Name: 人类iPS细胞的微小RNA表达谱，视网膜色素上皮衍生自IPS和胎儿视网膜色素上皮 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 了解人类iPS细胞、iPS来源视网膜色素上皮与胎儿视网膜色素上皮的微小RNA表达谱差异。本方法通过微阵列分析揭示细胞发育与基因调控机制，为视网膜再生医学研究提供重要依据。

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本文作者的观点或主张仅为个人见解，不应被视为官方立场，也不应解释为美国陆军部或国防部的观点。
本研究是在作者 Whitney A. Greene、Alberto Muñiz 和 Ramesh R. Kaini 于美国陆军医学研究与发展司令部（USAISR）担任国家研究委员会博士后研究协会成员期间完成的。
微阵列实验由位于圣安东尼奥的德克萨斯大学健康科学中心Greehey儿童癌症研究中心微阵列核心实验室和生物信息学部门完成。
本工作由美国陆军临床康复医学研究计划（CRMRP）和军事作战医学研究计划（MOMRP）资助。

1. 培养试剂和培养板的准备
<ol>
	<li>mTeSR1 培养基：按照生产商说明配制 mTeSR1 培养基。在 4 °C 下过夜解冻 100 ml mTeSR1 5x 添加剂。将 100 ml mTeSR1 5x 添加剂加入 400 ml mTeSR1 基础培养基中，充分混匀。该培养基在 4 °C 可稳定保存最多 2 周，在 -20 °C 可保存 6 个月。</li>
	<li>分化培养基：在 DMEM/F12 中配制分化培养基，使其终浓度为 0.1 mM β-巯基乙醇、0.1 mM 非必需氨基酸、2.0 mM L-谷氨酰胺、10% 去除血清（knockout serum）和 10 µg/ml 庆大霉素。</li>
	<li>iPS-RPE 培养基：在 MEM 中配制 iPS-RPE 培养基，使其终浓度为 1x N1 添加剂、0.1 mM 非必需氨基酸、250 µg/ml 牛磺酸、13 ng/ml 三碘甲腺原氨酸钠盐、20 ng/ml 氢化可的松、5 µg/ml 庆大霉素和 15% FBS26。</li>
	<li>三碘甲腺原氨酸钠盐储备液：配制储备液时，将 1.0 mg 三碘甲腺原氨酸钠盐溶于 1 N 氢氧化钠中，轻轻旋转混匀。然后加入 49.0 ml 基础培养基，定容至 50.0 ml，得到浓度为 20 µg/ml 的三碘甲腺原氨酸钠盐溶液。分装后于 -20 °C 冻存备用。使用时根据需要加入适当体积以达到最终培养基中的目标浓度。</li>
	<li>氢化可的松储备液：配制氢化可的松储备液时，将 1 mg 氢化可的松溶于 1 ml 无水乙醇中，轻轻振荡助溶。然后加入 19.0 ml 基础培养基，定容至 20 ml，得到浓度为 50 µg/ml 的氢化可的松储备液。分装后于 -20 °C 冻存备用。使用时根据需要加入适当体积以达到最终培养基中的目标浓度。</li>
	<li>胎儿 RPE 生长培养基：按照生产商说明，将 RTEGM 试剂盒中的所有组分加入基础培养基中混合配制生长培养基，但不添加 FBS。</li>
	<li>胎儿 RPE 接种培养基：取少量生长培养基转移至无菌容器中，加入 FBS 至终浓度为 2%，即为接种培养基。</li>
	<li>Dispase 溶液：在 DMEM/F12 中配制浓度为 1 mg/ml 的 Dispase 工作液。</li>
	<li>Matrigel 包被板：在 DMEM/F12 中将 Matrigel 配制成 0.08 mg/ml 的溶液。</li>
	<li>用 1.0 ml Matrigel 溶液包被 6 孔板的每个孔。</li>
	<li>将包被好的板在室温下孵育 1.0 小时。</li>
	<li>孵育 1.0 小时后，吸除多余的 DMEM/F12 溶液。</li>
	<li>加入 0.5 ml mTeSR1 培养基以防止干燥。Matrigel 包被板现已可使用。</li>
</ol>
2. iPS 细胞培养
<ol>
	<li>在接种iPS细胞之前，准备好所有离心管，将mTESR1培养基升温至室温，并准备好包被有Matrigel的培养板。</li>
	<li>在37 °C水浴中快速解冻IMR90-4 iPS细胞。然后将冻存管从水浴中取出，并用70%乙醇进行表面消毒。</li>
	<li>使用2 ml移液器将细胞转移至15 ml锥形离心管中，以尽量减少细胞团聚物的破碎。</li>
	<li>逐滴加入5 ml预热的mTeSR1培养基，轻柔混匀。在室温下以300 × g离心5分钟，然后弃去上清液。</li>
	<li>用2 ml mTeSR1培养基小心重悬细胞团聚物，并将细胞接种至六孔板的一个孔中。</li>
	<li>将培养板放入37 °C培养箱中，在5% CO2、95%湿度条件下培养。</li>
	<li>每天更换iPS细胞培养基。接种后5–7天可见未分化克隆。检查是否出现适合传代的未分化克隆（中心致密的克隆）。</li>
</ol>
3. iPS 细胞的传代
<ol>
	<li>在开始传代iPS细胞之前，将所有离心管、dispase溶液、DMEM/F12和mTeSR1培养基预热至室温，并准备好包被有Matrigel的培养板。</li>
	<li>传代iPS细胞前，通过刮除分化区域并吸除培养基来去除任何已分化的区域。为保证高质量的培养，分化区域应控制在孔内面积的20%以下。用2 ml DMEM/F12小心冲洗含有iPS细胞的孔，并向每孔加入1 ml浓度为1 mg/ml的dispase溶液。</li>
	<li>在37 °C孵育7分钟。吸除dispase溶液，并用2 ml DMEM/F12轻轻冲洗细胞集落两次。</li>
	<li>冲洗后，向每孔加入2 ml mTeSR1培养基。</li>
	<li>使用5 ml移液器轻轻刮取培养板上的细胞集落，使其形成细胞团块。</li>
	<li>将脱落的细胞集落转移至15 ml锥形管中。加入足量的mTeSR1培养基，用于接种下一次传代的细胞。</li>
</ol>
4. 将iPS细胞分化为iPS-RPE
<ol>
	<li>将iPS细胞接种至新包被的培养板中，使用mTESR1培养基。</li>
	<li>让iPS细胞集落体外培养扩增4-5天。</li>
	<li>将mTeSR1培养基更换为4 ml分化培养基，每3&#160;天更换一半培养基。</li>
	<li>继续培养至色素灶生长至足够大，可进行手动显微解剖分离（约40-50天）。</li>
	<li>使用200 µl移液枪头在色素集落周围切割并将其提起。</li>
	<li>收集解剖下来的集落，并置于15 ml锥形离心管中合并。</li>
	<li>向合并的RPE细胞中加入5 ml DMEM/F12培养基，以300 × g离心5分钟，重复两次。</li>
	<li>通过将合并的iPS-RPE细胞与0.25%胰蛋白酶EDTA共同孵育，制备单细胞悬液。</li>
	<li>用iPS-RPE培养基清洗iPS-RPE细胞，将收集的细胞以4 ml iPS-RPE培养基接种至新包被Matrigel的培养孔中。</li>
	<li>细胞传代前培养3周，每3&#160;天更换一次培养基。实验时以100,000个细胞/cm2的密度接种iPS-RPE细胞，于第17天收集细胞，以接种当天为第0天。</li>
</ol>
5. 样本采集
<ol>
	<li>iPS 细胞收集
	<ol>
		<li>培养 iPS 细胞，直至观察到未分化集落中心区域密集。</li>
		<li>用 DMEM/F12 洗涤集落。</li>
		<li>使用 accutase 将细胞解离为单细胞。将细胞收集至 15 ml 圆底离心管中，在 300 × g 条件下离心 5 分钟。吸除上清液，加入 2 ml DMEM/F12 重悬细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胎儿 RPE 细胞收集
	<ol>
		<li>用 DMEM/F12 洗涤胎儿 RPE 细胞培养物，并使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 将细胞解离为单细胞。</li>
		<li>将细胞收集至 15 ml 圆底离心管中，在 300 × g 条件下离心 5 分钟。吸除上清液，加入 2 ml DMEM/F12 重悬细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>iPS-RPE 细胞收集
	<ol>
		<li>当 iPS-RPE 细胞传代至第 3 代和第 5 代时，在传代后第 17 天收集细胞。用 PBS 洗涤 iPS-RPE 细胞两次，加入 1.0 ml 0.25% 胰蛋白酶孵育，制备单细胞悬液。</li>
		<li>加入 2 ml 冰冷的 iPS-RPE 培养基以中和胰蛋白酶活性。</li>
		<li>将细胞收集至 15 ml 圆底离心管中，在 300 × g 条件下离心 5 分钟。吸除上清液。</li>
		<li>将细胞悬液用磁珠分选试剂盒中的染色缓冲液重悬于 3 ml 中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 去除未分化细胞的iPS-RPE阴性筛选
<ol>
	<li>使用前将所有试剂保持在 4 °C，但操作时勿置于冰上。将步骤 5.3.4 中的细胞悬液在 300 × g 离心 5 分钟。吸除上清液。</li>
	<li>每 2 × 106 个细胞用 100 μl 微珠试剂盒中的染色缓冲液重悬细胞。</li>
	<li>每 2 × 106 个细胞加入 10 μl Anti-TRA-1-60-PE 抗体。</li>
	<li>充分混匀，在 4 °C 孵育 10 分钟。</li>
	<li>每 2 × 106 个细胞用 1–2 ml 缓冲液洗涤细胞，在 300 × g 离心 10 分钟。吸除上清液。</li>
	<li>每 2 × 106 个细胞用 80 μl 染色缓冲液重悬细胞。每 2 × 106 个细胞加入 20 μl 试剂盒中的抗-PE 标记微珠。充分混匀。在 4 °C 孵育 15 分钟。</li>
	<li>每 2 × 106 个细胞加入 1–2 ml 染色缓冲液。在 300 × g 离心 10 分钟。吸除上清液。</li>
	<li>将细胞重悬于 500 μl 染色缓冲液中。</li>
	<li>磁性细胞分离：
	<ol>
		<li>将层析柱置于磁性细胞分选器中。用 3 ml 染色缓冲液冲洗层析柱。</li>
		<li>将步骤 6.8 的细胞悬液加至层析柱上。</li>
		<li>在负极出口处放置收集管，用于收集 TRA-1-60 阴性细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 总RNA提取
<ol>
	<li>使用专为核酸小量制备设计的商用微型离心柱式均质化器，裂解细胞。</li>
	<li>使用可保留小RNA分子的商用RNA提取试剂盒，从iPS细胞、iPS-RPE和胎儿RPE中提取总RNA27。</li>
	<li>使用Nanodrop分光光度计测定总RNA浓度。</li>
</ol>
8. 生物分析仪与微阵列实验
<ol>
	<li>使用Bioanalyzer结合市售RNA质量检测试剂盒检测RNA完整性。</li>
	<li>将100 ng总RNA与小牛肠碱性磷酸酶在37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>使用100% DMSO在100 °C变性RNA 5分钟。</li>
	<li>利用T4连接酶在16 °C孵育1小时，用pCp-Cy3标记样品。</li>
	<li>在8_x_15K格式的人类miRNA芯片上进行杂交。</li>
	<li>根据制造商说明书洗涤芯片，并使用扫描仪以5 µm分辨率进行扫描。</li>
	<li>使用与miRNA微阵列兼容的微阵列特征提取软件获取数据。</li>
	<li>处理miRNA信号，以确定各样本中miRNA的相对表达水平。</li>
	<li>比较各组样品间每个miRNA的表达水平。选择表达差异至少两倍的miRNA进行进一步分析。</li>
	<li>使用市售数据分析软件，按照说明生成热图以可视化差异表达的miRNA28。</li>
</ol>
9. 通路分析
<ol>
	<li>将8.9中选定的miRNA数据以Excel格式保存。</li>
	<li>登录在线RNA通路分析程序，上传Excel文件。在文件格式中选择“Flexible Format”，在标识符类型下拉列表中选择“Agilent”。</li>
	<li>在原始数据标题下，将“ID”分配给探针ID列，将“Observation 1”和“log ratio”分配给log ratio列，其余所有列均选择“ignore”。</li>
	<li>按如下设置分析参数：置信度选择“仅实验观察到的”；包含直接和间接关系；包含内源性化学物质；选择Ingenuity Knowledge Base作为参考数据库；选择包含所有物种、所有细胞系和组织以及所有突变数据的参考分子数据库。</li>
	<li>运行网络和通路分析。</li>
</ol>

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<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Analysis+of+DNA+or+RNA+using+its+wavelengths%3A+230+nm%2C+260+nm%2C+280+nm%5BTitle%5D)+AND+%22About+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm.</a> About Biotechnology. , (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

综上所述，本报告描述了诱导多能干细胞（iPS细胞）、iPS来源的视网膜色素上皮细胞（iPS-RPE）以及胎儿RPE细胞的培养方法。由iPS细胞衍生的RPE在形态和功能上均与胎儿RPE相似。iPS-RPE还表达典型的RPE相关基因，包括RPE65、CRALBP、PEDF和LRAT16。为了进一步表征这些细胞，提取RNA并进行微阵列分析，以鉴定差异表达的miRNA。信号强度分析显示，在胎儿RPE与iPS-RPE的比较中检测到的差异表达miRNA数量最多，提示iPS-RPE可能更为成熟。后续研究计划采用RT-PCR验证这些结果。
在本实验过程中，有几个关键步骤必须谨慎操作，以确保检测成功并获得准确的数据。第一个关键步骤发生在iPS细胞的培养过程中。iPS细胞必须保持在多能状态，以维持其干性。需每天仔细检查细胞是否出现分化迹象。未分化的iPS细胞以紧密的多细胞集落形式生长，具有较高的核质比和明显的核仁。iPS细胞集落具有清晰的边界，中心区域由多层细胞构成。分化迹象包括集落边界模糊、细胞形态不均一，以及出现明显的特定细胞类型（如神经元和成纤维细胞）。已分化的单个细胞可通...

干细胞具有无限增殖的能力，并且能够分化为任何一种体细胞类型。将体细胞重编程为多能干细胞的技术发展，已在科研界和临床医学领域引起极大关注，因为个性化组织再生的时代即将到来1诱导性多能干细胞（iPS细胞）具有与胚胎干细胞（ES细胞）相同的无限增殖潜能和多能性，同时避免了与胚胎干细胞相关的伦理争议。此外，患者来源的干细胞不会引发免疫反应，从而显著提高了治疗应用成功的可能性2-3在特定的培养条件下，iPS细胞已被证实可分化为多种不同类型的细胞 体外包括心肌细胞、神经元、胰岛β细胞、肝细胞和视网膜色素上皮细胞（RPE）4-12.
视网膜色素上皮（RPE）是位于视网膜后部的一层特化的色素性上皮细胞，具有多种对视觉健康和功能至关重要的作用，例如吸收散射光、吞噬光感受器外节段以及视黄醇类物质的代谢，以生成视觉发色团。由于损伤或疾病导致的RPE功能障碍会严重影响光感受器的健康和视觉功能，这一点在由RPE病变引起的致盲性疾病中得到了证实，例如年龄相关性黄斑变性（AMD）、Stargardt病和视网膜色素变性（RP）13。目前尚未实现真正有效的恢复视力的治疗方法，而用健康的RPE替代病变的RPE可能是防止视力丧失的最佳选择14-15。诱导多能干细胞来源的RPE（iPS-RPE）是一种潜在的细胞来源，可用于替代受损的RPE。iPS-RPE表达典型的RPE特异性蛋白，如LRAT、CRALBP、PEDF和RPE65；呈现出典型的深色素化六边形RPE形态；并具备RPE功能，包括吞噬作用、视黄醇类物质的处理以及11-cis 视黄醛的分泌5,16。然而，在iPS-RPE可用于临床治疗之前，必须对其进行全面表征。了解调控RPE分化的因素，对于提高用于临床应用的细胞产量和纯度至关重要。
细胞分化是基因表达高度调控的结果。在分化和发育过程中，细胞命运的决定需要基因组的表观遗传重塑以及转录因子的协同作用17。微小RNA（miRNA）对信使RNA（mRNA）翻译的调控构成了影响细胞命运的另一层调控机制1。miRNA是一类短链核苷酸序列，长度约为22个核苷酸，可通过与mRNA的3’非翻译区（UTR）结合来抑制翻译，或促使mRNA降解。几乎在所有组织中都已检测到miRNA的存在；截至目前，miRBase数据库中已收录超过2000种独特的人类微小RNA。由于miRNA与靶标mRNA结合仅需部分互补配对，因此单个miRNA可能结合数十甚至数百个不同的靶标，反之亦然；即单个mRNA可被多个不同的miRNA靶向。这种广泛的结合特性极大地增加了调控网络的复杂性，也加大了确定单个miRNA功能及其在细胞功能中所起作用的难度18-21。尽管如此，研究显示miRNA可通过影响DNA甲基化状态，在分化过程中精细调控基因表达17。在一项更针对视网膜色素上皮（RPE）的研究中，miR-204/211被证明可促进RPE的上皮表型22。另一研究团队分析了胚胎干细胞（ES细胞）向RPE分化过程中RPE的miRNA表达谱，发现分化过程的不同阶段表达着特定的miRNA组合23。事实上，miRNA表达谱能够明确区分不同类型的细胞，包括ES细胞、前体细胞和终末分化的细胞24,25。视网膜中表达的miRNA超过250种。基于这些研究，我们提出假设：miRNA在诱导性多能干细胞（iPS）向RPE分化的过程中发挥着重要作用。
本报告的目的是描述从 IMR90-4 诱导多能干细胞（iPS 细胞）分化视网膜色素上皮（RPE）的实验方案、通过微阵列分析收集 RNA 的方法，以及对微阵列数据进行分析以鉴定在三种细胞类型（iPS 细胞、iPS-RPE 和胎儿 RPE）中差异表达的 miRNA。从每种细胞类型的培养物中提取总 RNA，并杂交至包含针对 1,205 种人类 miRNA 和 144 种病毒 miRNA 的特异性探针的 miRNA 微阵列。比较微阵列结果，以确定在不同细胞类型中差异表达的 miRNA。筛选出表达水平变化倍数 ≥2 倍的 miRNA 进行进一步分析。使用 miRNA 分析软件程序鉴定差异表达 miRNA 的潜在靶基因，并构建由所选 miRNA 调控的细胞网络。

<table><tbody><tr><td>mTeSR1 培养基 + 5X 补充剂</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>2-&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M-7154</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>SH30853.01</td><td></td></tr><tr><td>无血清替代物</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>MEM 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>10370-021</td><td></td></tr><tr><td>N1 补充剂</td><td>Sigma</td><td>N-6530-5ML</td><td></td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma</td><td>H0888-1G</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>三碘甲腺原氨酸钠盐</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>胎儿视网膜色素上皮细胞培养基 RTEGM 试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>195406</td><td></td></tr><tr><td>分散酶</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Miltenyi Biotec 洗涤缓冲液</td><td>StemGent</td><td>130-092-987</td><td></td></tr><tr><td>Miltenyi Biotec 冲洗缓冲液</td><td>StemGent</td><td>130-092-222</td><td></td></tr><tr><td>抗 TRA-1-60 磁珠分选试剂盒</td><td>StemGent</td><td>130-095-816</td><td></td></tr><tr><td>Miltenyi Biotec 细胞分选柱</td><td>StemGent</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 微量提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>QIA shredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico LabChip 试剂盒</td><td>Agilent</td><td>G2938-90046</td><td></td></tr><tr><td>人 miRNA 微阵列 v16</td><td>Agilent</td><td>G4471A</td><td></td></tr></tbody></table>

人类诱导多能干细胞、由诱导多能干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞及胎儿视网膜色素上皮细胞的microrna表达谱

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

本报告的目的是描述比较人类诱导性多能干细胞（iPS细胞）、由人iPS细胞衍生的视网膜色素上皮细胞（iPS-RPE）以及胎儿RPE细胞中微小RNA（miRNA）表达谱的实验方案。这些方案包括通过微阵列分析收集RNA，以及对微阵列数据进行分析，以鉴定在三种细胞类型间差异表达的miRNA。本文还解释了iPS细胞和胎儿RPE细胞的培养方法，并描述了将人iPS细胞分化为RPE细胞所用的实验流程。所介绍的RNA提取技术旨在最大程度地回收极小分子量RNA，以用于miRNA微阵列分析。最后，本文阐述了对微阵列数据进行细胞信号通路和网络分析的方法。这些技术将有助于比较三种不同细胞类型的miRNA表达谱。

iPS 细胞（图 1A）在分化条件下培养，以诱导其分化为 iPS-RPE 细胞。iPS-RPE 表现出典型的 RPE 表型，呈六边形色素细胞形态（图 1B），与胎儿 RPE（图 1C）相似。
为了更好地理解miRNA在iPS细胞向iPS-RPE分化过程中可能发挥的作用，进行了miRNA表达的微阵列分析。使用mirVana miRNA分离试剂盒从iPS细胞、胎儿RPE细胞和iPS-RPE细胞中提取总RNA，以最大程度保留小分子RNA。RNA在杂交至微阵列芯片前进行定量并检测纯度。采用代表1,205种人类miRNA和144种病毒miRNA的探针，分析各组样本的miRNA表达情况。通过分析信号强度，确定各样本中各miRNA的相对表达水平。利用所得数据比较iPS-RPE与iPS细胞及胎儿RPE细胞之间的miRNA表达谱。生成热图以直观展示各组间miRNA表达的差异情况图2A）。与iPS-RPE相比，在iPS中差异表达的miRNA共有83个，其中47个在iP...

对人类诱导多能干细胞（iPS细胞）、由人类诱导多能干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞（iPS-RPE）以及胎儿视网膜色素上皮细胞（fetal RPE）的微小RNA（miRNA）表达谱进行了比较。

人类诱导多能干细胞、由诱导多能干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞及胎儿视网膜色素上皮细胞的microRNA表达谱

本报告的目的是描述比较人类诱导多能干细胞（iPS细胞）microRNA（miRNA）表达谱的实验方案，……

本实验的总体目标是比较诱导性多能干细胞、由诱导性多能干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞以及胎儿视网膜色素上皮细胞中的微小RNA表达。该目标通过首先培养并扩增诱导性多能干细胞和胎儿视网膜色素上皮细胞来实现。第二步是将iPS细胞分化为视网膜色素上皮（RPE）细胞。接下来，从iPS细胞、iPS-RPE细胞以及胎儿RPE细胞中提取RNA。最后一步是对RNA样本进行microRNA微阵列分析并解析数据。最终，通路与网络分析可用于鉴定参与多种细胞网络（包括增殖和细胞周期进程）的差异表达微小RNA（microRNA）。该方法有助于解答视觉研究领域中的关键问题，例如微小RNA在调控视网膜色素上皮（RPE）细胞成熟、细胞周期进程、增殖及衰老中的作用。该技术的应用意义延伸至利用干细胞来源的视网膜色素上皮进行治疗的领域，以替代因疾病或损伤而功能受损的RPE细胞，因为可用于治疗的细胞的最佳传代次数可以由此确定。尽管该方法可为调控诱导性多能干细胞（IPS）向RRP分化的因素提供见解，也可应用于其他器官系统，例如利用IPS诱导生成其他TC特异性细胞类型。开始该实验时，将诱导性多能干细胞以每孔约350个细胞集落的密度接种至新包被的培养板中，使用M tester one培养基，并在培养条件下让IPS集落生长扩增四至五天。随后每隔三天，用 4 毫升分化培养基更换 M tesser 培养基，并更换一半体积的新鲜分化培养基。让色素化病灶生长至足够大，以便手动从培养物中分离，此过程大约需要 40 至 50 天。然后使用 200 微升移液器吸头在周围切割并挑起色素化克隆。将解剖得到的细胞集落收集并合并至一个15毫升锥形管中。向合并的视网膜色素上皮（RPE）细胞中加入5毫升DMMF 12培养基，以300 × g离心5分钟。随后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于5毫升培养基中，并重复离心步骤。移除细胞沉淀中的培养基。然后通过将汇集的I-P-S-R-P-E细胞与0.25%胰蛋白酶EDTA在37摄氏度下孵育5至10分钟，使细胞团块解离为单细胞。用I-P-S-R-P-E培养基冲洗I-P-S-R-P-E细胞，随后将收集的细胞接种至预先涂有Matrigel的新培养板中，加入4毫升I-P-S-R-P-E培养基进行培养，在传代前培养三周，并每隔三天更换一次新鲜的I-P-S-R-P-E培养基以进行实验。以每平方厘米100,000个细胞的密度接种I-P-S-R-P-E细胞，接种后第17天收集未分化的IPS细胞。持续培养细胞，直至观察到未分化的克隆在中心区域变得密集。当观察到此现象时，用D-M-E-M-F 12培养基冲洗克隆，然后使用Accutase将IPS细胞解离为单细胞。将细胞收集至15毫升锥形管中，在300 G下离心5分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于2毫升D-M-E-M-F 12培养基中，以收集胎儿视网膜色素上皮（fetal RPE）细胞。首先用D-M-E-M-F 12培养基冲洗胎儿RPE细胞培养物，然后在37摄氏度下使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化5至10分钟，使细胞培养物解离为单细胞。将胎儿RPE细胞收集至15毫升锥形管中，在300 ×g条件下离心5分钟。随后吸除上清液，用2毫升D-M-E-M-F 12培养基重悬细胞沉淀。在第17天收集诱导性多能干细胞来源的视网膜色素上皮（I-P-S-R-P-E）细胞。在第三次和第五次传代后，用PBS冲洗I-P-S-R-P-E细胞两次，加入1毫升0.25%胰蛋白酶，在37摄氏度下孵育5至10分钟，制备单细胞悬液。然后用2毫升冰浴的I-P-S-R-P-E培养基中和胰蛋白酶，并将细胞收集至15毫升锥形管中。将离心管在300 × g条件下离心五分钟，然后吸除上清液。用磁珠试剂盒中的3毫升染色缓冲液重悬细胞沉淀，将I-P-S-R-P-E细胞悬液在染色缓冲液中以300 × g离心五分钟。然后吸除上清液并重悬。将细胞沉淀重悬于磁珠分选试剂盒中的染色缓冲液中，调整细胞浓度至每100微升含2×10⁶个细胞。每2×10⁶个细胞加入10微升抗TRA-1-60 PE抗体。充分混匀后，于4°C孵育10分钟。用一毫升染色缓冲液洗涤细胞，每两次重复处理 2 × 10⁶ 个细胞。然后将细胞悬液在 300 × g 条件下离心 10 分钟。接着吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 80 微升染色缓冲液中，每 2 × 10⁶ 个细胞进行一次。然后每 2 × 10⁶ 个细胞加入 20 µL 抗 PE 标记的磁珠。充分混匀，在 4°C 下孵育 15 分钟。每 2 × 10⁶ 个细胞加入 1 mL 染色缓冲液，于 300 ×g 离心 10 分钟，吸除上清液。然后将细胞沉淀重悬于500 µL染色缓冲液中，并按照随附文本方案所述，在磁性细胞分选仪中分选TRA-1-60阴性细胞。通过将每个样品经由市售的微型离心柱式均质器（专为核酸小量制备设计）处理来裂解细胞。随后，使用市售的RNA提取试剂盒从iPS细胞、iPS-RPE和胎儿RPE中提取总RNA，该试剂盒设计用于保护小RNA分子。使用 NanoDrop 分光光度计测定总 RNA 浓度，可创建一个 Excel 文件，列出在样本组之间表达水平至少存在两倍差异的 microRNA。然后登录在线 RNA 通路分析程序并上传该 Excel 文件。在文件格式中选择“灵活格式”，在标识符下拉列表中选择 Agilent。在“原始数据”标题下输入。将探针 ID 列指定为 ID，将观察值一和对数比率指定为对数比率列。其余所有列选择“忽略”。按如下方式选择分析参数：置信度仅限实验观察到的结果，包含直接和间接关系，并包含内源性化学物质。选择Ingenuity知识库作为参考集，然后选择参考分子的数据库。这包括来自所有物种、所有细胞系和组织以及所有突变的数据。在选择所有参数后，通过选择“网络”来运行网络分析，然后选择重叠网络，再点击感兴趣的网络以查看结果。诱导多能干细胞分化为I-P-S-R-P-E细胞后，表现出典型的视网膜色素上皮（RPE）表型，即六边形色素化细胞形态，与胎儿RPE细胞相似。对未分化IPS细胞与I-P-S-R-P-E细胞的微小RNA表达谱进行比较，结果显示47个微小RNA上调，36个下调；而与I-P-S-R-P-E细胞相比，胎儿RPE细胞中有61个微小RNA上调，49个下调。利用Ingenuity IPA软件进行通路分析表明，差异表达的微小RNA所靶向的基因参与了细胞发育、生长及细胞周期等细胞过程。该分析还表明，与IPS细胞相比，I-P-S-R-P-E细胞和胎儿RPE细胞中富集了在体内眼部组织中表达的微小RNA。在进行该实验操作时，需特别注意防止RNA样本的污染和降解。还可采用其他方法，例如实时定量聚合酶链式反应（R-T-P-C-R），以在应用后确认每种细胞类型中微小RNA（micro RNA）的表达水平。该技术为视觉研究领域的研究人员探索微小RNA在视网膜色素上皮（rrp）分化和细胞周期进程中的作用铺平了道路。观看本视频后，您应能充分理解如何从诱导多能干细胞（IPS）分化获得视网膜色素上皮细胞（RPE），并比较诱导多能干细胞来源的视网膜色素上皮细胞（I-P-S-R-P-E）、诱导多能干细胞（IPS）以及胎儿视网膜色素上皮细胞（fetal RPE）的微小RNA表达谱。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

人类iPS细胞的微小RNA表达谱，视网膜色素上皮衍生自IPS和胎儿视网膜色素上皮

我们提供一种可重复的方法，用于培养人胎儿视网膜色素上皮细胞（hfRPE），使其形成融合的单层细胞，具有成年天然组织的形态学、生理学、极性以及蛋白质和基因表达特征。该研究已拓展至多种眼病的动物模型。...

研究视网膜色素上皮生理学与病理生理学的实验模型

本文描述了一种分离单个视网膜细胞并扩增其cDNA的方法。单细胞转录组学可揭示组织中细胞异质性的程度，并发现稀有细胞群体的新标记基因。 accompanying protocol...

发育中与成熟视网膜神经元的单细胞分析

由干细胞衍生的视网膜色素上皮（RPE）细胞可用于多种应用，包括针对视网膜变性的细胞治疗、疾病建模以及药物研究。本文介绍一种简单且可重复地从干细胞分化获得RPE细胞的实验方案。...

高效诱导干细胞分化为视网膜色素上皮细胞

本文以多媒体形式展示了一种被学术界广泛认可的在大鼠和小鼠中进行视网膜下腔注射RPE细胞悬液的实验方案。该方法可用于评估移植的RPE细胞在视网膜变性动物模型中的挽救潜力、安全性以及存活能力。...

在啮齿类动物中进行视网膜下注射以递送悬浮的视网膜色素上皮细胞

本报告的目的是描述利用不同大小的拟胚体从诱导多能干细胞（iPS细胞）分化获得视网膜色素上皮（RPE）的实验方案。...

通过不同大小的拟胚体从诱导性多能干细胞（iPS细胞）中分化视网膜色素上皮细胞（RPE）

本方案描述了如何从多能干细胞诱导生成视网膜色素上皮细胞（RPE）。该方法通过联合使用生长因子和小分子化合物，在14天内将干细胞定向分化为未成熟RPE，并在三个月后获得成熟且具有功能的RPE细胞。...

人胚胎干细胞或诱导性多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的快速定向分化

关键词：视网膜色素上皮细胞，人胚胎干细胞，诱导性多能干细胞，定向分化，干细胞分化，眼发育，细胞治疗

利用多能干细胞生成特化的视网膜细胞是干细胞治疗视网膜疾病发展过程中的一个关键转折点。本文介绍了一种简单的方法，可高效地生成用于基础研究、转化研究和临床研究的视网膜类器官和视网膜色素上皮细胞。...

无饲养层且无异源成分的培养条件用于生成人iPSC来源的视网膜细胞模型

本方案最初由 Fernandez-Godino 等人于 2016 年报道1，描述了一种高效分离和培养小鼠 RPE 细胞的方法，这些细胞在 Transwell 培养板上一周内即可形成具有功能性和极性的 RPE 单层。该操作过程约需 3...

高效分离与原代培养小鼠视网膜色素上皮细胞

本文介绍了一种优化的视网膜类器官诱导系统，该系统适用于多种人类多能干细胞系，可高效且高重复性地生成视网膜组织。...

人多能干细胞衍生三维视网膜组织的视网膜类器官诱导系统

本方案描述了一种利用简化的培养条件，将人诱导多能干细胞（hiPSCs）高效分化为视泡样细胞簇并生成神经视网膜类器官的方法，该培养过程结合了贴壁培养和悬浮培养体系。在视网膜培养物中成熟的视泡结构内，还可分离出其他眼部细胞类型，如视网膜色素上皮细胞（RPE）和角膜上皮细胞。...

由健康及视网膜疾病特异性人诱导性多能干细胞生成视网膜类器官

了解人类iPS细胞、iPS来源视网膜色素上皮与胎儿视网膜色素上皮的微小RNA表达谱差异。本方法通过微阵列分析揭示细胞发育与基因调控机制，为视网膜再生医学研究提供重要依据。

人类诱导多能干细胞、由诱导多能干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞及胎儿视网膜色素上皮细胞的microRNA表达谱

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