人类诱导多能干细胞、由诱导多能干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞及胎儿视网膜色素上皮细胞的microRNA表达谱

本实验的总体目标是比较诱导性多能干细胞、由诱导性多能干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞以及胎儿视网膜色素上皮细胞中的微小RNA表达。该目标通过首先培养并扩增诱导性多能干细胞和胎儿视网膜色素上皮细胞来实现。

第二步是将iPS细胞分化为视网膜色素上皮（RPE）细胞。接下来，从iPS细胞、iPS-RPE细胞以及胎儿RPE细胞中提取RNA。最后一步是对RNA样本进行microRNA微阵列分析并解析数据。

最终，通路与网络分析可用于鉴定参与多种细胞网络（包括增殖和细胞周期进程）的差异表达微小RNA（microRNA）。该方法有助于解答视觉研究领域中的关键问题，例如微小RNA在调控视网膜色素上皮（RPE）细胞成熟、细胞周期进程、增殖及衰老中的作用。该技术的应用意义延伸至利用干细胞来源的视网膜色素上皮进行治疗的领域，以替代因疾病或损伤而功能受损的RPE细胞，因为可用于治疗的细胞的最佳传代次数可以由此确定。

尽管该方法可为调控诱导性多能干细胞（IPS）向RRP分化的因素提供见解，也可应用于其他器官系统，例如利用IPS诱导生成其他TC特异性细胞类型。开始该实验时，将诱导性多能干细胞以每孔约350个细胞集落的密度接种至新包被的培养板中，使用M tester one培养基，并在培养条件下让IPS集落生长扩增四至五天。

随后每隔三天，用 4 毫升分化培养基更换 M tesser 培养基，并更换一半体积的新鲜分化培养基。让色素化病灶生长至足够大，以便手动从培养物中分离，此过程大约需要 40 至 50 天。然后使用 200 微升移液器吸头在周围切割并挑起色素化克隆。

将解剖得到的细胞集落收集并合并至一个15毫升锥形管中。向合并的视网膜色素上皮（RPE）细胞中加入5毫升DMMF 12培养基，以300 × g离心5分钟。随后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于5毫升培养基中，并重复离心步骤。

移除细胞沉淀中的培养基。然后通过将汇集的I-P-S-R-P-E细胞与0.25%胰蛋白酶EDTA在37摄氏度下孵育5至10分钟，使细胞团块解离为单细胞。用I-P-S-R-P-E培养基冲洗I-P-S-R-P-E细胞，随后将收集的细胞接种至预先涂有Matrigel的新培养板中，加入4毫升I-P-S-R-P-E培养基进行培养，在传代前培养三周，并每隔三天更换一次新鲜的I-P-S-R-P-E培养基以进行实验。

以每平方厘米100,000个细胞的密度接种I-P-S-R-P-E细胞，接种后第17天收集未分化的IPS细胞。持续培养细胞，直至观察到未分化的克隆在中心区域变得密集。当观察到此现象时，用D-M-E-M-F 12培养基冲洗克隆，然后使用Accutase将IPS细胞解离为单细胞。

将细胞收集至15毫升锥形管中，在300 G下离心5分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于2毫升D-M-E-M-F 12培养基中，以收集胎儿视网膜色素上皮（fetal RPE）细胞。首先用D-M-E-M-F 12培养基冲洗胎儿RPE细胞培养物，然后在37摄氏度下使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化5至10分钟，使细胞培养物解离为单细胞。

将胎儿RPE细胞收集至15毫升锥形管中，在300 ×g条件下离心5分钟。随后吸除上清液，用2毫升D-M-E-M-F 12培养基重悬细胞沉淀。

在第17天收集诱导性多能干细胞来源的视网膜色素上皮（I-P-S-R-P-E）细胞。在第三次和第五次传代后，用PBS冲洗I-P-S-R-P-E细胞两次，加入1毫升0.25%胰蛋白酶，在37摄氏度下孵育5至10分钟，制备单细胞悬液。然后用2毫升冰浴的I-P-S-R-P-E培养基中和胰蛋白酶，并将细胞收集至15毫升锥形管中。

将离心管在300 × g条件下离心五分钟，然后吸除上清液。用磁珠试剂盒中的3毫升染色缓冲液重悬细胞沉淀，将I-P-S-R-P-E细胞悬液在染色缓冲液中以300 × g离心五分钟。然后吸除上清液并重悬。

将细胞沉淀重悬于磁珠分选试剂盒中的染色缓冲液中，调整细胞浓度至每100微升含2×10⁶个细胞。每2×10⁶个细胞加入10微升抗TRA-1-60 PE抗体。充分混匀后，于4°C孵育10分钟。

用一毫升染色缓冲液洗涤细胞，每两次重复处理 2 × 10⁶ 个细胞。然后将细胞悬液在 300 × g 条件下离心 10 分钟。接着吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 80 微升染色缓冲液中，每 2 × 10⁶ 个细胞进行一次。

然后每 2 × 10⁶ 个细胞加入 20 µL 抗 PE 标记的磁珠。充分混匀，在 4°C 下孵育 15 分钟。每 2 × 10⁶ 个细胞加入 1 mL 染色缓冲液，于 300 ×g 离心 10 分钟，吸除上清液。

然后将细胞沉淀重悬于500 µL染色缓冲液中，并按照随附文本方案所述，在磁性细胞分选仪中分选TRA-1-60阴性细胞。通过将每个样品经由市售的微型离心柱式均质器（专为核酸小量制备设计）处理来裂解细胞。随后，使用市售的RNA提取试剂盒从iPS细胞、iPS-RPE和胎儿RPE中提取总RNA，该试剂盒设计用于保护小RNA分子。

使用 NanoDrop 分光光度计测定总 RNA 浓度，可创建一个 Excel 文件，列出在样本组之间表达水平至少存在两倍差异的 microRNA。然后登录在线 RNA 通路分析程序并上传该 Excel 文件。在文件格式中选择“灵活格式”，在标识符下拉列表中选择 Agilent。

在“原始数据”标题下输入。将探针 ID 列指定为 ID，将观察值一和对数比率指定为对数比率列。其余所有列选择“忽略”。

按如下方式选择分析参数：置信度仅限实验观察到的结果，包含直接和间接关系，并包含内源性化学物质。选择Ingenuity知识库作为参考集，然后选择参考分子的数据库。

这包括来自所有物种、所有细胞系和组织以及所有突变的数据。在选择所有参数后，通过选择“网络”来运行网络分析，然后选择重叠网络，再点击感兴趣的网络以查看结果。

诱导多能干细胞分化为I-P-S-R-P-E细胞后，表现出典型的视网膜色素上皮（RPE）表型，即六边形色素化细胞形态，与胎儿RPE细胞相似。对未分化IPS细胞与I-P-S-R-P-E细胞的微小RNA表达谱进行比较，结果显示47个微小RNA上调，36个下调；而与I-P-S-R-P-E细胞相比，胎儿RPE细胞中有61个微小RNA上调，49个下调。利用Ingenuity IPA软件进行通路分析表明，差异表达的微小RNA所靶向的基因参与了细胞发育、生长及细胞周期等细胞过程。该分析还表明，与IPS细胞相比，I-P-S-R-P-E细胞和胎儿RPE细胞中富集了在体内眼部组织中表达的微小RNA。在进行该实验操作时，需特别注意防止RNA样本的污染和降解。

还可采用其他方法，例如实时定量聚合酶链式反应（R-T-P-C-R），以在应用后确认每种细胞类型中微小RNA（micro RNA）的表达水平。该技术为视觉研究领域的研究人员探索微小RNA在视网膜色素上皮（rrp）分化和细胞周期进程中的作用铺平了道路。观看本视频后，您应能充分理解如何从诱导多能干细胞（IPS）分化获得视网膜色素上皮细胞（RPE），并比较诱导多能干细胞来源的视网膜色素上皮细胞（I-P-S-R-P-E）、诱导多能干细胞（IPS）以及胎儿视网膜色素上皮细胞（fetal RPE）的微小RNA表达谱。