由50% ...

静电纺丝是一种制备微米至纳米级纤维支架的有效加工方法。其基本原理是在针头尖端与接地收集器之间施加高电压，使溶液在针头出口处形成泰勒锥。当溶液中的静电排斥力超过表面张力时，带电液流便从针尖喷射而出，在空气中飞行过程中伴随溶剂挥发，最终沉积在接地的收集器上。注射泵可提供持续流出的溶液，从而在短时间内制备大量静电纺丝纤维。在从喷丝口离开至到达收集器的过程中，带电射流会根据多种参数发生拉伸和鞭动，这些参数包括聚合物溶液的黏度和表面张力、溶液中的静电力以及外加电场的相互作用等2。
在静电纺丝过程中，收集器作为导电基底，用于沉积微米至纳米级纤维。本研究设计了一种新型纤维收集器，以获得具有特定尺寸（长度 × 宽度）的纤维膜。传统上使用铝箔作为收集器，但将纤维从平整表面转移至其他基底较为困难。从传统收集器上完整采集纤维膜的难点主要在于，静电纺丝纤维会牢固地附着在收集器表面。因此，我们对收集器进行了改进，将一片铝箔折叠成矩形条状，并将其垂直固定于一块平板金属上。静电纺丝纤维被拉伸在该铝箔条尖端与金属板之间的区域，从而可轻松转移至其他基底。
由于Robert Langer研究团队的开创性工作，热交联弹性体聚合物正受到越来越多的关注。该团队于2002年首次引入了聚癸二酸甘油酯（PGS），这是一种类似于硫化橡胶的聚酯材料&#160;3。与PGS类似，我们通过甘油与十二烷二酸的热缩合反应成功合成了聚甘油-十二烷二酸酯（PGD），并证实其具有独特的形状记忆性能1。与较硬的合成材料聚羟基丁酸酯或聚-L-乳酸（杨氏模量分别为250 MPa和660 MPa）不同，PGD表现出类似橡胶的弹性特性，在温度高于37 °C时其杨氏模量为1.08 MPa，与体内周围神经组织（0.45 MPa）的力学性能接近。此外，PGD具有生物可降解性，且其降解时间可通过调节甘油与十二烷二酸的比例进行精确调控。十二烷二酸是一种含有两个末端羧基的十二碳化合物，分子式为HOOC(CH2)10COOH。像癸二酸和十二烷二酸这类偶数碳链的二羧酸可被代谢为乙酰辅酶A，并进入三羧酸（TCA）循环（即柠檬酸循环）。二羧酸的代谢产物琥珀酰辅酶A是糖异生的前体物质，也是TCA循环的中间产物4。因此，一些研究认为它们可作为肠内或肠外营养的替代能量底物，尤其适用于病理状态下的营养支持。此外，PGD具有独特的形状记忆效应，因其玻璃化转变温度为31 °C，因此在室温和体温条件下表现出显著不同的力学性能。&#160;综上所述，PGD具有生物可降解性、生物相容性，并表现出与神经组织相似的独特弹性力学性能，因此是神经组织工程应用的理想材料。在本实验方案中，利用新设计的收集装置，通过静电纺丝技术制备了大面积连续分布的PGD长纤维。这些纤维支架能够支持小鼠多能干细胞的生长与分化。

<table><tbody><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>十二烷二酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1009</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1890</td><td></td></tr><tr><td>聚环氧乙烷（PEO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>182028</td><td></td></tr><tr><td>核黄素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>132350250</td><td>0.10%</td></tr><tr><td>小鼠胚胎干细胞</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-5002</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Becton Dickinson</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30272.02</td><td></td></tr><tr><td>N2添加剂</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td>1%</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Stemgent</td><td>03-0002</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Invitrogen</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>刃天青荧光染料</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62758-13-8</td><td></td></tr><tr><td>SV总RNA提取系统</td><td>Promega</td><td>Z3100</td><td></td></tr><tr><td>GoScript反转录系统</td><td>Promega</td><td>A5000</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq qPCR预混液</td><td>Promega</td><td>A6001</td><td></td></tr><tr><td>注射泵&amp;nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>14-831-200</td><td></td></tr><tr><td>高压电源&amp;nbsp;</td><td>Spellman High Voltage Electronics Corporation</td><td></td><td>SL30</td></tr><tr><td>紫外光</td><td>Philips</td><td>308643</td><td>15W/G15T8</td></tr><tr><td>Synergy HT多功能微孔板读板仪</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer GeneAmp PCR系统9600</td><td>Perkin Elmer</td><td>8488</td><td></td></tr><tr><td>StepOne实时荧光定量PCR系统</td><td>Applied Biosystems</td><td>4376357</td><td></td></tr></tbody></table>

聚（甘油-十二烷二酸）电纺纤维支架用于小鼠胚胎干细胞构建神经组织

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

在组织工程应用中，制备可生物降解且生物相容性的支架是最理想但具有挑战性的任务。&#160;在各种制备方法中，静电纺丝因其简便性和多功能性而成为最具吸引力的方法。此外，静电纺丝制备的纳米纤维可模拟天然细胞外基质的尺寸，从而为细胞的存活和生长提供额外支持。本研究展示了利用新设计的静电纺丝收集装置，制备一种名为聚（甘油-十二烷酸酯）（PGD）1的新型可生物降解且生物相容性聚合物的长纤维，并使其跨越更大沉积面积的可行性。&#160;PGD 具有独特的弹性，其力学性能与神经组织相似，因此适用于神经组织工程应用。用于制备纤维支架材料的合成与制备过程简单、高度可重复且成本低廉。在生物相容性测试中，源自小鼠胚胎干细胞的细胞能够黏附并在静电纺丝 PGD 纤维上生长。综上所述，本方案提供了一种多功能的制备方法，可用于制造 PGD 静电纺丝纤维，以支持小鼠胚胎干细胞来源的神经谱系细胞的生长。

静电纺丝的主要组件如图1所示。通常通过垂直附着的铝箔条和平板金属板获得大面积的纤维膜。图2展示了收集装置的设计以及静电纺丝纤维膜。其宽度和长度可根据不同应用进行调节。使用PGD聚合物与基础溶液混合物制备的纤维长度可达10 cm。静电纺丝纤维的形貌如图3所示。由40% PGD浓度制得的纤维直径处于微米级。在纤维上培养3天和6天后，由小鼠胚胎干细胞（mES细胞）分化而来的细胞的共聚焦显微镜图像如图4所示。绿色荧光信号来源于细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的过表达。图5中Resazurin荧光试剂的结果显示，在经Matrigel和层粘连蛋白（laminin）包被的PGD纤维上生长的mES细胞具有相当的细胞活力，并且相较于未包被组表现出相对更高的增殖能力。多能性及神经细胞标志物的基因表达通过实时PCR进行定量分析（图6）。大多数在纤维上培养的mES细胞表达多能性标志物OCT4、Nanog和Sox2，而少数细胞表达神经干细胞标志物PAX6和Nesti...

报道了一种通过新设计的收集装置，由新型可生物降解聚合物聚（甘油-十二烷酸酯）（PGD）制备电纺长纤维并使其跨越更大沉积区域的合成与制备方法。这些纤维能够支持源自小鼠多能干细胞的细胞生长。

在组织工程应用中，制备可生物降解且生物相容的支架是最理想但具有挑战性的任务。其中……

该实验步骤利用一种名为聚甘油二油酸酯八（poly glycerol Dote Cano eight）的新型可生物降解聚合物，制备电纺长纤维。首先，安装新设计的收集装置，并使用注射器和泵将聚合物溶液输送至电纺装置，以制备用于电纺的聚合物溶液。随后，将所得的纤维膜转移至培养皿中进行交联处理。接下来将小鼠胚胎干细胞接种到切割后的纤维上。最终结果表明，小鼠胚胎干细胞能够在纤维支架上存活并分化为神经细胞。在本期视频中，我们向您展示了如何从合成细胞制备开始制备生物材料，并最终利用这些电纺纤维进行细胞培养。特别是当我们结合多能干细胞来源的细胞并进行染色时，这些细胞在未来可能在细胞递送以及构建功能性组织方面具有非常重要的应用。今天她将向你们演示一种令人震惊的实验操作。她是我实验室里最重要的成员。将铝箔剪成一个矩形片。将该矩形片折叠成一条矩形条带，并用胶带将其垂直固定在一块平板金属板上。条带的长度取决于聚合物溶液所需纤维膜的尺寸。将甘油与十二烷二酸按1:1的摩尔比在120°C下混合反应100小时，得到聚甘油-十二烷酸聚合物。将聚乙烯氧化物和明胶按1.5:3:95.5的质量比溶解于65%乙醇中，在15毫升离心管中进行。拧紧瓶盖，将混合物置于60摄氏度的烘箱中加热1小时，每15分钟搅拌一次，直至基础溶液均匀。进行电纺丝时，将PGD聚合物与基础溶液混合。按4至6的质量比，向混合物中加入0.1%核黄素，并充分混合。将聚合物溶液注入带有18号钝头不锈钢针头的5毫升标准注射器中。然后将注射器插入注射泵。将高压电源的接地端连接至金属板，正极连接至针头。同时，调整针头与铝箔之间的距离。剥离至15厘米处。现在将注射泵放置成与水平方向约15度的夹角，以防止纤维在条带前端聚集。打开注射泵，并将泵的流速调节至0.6毫升每小时。开启高压电源，将工作电压设置为14.6千伏。收集完成后，将纤维膜暴露于紫外光下，进行60分钟的交联处理。将纤维膜从铝箔条转移到100毫米的培养皿中。使用手术刀将纤维膜切割成相同大小的圆形片状，并将这些片放入24孔板中。然后将24孔板暴露于紫外光下，再进行20分钟的灭菌处理，以备后续细胞实验。将纤维样品浸入1毫升磷酸盐缓冲液中，于37摄氏度孵育过夜。次日小心吸除PBS。每孔加入1毫升分化培养基，在37摄氏度孵育3小时。小心吸除分化培养基后，向每份纤维样品中加入 0.2 毫升 Matrigel，并在 37 摄氏度孵育 30 分钟。小心移除每份样品中多余的 Matrigel。用 2 毫升分化培养基轻轻冲洗一次。10 分钟后，在 37 摄氏度条件下，向小鼠胚胎干细胞培养皿中加入 1 毫升 tase。当 MES 细胞脱落时，加入 4 毫升分化培养基。将悬浮的 MES 细胞收集至 15 毫升离心管中，在 400 ×g 条件下离心 5 分钟。将沉淀的细胞重悬于 4 毫升分化培养基中。取 200 微升细胞悬液转移至 15 毫升离心管中，并加入 10 倍体积的分化培养基。取 15 微升稀释后的细胞悬液加入血细胞计数板的计数室中。盖上盖玻片后，计数血细胞计数板中央1毫米方格及四个角的方格中的细胞。随后，将5 × 10⁴个鼠胚胎干细胞缓慢滴加至纤维样品中央。向每个孔中加入1毫升分化培养基，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养，以促进细胞贴壁。细胞生长与分化。每隔一天更换1毫升分化培养基。为检测细胞活力，从每个孔中吸除旧培养基，加入一毫升培养基中稀释10倍的ABRE和荧光试剂。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下避光孵育四小时。随后将每个孔中的100微升三份样本转移至96孔板，通过荧光扫描检测。采用扫描电子显微镜图像评估电纺纤维的形貌。这些由40% PGD浓度制备的纤维直径在微米范围内。将分化的小鼠胚胎干细胞在纤维上培养三天，并利用共聚焦显微镜观察过表达的绿色荧光蛋白。第六天绿色荧光细胞数量的增加表明，纤维支架能够支持细胞黏附和细胞增殖。Zu 和荧光检测结果表明，使用 Matrigel 和层粘连蛋白（laminin）包被后，细胞活力相当，且增殖水平相对较高。通过实时 PCR 在第 1 天定量分析了 Flury 效能和神经细胞标志物。大多数在纤维上培养的 MES 细胞表达了多能性标志物。OCT4、Nanog 和 SOX2。少数细胞亚群表达神经干细胞标志物PAC6和nestin。培养两周后，一些神经细胞标志物（如MAP2和DCX）以及少突胶质细胞标志物Oligo1和星形胶质细胞标志物的表达水平有所升高。GFAP 一旦掌握，若操作得当，该技术可在两到三个小时内完成。

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保利的静电纤维支架（甘油 - 十二双）工程神经组织从小鼠胚胎干细胞

本文介绍了用于组织工程和细胞培养的聚合物电纺丝技术。具体描述了具有光反应性大分子单体的电纺丝过程，以及进一步的光图案化和多聚合物电纺丝加工能力。...

用于组织工程与细胞培养的电纺纤维聚合物支架

取向排列的静电纺丝纤维可引导神经元在体外的生长，是神经再生支架的潜在组成部分。本文描述了一种制备静电纺丝纤维基底以及在无血清条件下培养原代大鼠E15感觉（DRG）和运动神经元的方法。还包括通过免疫细胞化学对神经元进行可视化观察的技术。...

在电纺聚-L-乳酸纳米纤维支架上使用限定培养基培养初级运动神经元和感觉神经元

本研究详细阐述了用于培养和诱导多能干细胞分化的三维纤维蛋白支架的制备方法。此类支架可用于筛选各种生物化合物对干细胞行为的影响，也可进行改造以包含药物递送系统。...

用于干细胞培养应用的3D纤维蛋白支架的制备

本文描述了利用自组装三维支架培养人类神经前体细胞的方法。我们提供了一种从支架中释放细胞的方案，以便后续对细胞进行分析，例如通过流式细胞术。该方案可适用于其他细胞类型，以开展深入的机制性研究。...

三维自组装肽水凝胶中人类神经前体细胞的培养

静电纺丝支架可在制备后进行加工，以用于组织工程应用。本文介绍了制备复杂结构支架的方法（通过连续纺丝）、制备更厚支架的方法（通过多层叠加并采用热处理或蒸汽退火）、实现无菌性的方法（无菌制备或制备后灭菌），以及获得适宜生物力学性能的方法。...

组织工程用静电纺丝纤维的后期加工处理

本方案结合静电纺丝与微球技术，构建可引导神经元生长的组织工程支架。将神经生长因子包裹于PLGA微球中，并将其静电纺丝至透明质酸（HA）纤维支架内。通过在支架上接种原代鸡背根神经节并培养4-6天，检测蛋白质的生物活性。...

电纺将生长因子释放微球融入纤维支架

本文介绍一种制备具有纤维梯度排列的电纺纳米纤维支架的方案，并探讨其在调控细胞形态与取向中的应用。纳米纤维支架在物理和化学性质上的梯度特征在生物医学领域具有广泛的应用前景。...

具有纤维排列梯度的电纺纳米纤维支架

深入了解大脑复杂的活动需要先进的研究工具。在此，我们展示了一种基于丝素-胶原蛋白的新型三维神经组织工程模型，其结构类似于大脑组织。该模型可用于研究神经元网络的组装、轴突导向、细胞间相互作用以及电活动。...

基于丝素蛋白-胶原的极化神经组织工程化三维模型

本文介绍了一种大鼠脑源性胶质细胞（包括星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞）的三维培养方案。我们展示了原代细胞培养、甲基丙烯酰化透明质酸（HAMA）水凝胶的合成、HAMA光聚合与细胞包封，以及用于共聚焦显微镜和扫描电子显微镜成像的样品处理方法。...

改进的原代胶质细胞三维水凝胶培养方法 体外 神经炎症建模

本方案描述了一种细胞培养系统的制备方法，旨在实现将干细胞接种于导电聚合物支架上 体外 电刺激及后续 体内 采用微创技术植入接种干细胞的支架。...

可电传导支架用于调控与递送干细胞

学习利用静电纺丝技术制备聚甘油-十二双酸酯长纤维支架，用于小鼠胚胎干细胞的培养与神经分化。该方法为组织工程和再生医学提供了新型生物材料解决方案。

聚（甘油-十二烷二酸）电纺纤维支架用于小鼠胚胎干细胞构建神经组织

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