Name: 解剖和斑马雀胚胎下游分析在发展的早期阶段 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学习斑马雀早期胚胎解剖技术，用于发育生物学和毒理学研究。该方法可完整分离Taeniopygia guttata胚胎，支持形态学分析、基因表达检测及RNA提取等下游应用。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢其资助来源：霍华德·休斯医学研究所本科科学教育项目对威廉与玛丽学院的支持；资助机构：美国国立卫生研究院（M.S.S）；资助编号：R15NS067566。同时感谢威廉与玛丽学院、生物学系以及艺术与科学学院在动物护理方面提供的支持。

伦理声明：实验所用方法采用威廉与玛丽学院繁殖种群中的家养斑胸草雀进行。所有实验程序均遵循RSPCA指南23，并经威廉与玛丽学院OLAW（实验动物福利办公室）动物福利保证（#A3713-01）批准，同时获得机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准（#2013-06-02-8721-dacris）。
1. 卵的收集与孵化
<ol>
	<li>建立斑马雀配对，置于14小时光照:10小时黑暗的光周期条件下饲养。提供食物、水、干草和巢箱 随意摄取注意：斑马雀的常规护理与繁殖方法已有详尽描述23.</li>
	<li>准备一个带有倾斜搁架的标准鸡胚孵育器。注意：通过每天向孵育器底部加水，将人工孵育器的温度维持在37.5（±1）°C，相对湿度维持在80%–95%。使用前让孵育器平衡两天。
	<ol>
		<li>选择小型饲喂杯（5 × 7.6 cm），深度至少为 2.5 cm，用于在孵化箱中盛放卵。在杯底及下部边缘铺上两层纸巾，使杯内具有缓冲垫层，同时仍允许卵自由滚动。将这些杯子放置在孵化箱的倾斜搁架上。注意：缓冲过厚会阻碍卵的滚动，可能导致胚胎黏附于卵壳内壁，从而影响正常孵化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在光照周期开始后两小时收集卵。注意：此操作可尽量减少因亲本孵化导致的特定孵化时间内胚胎发育阶段的差异。
	<ol>
		<li>用拇指和食指轻轻捏住卵的两端，沿卵的长轴方向拾取。使用较软的4B石墨铅笔在卵上标记产卵日期及从巢中收集的时间。注意：较软的4B铅笔可降低划破脆弱卵壳的风险。</li>
		<li>1.3.2）在孵化箱的每个杯中放入1至5个已标记的鸡蛋，使鸡蛋能够自由滚动，以防止胚胎黏附于蛋壳内壁。注意：每个杯中放置超过5个鸡蛋可能会阻碍单个鸡蛋的滚动，降低胚胎存活率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 从卵中取出胚胎
<ol>
	<li>为准备解剖，需备齐以下材料：洁净的手术刀、尖头镊子和两把超细尖头镊子。将10 cm × 10 cm的称量纸放置在解剖显微镜底座上，以提供一个洁净、不吸水的解剖操作表面。注意：称量纸至关重要，因其便于卵黄的操作，并且是使用手术刀切割精细膜结构时的最佳表面。</li>
	<li>在50 ml聚丙烯离心管中准备一份磷酸盐缓冲液（1× PBS），并准备至少三支移液管和一个小的废液桶。若需固定胚胎，请准备一份4%多聚甲醛（PFA）溶液。注意：PFA蒸气具有毒性，所有涉及PFA的操作均应在通风橱内进行，以尽量减少暴露风险。若需快速冷冻胚胎，请准备液氮并将其置于解剖显微镜附近。本解剖步骤无需无菌操作，但应确保所有材料清洁。</li>
	<li>根据斑胸草雀发育分期指南22所述，在所需发育阶段对应的时间点从孵箱中取出鸡蛋。注意：孵化36小时后取出鸡蛋可获取第6期胚胎（图&#160;4A）22；孵化56小时后取出鸡蛋可获取第12期胚胎（图&#160;3A）22。</li>
	<li>使用光纤照明灯，将鸡蛋沿其垂直轴握住，透过蛋壳照射光线以照亮内部结构，将光源尖端置于蛋后方，观察并定位卵黄及正在发育的胚胎。
	<ol>
		<li>将手术刀置于远离卵黄的一侧，沿蛋的纵轴从顶端到底端施加轻微压力进行切割。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用拇指和食指轻轻挤压蛋的顶端和底端，或用镊子沿切口轻轻撬开蛋壳，将蛋内容物倒出。打开蛋时应直接位于称量纸上，使卵黄缓慢滚落至纸上。</li>
	<li>检查卵黄表面是否存在连接区的白色区域，该区域表现为环绕胚胎发育部位的浅白色环状结构，使用超细尖头镊子调整卵黄方向，使胚胎位于卵黄中央。 
	注意：若未观察到卵黄表面有浅白色圆环，可用细镊子轻轻翻转卵黄，直至胚胎位于卵黄上方。注意：对于第1至第9期胚胎22，胚盘直径小于6 mm，在卵黄表面呈现为浅淡、略呈半透明的圆盘状结构——可参考图1。对于第10期及更晚期胚胎22，由于出现血池，胚胎更易观察，但操作时需避免刺破卵黄囊，否则将难以定位胚胎。</li>
</ol>
3. 胚胎与胚外组织的分离
<ol>
	<li>用解剖针在卵黄边缘穿刺以释放压力（图1B），并沿卵黄直径方向、平行于胚盘进行单次切割。重复进行此类斜向切割，直至包含胚胎的卵黄部分被成功分离（图1B）。注意：此步骤可保持卵黄整体结构完整，同时降低卵黄表面张力，便于在胚体周围精确切割，避免损伤胚胎结构。</li>
	<li>使用移液管去除卵黄边缘部分。注意：尽可能去除卵黄，但需保留少量，以防止胚胎黏附于称重纸上干燥表面而发生撕裂。</li>
	<li>以45°角将1×PBS滴加至胚胎底部以清洗胚盘。将移液管尖端置于胚盘旁侧——而非正上方。若需进一步去除卵黄，应在称重纸上先用解剖刀将残留卵黄分离，再将胚胎转移至培养皿中。注意：该方法可使胚胎从称重纸表面顺利脱离。</li>
	<li>使用移液管将胚胎连同少量1×PBS转移至小型塑料培养皿中。通过向培养皿中添加更多1×PBS，并将其滴加至胚胎附近（而非直接滴在胚胎上）进行清洗。轻轻晃动培养皿以清洗胚胎并去除残留卵黄，倾斜培养皿后用移液管吸除废液1×PBS。 
	注意：移除1×PBS后，胚胎通常不会黏附于培养皿底部，因残留的1×PBS使塑料表面具有滑润性。若胚胎发生黏附，可补充添加更多1×PBS。 
	若需固定胚胎，请继续执行步骤3.5和3.6；若需快速冷冻胚胎，请立即跳至步骤3.8。</li>
	<li>若为原位杂交（in situ hybridization）而固定胚胎，应立即向培养皿中加入4%多聚甲醛（PFA）以完全浸没胚胎。将4% PFA直接滴加至胚胎顶部，使其展平，防止胚胎卷曲。在4 °C条件下用4% PFA固定胚胎12小时。
	<ol>
		<li>固定完成后，将胚胎依次经梯度甲醇（MeOH）溶液脱水，并在100% MeOH中于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若胚胎处于发育阶段1–&#160;822，&#160;应去除附着于胚胎上的卵黄膜。&#160;注意：此步骤可在固定过程中或固定后进行。发育阶段早于822的胚胎不易观察，因其与卵黄膜紧密黏附，遮蔽关键结构，如图2A所示。
	<ol>
		<li>用超细镊子夹住延伸至连接区外的卵黄膜边缘，小心多次翻转胚胎，以冲洗残留的卵黄颗粒，并松解胚盘与卵黄膜之间的黏附。注意：切勿触碰胚胎中心区域，以免损伤胚胎结构。</li>
		<li>若连接区与卵黄膜之间未形成间隙，可用超细镊子轻轻刮擦连接区，使其与卵黄膜松脱。用超细镊子夹住卵黄膜并轻柔地将其从胚胎上剥离。必要时，可通过镊子夹住连接区处胚盘的外周边缘，轻柔地将胚胎从卵黄膜上拉离。</li>
		<li>移除后的卵黄膜应弃置于生物危害一级废物（生物安全等级1）容器中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对早期胚胎阶段进行原位杂交（ISH）检测时，请遵循鸡胚整体原位杂交的标准操作流程24, 25，并考虑以下建议：
	<ol>
		<li>为减少ISH过程中对胚胎的损伤，每个胚胎应使用一个独立的5 ml带螺口盖玻璃小瓶。每瓶仅加入2–3 ml溶液，确保胚胎完全浸没。将5 ml小瓶插入泡沫塑料架（或其他可稳固固定小瓶的支架）中，并将支架固定于旋转摇床上，使小瓶垂直旋转。注意：此措施可避免胚胎在水平旋转过程中接触瓶盖而被撕裂。</li>
		<li>对于发育阶段0–622的胚胎，在室温下使用含5 μg/ml蛋白酶K的1×PTw溶液处理5分钟；对于阶段7–1222的胚胎，则在37 °C下使用含10 μg/ml蛋白酶K的1×PTw溶液处理10分钟，以降低背景染色。</li>
		<li>为在阶段1–1022中检测低水平基因表达时获得足够的显色反应，建议以10 μg/ml探针浓度孵育12小时；对于更晚期的胚胎，则在60 °C下以1 μg/ml探针浓度孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若需快速冷冻胚胎，在解剖后立即向培养皿中快速加入2–3 ml 1×PBS，并倾斜培养皿以分离胚胎与卵黄颗粒。&#160;吸除液体并重复2–3次，以彻底清除所有卵黄。使用尖头镊子将胚胎转移至预先标记的微量离心管中，立即在液氮中进行速冻，随后于-80 °C保存。</li>
</ol>
4. EdU细胞增殖检测。EdU在斑马雀胚胎中的掺入与检测。
<ol>
	<li>使用光纤照明灯对鸡蛋进行照蛋，以定位胚胎或蛋黄的位置。</li>
	<li>在鸡蛋表面标记出与胚胎或蛋黄相对的一侧，以确保在显微注射过程中不会损伤胚胎。</li>
	<li>用油泥在60 mm塑料培养皿内衬并塑造成碗状，以固定鸡蛋至所需方向。标记点应朝向便于使用显微操作器插入显微注射针的位置。注意：油泥将在显微注射及第4.11步孵育过程中稳定鸡蛋。</li>
	<li>拉制两根玻璃毛细管显微注射针。将其中一根针尖弄钝，用于在标记位置刺穿蛋壳打孔；将第二根注射针通过反向加载矿物油后插入显微注射仪，以备注射使用。</li>
	<li>将显微注射仪每注射一次释放的溶液体积设定为59.8 nl。</li>
	<li>用10 mM的EdU储备液装载显微注射针。</li>
	<li>用钝化的玻璃毛细管在标记位置的蛋壳上打孔，注意避免蛋壳破裂或将碎片落入蛋腔内。调整鸡蛋方向，使孔位呈45°角，以便显微注射针可直接穿过腔体到达蛋黄或胚胎。</li>
	<li>使用显微操作器将装载好的注射针插入腔内约1.0 cm深度。</li>
	<li>将所需量的EdU溶液直接注射到发育中的胚胎或蛋黄上。注意：注射EdU体积不超过478 nl时，不会导致胚胎死亡。</li>
	<li>立即用多层塑料薄膜将鸡蛋及油泥支架包裹严密，覆盖整个培养皿，以防止孵育期间胚胎干燥。用胶带将塑料膜边缘固定在培养皿底部，防止孵育过程中薄膜松开。注意：塑料膜仅应在解剖前立即拆除。</li>
	<li>将鸡蛋置于37 °C孵育至目标发育阶段，使新增殖的细胞充分掺入EdU。注射后不得将鸡蛋放回孵箱内的倾斜架上，应将包裹塑料膜的油泥衬里培养皿放置于孵箱内稳定的平面上。</li>
	<li>去除塑料膜，按照前述方案解剖胚胎。用4%多聚甲醛（PFA）固定胚胎，并如上所述在4 °C孵育12小时。固定后，用100%乙醇（EtOH）洗涤5分钟，并储存在新鲜的100% EtOH中，在&#160;-20 °C条件下保存，直至进一步分析。</li>
</ol>
5. EdU “点击”反应方案
以下所有步骤均在玻璃小瓶中进行。
<ol>
	<li>用下列溶液依次进行5分钟的洗涤以重悬胚胎：</li>
	<li>乙醇、75%乙醇和25%无菌去离子蒸馏水（sdd水）、50%乙醇和50% sdd水、25%乙醇和75% 1X PTw、100% 1X PTw</li>
	<li>用100% 1X PTw洗涤三次，每次10分钟。</li>
	<li>通过将1份10X储存缓冲液（10 μl）与9份sdd水（90 μl）混合，稀释反应缓冲液添加剂（试剂盒组分F）。</li>
	<li>在另一管中配制反应混合液，混合以下成分：875 μl 1X PBS、20 μl CuSO4, 5 μl叠氮化物、100 μl稀释后的反应缓冲液添加剂。注意：反应混合液体积可按比例缩小，只要完全覆盖胚胎即可。使用前立即加入稀释后的反应缓冲液添加剂（步骤5.3）。所有后续操作均在避光条件下进行。用铝箔覆盖样品以避光。</li>
	<li>用铝箔包裹管子，并将其垂直放置于连接在摇床上的泡沫板架中，在室温下孵育两小时。</li>
	<li>用新鲜的1X PBS洗涤胚胎三次，每次10分钟。</li>
	<li>将胚胎在新鲜的4%多聚甲醛（PFA）中4 °C过夜孵育。</li>
	<li>用1X PBS洗涤三次，每次10分钟，随后在新鲜1X PBS中4 °C保存。在进一步分析前始终用铝箔覆盖胚胎以避光。</li>
</ol>

<ol><li>Eng, M. L., Elliott, J. E., MacDougall-Shackleton, S. A., Letcher, R. J., Williams, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+exposure+to+2%2C2%27%2C4%2C4%27%2C5-pentabromodiphenyl+ether+%28BDE-99%29+affects+mating+behavior+of+zebra+finches%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Early exposure to 2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl ether (BDE-99) affects mating behavior of zebra finches.</a> Toxicol Sci. 127, 269-276 (2012).</li>
<li>Winter, V., Elliott, J. E., Letcher, R. J., Williams, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+an+egg-injection+method+for+embryotoxicity+studies+in+a+small%2C+model+songbird%2C+the+zebra+finch+%28Taeniopygia+guttata%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Validation of an egg-injection method for embryotoxicity studies in a small, model songbird, the zebra finch (Taeniopygia guttata).</a> Chemosphere. 90, 125-131 (2013).</li>
<li>Maney, D. L., Goodson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenomic+mechanisms+of+aggression+in+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Neurogenomic mechanisms of aggression in songbirds.</a> Adv Genet. 75, 83-119 (2011).</li>
<li>Kirn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+of+neurogenesis+and+growth+of+brain+regions+to+song+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+and+Language%22%5BJournal%5D)">The relationship of neurogenesis and growth of brain regions to song learning.</a> Brain and Language. 115, 29-44 (2010).</li>
<li>Fisher, S. E., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXP2+as+a+molecular+window+into+speech+and+language%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">FOXP2 as a molecular window into speech and language.</a> Trends in Genetics. 25, 166-167 (2009).</li>
<li>Tokarev, K., Tiunova, A., Scharff, C., Anokhin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+for+Song%3A+Expression+of+C-Fos+and+ZENK+in+the+Zebra+Finch+Song+Nuclei+during+Food+Aversion+Learning%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Food for Song: Expression of C-Fos and ZENK in the Zebra Finch Song Nuclei during Food Aversion Learning.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Vargha-Khadem, F., Gadian, D. G., Copp, A., Mishkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXP2+and+the+neuroanatomy+of+speech+and+language%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FOXP2 and the neuroanatomy of speech and language.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 131-138 (2005).</li>
<li>Schulz, S. B., Haesler, S., Scharff, C., Rochefort, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+FoxP2+alters+spine+density+in+Area+X+of+the+zebra+finch%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Knockdown of FoxP2 alters spine density in Area X of the zebra finch.</a> Genes, Brain and Behavior. 9, 732-740 (2010).</li>
<li>Jarvis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+brains+and+a+new+understanding+of+vertebrate+brain+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 151-159 (2005).</li>
<li>Brainard, M. S., Doupe, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+birdsong%3A+songbirds+as+a+model+for+basic+applied+medical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Translating birdsong: songbirds as a model for basic applied medical research.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 489-517 (2013).</li>
<li>Mayer, U., Watanabe, S., Bischof, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+memory+and+the+avian+hippocampus%3A+Research+in+zebra+finches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Spatial memory and the avian hippocampus: Research in zebra finches.</a> J Physiol Paris. , (2012).</li>
<li>Warren, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+a+songbird%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genome of a songbird.</a> Nature. 464, 757-762 (2010).</li>
<li>Agate, R. J., Scott, B., Haripal, B., Lois, C., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+songbirds+offer+an+opportunity+to+develop+a+genetic+model+for+vocal+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Transgenic songbirds offer an opportunity to develop a genetic model for vocal learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17963-17967 (2009).</li>
<li>Birkhead, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+incubation+and+early+hatching+in+brood+parasitic+birds%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Internal incubation and early hatching in brood parasitic birds.</a> Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 278, 1019-1024 (2011).</li>
<li>Haesler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP2+expression+in+avian+vocal+learners+and+non-learners%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners.</a> J Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).</li>
<li>Godsave, S. F., Lohmann, R., Vloet, R. P. M., Gahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+receptors+in+the+embryonic+zebra+finch+hindbrain+suggest+a+function+for+maternal+androgens+in+perihatchingsurvival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Androgen receptors in the embryonic zebra finch hindbrain suggest a function for maternal androgens in perihatchingsurvival.</a> Journal of Comparative Neurology. 453, 57-70 (2002).</li>
<li>Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick%3B+a+great+model+system+becomes+even+greater%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The chick; a great model system becomes even greater.</a> Dev Cell. 8, 9-17 (2005).</li>
<li>Kuenzel, W. J., Medina, L., Csillag, A., Perkel, D. J., Reiner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+avian+subpallium%3A+new+insights+into+structural+and+functional+subdivisions+occupying+the+lateral+subpallial+wall+and+their+embryological+origins%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The avian subpallium: new insights into structural and functional subdivisions occupying the lateral subpallial wall and their embryological origins.</a> Brain Research. 1424, 67-101 (2011).</li>
<li>Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+chicken+embryology+to+the+understanding+of+vertebrate+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development.</a> Mech Dev. 121, 1019-1029 (2004).</li>
<li>Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rediscovering+the+chick+embryo+as+a+model+to+study+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development.</a> Neural Development. 7, (2012).</li>
<li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenet Genome Research. 117, 231-239 (2007).</li>
<li>Murray, J. R., Varian-Ramos, C. W., Welch, Z. S., Saha, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryological+staging+of+the+zebra+finch%2C+Taeniopygia+guttata%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Embryological staging of the zebra finch, Taeniopygia guttata.</a> J Morphol. , (2013).</li>
<li>Hawkins, P., Morton, D. B., Cameron, D., Cuthill, I., Francis, R., Freire, R., Gosler, A., Healy, S., Hudson, A., Inglis, I., Jones, A., Kirkwood, J., Lawton, M., Monaghan, P., Sherwin, C., Townsend, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+birds%3A+refinements+in+husbandry+and+procedures.+Fifth+report+of+BVAAWF%2FFRAME+%2FRSPCA%2FUFAW+Joint+Working+Group+on+Refinement%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Laboratory birds: refinements in husbandry and procedures. Fifth report of BVAAWF/FRAME /RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement.</a> Lab Anim. , (2001).</li>
<li>Pearse II, R. V., Esshaki, D., Tabin, C. J., Murray, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+analysis+of+intra-+and+extraarticular+connective+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression analysis of intra- and extraarticular connective tissue.</a> Journal of Orthopaedic Research. 27, 427-434 (2009).</li>
<li>Pizard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridization+and+detection+of+RNAs+in+vertebrate+embryos+and+isolated+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 66, (2004).</li>
<li>Warren, M., Puskarczyk, K., Chapman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo+proliferation+studies+using+EdUlabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Chick embryo proliferation studies using EdUlabeling.</a> Developmental Dynamics. 238, 944-949 (2009).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+syntesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA syntesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 105, 2415-2420 (2008).</li>
<li>Hoogesteijn, A. L., DeVoogd, T. J., Quimby, F. W., De Caprio, T., Kollias, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+impairment+in+zebra+finches+%28Taeinopygia+guttata%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reproductive impairment in zebra finches (Taeinopygia guttata).</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 24, 219-223 (2005).</li>
<li>Winter, V., Williams, T. D., Elliott, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-generational+study+of+In+ovo+exposure+to+PBDE-99+in+the+zebra+finch%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A three-generational study of In ovo exposure to PBDE-99 in the zebra finch.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 32, 562-568 (2013).</li>
<li>Kitulagodage, M., Buttemer, W. A., Astheimer, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adverse+effects+of+fipronil+on+avian+reproduction+and+development%3A+maternal+transfer+of+fipronil+to+eggs+in+zebra+finch+Taeinopygia+guttata+and+in+ovo+exposure+in+chickens+Gallus+domesticus%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">Adverse effects of fipronil on avian reproduction and development: maternal transfer of fipronil to eggs in zebra finch Taeinopygia guttata and in ovo exposure in chickens Gallus domesticus.</a> Ecotoxicology. 20, 653-660 (2011).</li>
<li>Hallinger, K. K., Zabransky, D. J., Kazmer, K. A., Cristol, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birdsong+differs+between+mercury-polluted+and+reference+sites%5BTitle%5D)+AND+%22The+Auk%22%5BJournal%5D)">Birdsong differs between mercury-polluted and reference sites.</a> The Auk. 127, 156-161 (2010).</li>
<li>Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioactive+in+situ+Hybridization+for+Detecting+Diverse+Gene+Expression+Patterns+in+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li>
<li>Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+Avian+Brain+Chimeras+Reveal+That+Large+Brain+Size+Differences+Are+Influenced+by+Cell%E2%80%93Interdependent+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Interspecies Avian Brain Chimeras Reveal That Large Brain Size Differences Are Influenced by Cell–Interdependent Processes.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Chen, C. C., Winkler, C. M., Pfenning, A. R., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+the+developing+avian+telencephalon%3A+Regional+timing+and+brain+subdivision+continuities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of the developing avian telencephalon: Regional timing and brain subdivision continuities.</a> The Journal of Comparative Neurology. 521, 3666-3701 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

近期胚胎发育分期指南22和基因组注释的建立，使斑胸草雀成为发育研究中理想的研究模型。然而，斑胸草雀胚胎体积小且结构脆弱，在1至10期阶段其大小仅为3至7 mm22，这使得解剖操作较为困难11,14。在卵黄表面准确定位胚胎并完整取出具有挑战性。本方案提供了充分的细节，以方便地完成该操作。本方案展示了通常不为人知但对成功解剖至关重要的关键步骤。例如，必须在胚胎与称量纸之间保留一层薄薄的卵黄，以防止粘连。
识别和移除胚胎都可能具有挑战性。若难以在蛋黄表面识别胚胎，可将蛋黄从蛋中取出后，直接从上方用光照射，并以45°角观察蛋黄，以定位胚胎。找到胚胎后，将蛋黄放在称量纸上小心切割，注意不要撕裂胚胎。
如果后续应用包括用于观察解剖学差异的成像、原位杂交或细胞增殖检测，则在1–8阶段去除卵黄膜22对于更清晰地观察结构至关重要。若在早期阶段去除卵黄或卵黄膜时遇到困难，可在用1×PBS洗涤前先用4 % PFA固定胚胎，以降低胚胎的脆弱性。通过如上所述在解剖过程中首先去除卵黄膜，可在执行原位杂交后仍清晰完整地观察到斑胸雀鹛胚胎中的结构。
EdU的一个局限性是，当给药体积超过478 nl时会导致胚胎死亡。然而，较宽的给药剂量范围允许对增殖细胞进行不同水平的标记。
本试剂盒中使用的“点击”反应为铜(I)催化的炔烃-叠氮化物环加成反应（Cu(I)AAC）。在此特定反应中，含有炔基的胸苷类似物分子（EdU）被处于活跃分裂状态的细胞所掺入。EdU中的炔基从DNA的螺旋结构中伸出，通过与连接绿色荧光分子的叠氮化合物孵育，该叠氮分子可特异性结合游离的炔基。绿色荧光即显示出胚胎中新生增殖的细胞。由于叠氮基团和炔基具有生物正交性，而这些反应基团在生物体内天然不存在，因此可避免非特异性染色。此外，由于该反应无需对DNA进行变性处理，因此可方便地进一步进行依赖DNA的其他分析27。
该方法的一个固有局限在于斑胸草雀胚胎体积小且脆弱。需去除1至15期胚胎的卵黄膜22 若操作不慎，可能会对胚胎结构造成损伤。然而，本方案简化了分离方法，使研究者能够利用早期胚胎阶段来研究以往尚未深入探讨的结构异常和基因表达。该方案为开展多种细胞与分子检测铺平了道路，有助于研究者确定成体表型的发育起源。例如，可在发育最早阶段考察不同环境条件下或经药物处理后与发声学习相关的基因表达情况。28,29,30,31尽管本文未展示，该方法理论上可适用于其他操作，例如放射性标记 原位 斑马雀组织切片杂交及电穿孔/在 卵外科手术32,33,34鉴于斑胸草雀已在大量文献中被确立为重要的模式生物，此类研究为关联发育机制与成体生理学及行为学（尤其是语言发育）提供了尚未充分利用的机遇7,9.

该技术的总体目标是获得斑马雀 (Taeniopygiaguttata) 胚胎，用于多种发育学研究。斑胸草雀已成为主要的鸣禽模式生物，并被广泛应用于包括毒理学在内的多个研究领域。1,2行为3记忆与学习4,5,6，比较神经解剖学7,8，以及语言发展9,10作为唯一完成基因组测序的鸣禽，斑马雀使得对雀形目（Passeriformes）这一占已知鸟类物种50%以上的类群进行分子与遗传学研究成为可能。11,12,13.
尽管斑马雀的成体和幼体已被广泛应用于多个研究领域，但针对斑马雀胚胎的研究仍较少，尤其是在发育早期阶段。这主要是由于其卵和胚胎体积较小，以及作为模式生物的研究历史相对较短14,15,16，而在过去这些研究多以鸡（Gallus gallus domesticus）为主要模式系统17,18,19,20,21。然而，由于鸡不属于鸣叫学习者，因此不适合用于研究鸣叫学习的遗传基础、鸣叫学习的发育过程、遗传性、行为特征，以及参与运动学习的皮层-基底神经节环路10。
需要注意的是，在解剖和分子实验操作过程中，斑马雀胚胎比鸡胚胎更为脆弱，更容易受到损伤。特别是对斑马雀胚胎进行通透化处理时，需要格外小心。一些对鸡胚胎无害的强效去垢剂和酶类可能会损伤斑马雀胚胎。在常规操作中，必须先将斑马雀的卵放入小杯中，再置于孵育箱内，以防止其在孵育过程中滚动时破裂。
斑胸草雀适合进行行为学研究，易于在人工饲养条件下全年大量繁殖，且为鸣禽学习者。这些特性使得斑胸草雀成为一种能够整合语言的发育、遗传及行为特征的模式生物。结合下文详述的解剖方法以及近期开发的针对斑胸草雀的发育分期指南22，&#160;斑胸草雀正日益成为一种有用且标准化的发育模式生物。然而，获取早期胚胎可能具有挑战性。本实验方案可帮助研究人员轻松获得早期胚胎。研究斑胸草雀早期发育过程、复杂行为的分子发育基础，或研究其他小型雀形目鸟类发育中毒理学效应的研究者，将发现该解剖方法具有重要应用价值。

<table><tbody><tr><td>鸡胚孵育器</td><td></td><td></td><td>我们使用 Picture Window Hova-Bator 孵育器，循环空气型号&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 成像试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>C10337</td><td>用于细胞增殖检测。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>解剖显微镜&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>我们使用 Olympus SZ61</td></tr><tr><td>7'' Drummond 毛细管（用于 Nanoject II 注射仪）</td><td>Drummond</td><td>3-00-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Drummond Nanoject II 微量注射仪</td><td>Drummond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont 镊子 #55</td><td>World Precision Instruments</td><td>14099</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（EtOH）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon 离心管（聚丙烯材质）</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-18&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep Lysis Matrix H 裂解管</td><td>MP biomedicals</td><td>6917-100</td><td>用于 RNA 提取，用于胚胎匀浆</td></tr><tr><td>光纤照明灯（高强度照明器）</td><td>Dolan-Jenner Industries&amp;nbsp;</td><td>Fiber-Lite MI-150&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>带螺口盖的玻璃小瓶（DEPC 处理）</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-338A</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管（1.5 ml）</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8410</td><td></td></tr><tr><td>模型黏土</td><td></td><td></td><td>任意品牌</td></tr><tr><td>Narshige PB-7 玻璃微电极拉制仪</td><td>Narshige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omni Bead Ruptor 匀浆器</td><td>OMNI International</td><td>19-010</td><td>用于 RNA 提取</td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛（4% PFA）：20 ml 8% PFA（32 g 多聚甲醛，350 ml sdd H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，调 pH 至 7.6，400 ml sdd H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O），20 ml 2x PBS</td><td>用于胚胎固定。注意：有害，切勿吸入。&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（1x PBS）：200 ml 10x PBS，1,800 ml Barnstead H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，调 pH 至 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（10x PBS）：800 ml Barnstead 水，2.013 g KCl，80.063 g NaCl，2.722 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 一碱，14.196 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 二碱，200 ml Barnstead H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，调 pH 至 6.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>含 0.1% Tween-20 的磷酸盐缓冲液（1x PTw）：1,800 ml Barnstead H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，200 ml 10x PBS，调 pH 至 7.4，2 ml Tween-20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 ml 塑料培养皿&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>塑料封口膜</td><td></td><td></td><td>任意品牌</td></tr><tr><td>PrepEase RNA Spin 试剂盒</td><td>PrepEase, Affymetrix</td><td>78766 1 KT</td><td>用于 RNA 提取，用于胚胎匀浆</td></tr><tr><td>反应混合液：875 &amp;mu;l 1xPBS，100 mM 20 &amp;mu;l CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;（试剂盒组分 E），5 &amp;mu;l Alexa Fluor 488 叠氮化物（试剂盒组分 B），100 &amp;mu;l 稀释后的反应缓冲液添加剂（试剂盒组分 F）</td><td>Invitrogen</td><td>C10337</td><td>用于细胞增殖检测。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>sdd H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>种蛋杯&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>孵蛋时用作容器</td></tr><tr><td>不锈钢手术刀片&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>标准鸟巢盒</td><td></td><td></td><td>我们使用 Abba Plastic Finch 巢盒</td></tr><tr><td>4 ml 带聚四氟乙烯衬垫盖的玻璃小瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-912-352</td><td></td></tr><tr><td>移液管（聚乙烯材质）</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>4 x 4 称量纸</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-898-12B</td><td></td></tr></tbody></table>

斑马雀胚胎早期发育阶段的解剖与后续分析

Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development

斑胸草雀（Taeniopygiaguttata在包括毒理学在内的多个研究领域中，) 已成为日益重要的模式生物1,2行为3，以及记忆与学习4,5,6作为唯一完成基因组测序的鸣禽，斑胸草雀在发育学研究中具有重要潜力；然而，斑胸草雀的早期发育阶段尚未得到充分研究。造成斑胸草雀发育研究匮乏的原因在于其卵和胚胎体积微小，解剖操作困难。以下解剖方法可最大限度减少胚胎组织损伤，从而实现对胚胎发育各阶段形态学特征和基因表达的研究。该方法支持胚胎的明场与荧光高质量成像，并可用于分子实验，例如 原位 原位杂交（ISH）、细胞增殖检测以及用于定量分析（如定量实时PCR（qtRT-PCR））的RNA提取&#160;该技术使研究者能够研究以往难以获取的发育早期阶段。

图中所示的步骤 图1 指示胚胎附着于卵黄膜时的外观（A），并演示将胚胎与卵黄正确分离的方法（B）。胚胎可通过连接区识别，该区域颜色明显较卵黄膜浅。在卵黄被切除之前，胚胎本身通常难以辨认。一旦将胚胎从蛋中解剖出来，即可进行固定或速冻，以备后续使用。如果 原位 若计划对解剖后的胚胎进行杂交，必须去除通过连接区附着在胚胎上的卵黄膜。 图2 展示了去除该膜后胚胎可见度的改善情况（C），以及剥离卵黄膜的正确方法（A，B）。解剖和固定后，进行整体封片 原位 杂交按如下所示进行 图3 （A，A’，B，B’）以及 图4 （A，A'，B，B'）和 图5 （A、B、C）用于检测差异 orthodenticle同源框 2 (Otx2胚胎发育期暴露于低剂量甲基汞后的基因表达情况。 图5 显示正义探针结果，表明无背景信号。在 图4尽管在同一时间点从卵中解剖出来，暴露于甲基汞（MeHg）的胚胎在发育上已进展至5期22 （B，B’），而对照胚胎发育至6期22 （A，A’）所示解剖并展示的胚胎群 图4 从孵化箱中同时收集了巢内的样本。尽管发育过程中存在一定的自然变异，但根据此前的解剖数据，孵化箱内温度波动仅导致2.4 ppm甲基汞暴露组胚胎发育延迟的可能性极低。各阶段的差异表明，甲基汞发育暴露对胚胎细胞增殖产生了影响。
在解剖前，将EdU注射到第2天的卵中，并过夜孵育。解剖并固定第16期22胚胎后，利用“点击”化学反应对EdU进行可视化，从而可检测增殖中的细胞，如图6（A、B、C）所示。在将卵放入孵育箱及进行解剖的过程中，必须仔细监控各个时间点，因为甲基汞暴露或EdU检测操作可能干扰胚胎的正常发育进程。最早的一次注射是在第0天进行的，即步骤1.3中所述的收集当天。该胚胎在约38小时后被解剖（第7期22）。只要注射体积不超过478 nl，胚胎的存活率约为90%（与对照组胚胎相同）。
该解剖方法还可实现高质量的RNA提取。在解剖16期22胚胎后，按照试剂盒制造商提供的方案进行RNA提取，无需任何优化步骤，如图7所示。对于RNA提取及后续的qRT-PCR应用而言，无需去除卵黄膜。
注意：所有胚胎图像的方位均为上端为前端，下端为后端。
<img alt="胚胎结构分析；显微镜图像及带注释的示意图，展示关键组分。" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 定位并解剖斑胸草雀胚胎的操作流程，阶段 1–1022。 轻轻滚动卵黄，直至出现微弱的白色圆盘，由此确定胚胎位置 (A)。当胚胎位于卵黄中央后，逐步进行卵黄解剖 (B)：第一步切开以释放卵黄膜的压力（1），随后的切口（2）围绕与卵黄膜相连的连接区（zj）。比例尺为 1 mm。
<img alt="Frozen tissue sections, microscopy images, biological study, anatomical structure analysis." src="/files/ftp_upload/51596/51596fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 卵黄膜的去除及胚胎结构的可见性 从卵黄中取出胚胎后，将胚胎置于含有4% PFA的培养皿中。如果 原位 杂交实验需要进行，胚胎结构的可见性至关重要，可通过去除卵黄膜来实现 （A）用超细尖镊子夹住卵黄膜，如有必要，通过直接在胚胎最外缘操作，轻轻将其从胚胎上剥离。 (B)去除卵黄膜可提高胚胎结构的清晰度，便于对胚胎进行成像或后续处理 原位 杂交 (C)比例尺长度为 1 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51596/51596fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Embryo development microscope images: panel comparisons of op and mb regions; gene expression results." src="/files/ftp_upload/51596/51596fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 整体装片 原位 对发育过程中暴露于处理的斑胸草雀胚胎进行杂交实验 甲基汞. 表达模式 orthodenticle同源框 2 (Otx2) 在暴露于 0.0 ppm 甲基汞的胚胎中进行了表征 （A，A’） 和 2.4 ppm 甲基汞 （B，B’） 通过亲代饮食。背侧（A）和腹侧（A’）表达 Otx2 在12期期间，中脑和视泡中均可见22处理组胚胎在同一时间点进行解剖，但其发育进程延迟，这在头部结构的背侧（B）和腹侧（B’）视图中可见，表现为典型的11期特征。22缩写：mb，中脑；op，视泡。比例尺为1 mm。
<img alt="Embryonic development stages diagram, gene expression analysis, purple-stained sections." src="/files/ftp_upload/51596/51596fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 整体装片 原位 斑马雀胚胎在发育过程中暴露于杂交实验 甲基汞. 表达模式 orthodenticle同源框 2 (Otx2）在第6阶段进行了表征22 暴露于0.0 ppm甲基汞的胚胎 （A，A’） 以及5期22 暴露于 2.4 ppm 甲基汞的胚胎 （B，B’） 通过亲代饮食。缩写：am，中胚层前缘；no，脊索，脊索中胚层；po，前羊膜，前原肠孔；ps，原条22比例尺代表1 mm。
<img alt="Embryonic development stages, microscope images, showcasing growth progression, cellular differentiation." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig5highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图5. 整体装片 原位 使用正义探针在斑胸草雀胚胎上进行的杂交实验 （A） 5期22 胚胎 （B） 早期阶段622 胚胎 (C) 11期22 胚胎。比例尺代表 1 mm。
<img alt="荧光显微镜图像；植物根部结构标记；细胞组织研究。" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig6highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 6"> 
图 6.斑胸草雀胚胎中的 EdU 掺入与检测。 采用 EdU “点击化学”方法检测第16期22胚胎中的增殖细胞（A、B、C）。EdU 在 DNA 中取代胸腺嘧啶26,27，并通过点击化学法进行检测27。体节的侧缘和尾芽区域的细胞增殖现象清晰可见。图 A 显示增殖主要局限于胚胎后部，并可见单个增殖细胞。图 B 展示整个胚胎中增殖细胞的分布位置。图 C 显示胚胎前部区域，并更详细地展示了高度增殖的端脑（te）。缩写：af，羊膜褶；flb，前肢芽；hlb，后肢芽；le，晶状体泡；ms，中脑；mt，后脑；opc，视杯；pa，咽弓；sm，体节中胚层；tb，尾芽；te，端脑。比例尺为 1 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51596/51596fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="凝胶电泳结果；DNA条带分离；ladder，ppm浓度；科研分析。" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig7highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图7"> 
图7. 从解剖的斑胸草雀胚胎中提取的RNA质量。 对照组（0.0 ppm）和1.2 ppm甲基汞处理组的胚胎按照步骤3.8所述进行解剖并快速冷冻。每条泳道显示的是从各处理组中两个匀浆后的胚胎提取的RNA。

斑胸草雀（Taeniopygia guttata）是一种重要的模式生物，但其早期发育阶段尚未得到充分研究。本实验方案描述了如何解剖早期胚胎，以用于发育学和分子生物学研究。

斑胸草雀（Taeniopygiaguttata）已成为毒理学1,2、行为学3以及多个研究领域中日益重要的模式生物。

本实验的总体目标是在斑胸草雀胚胎发育的极早期阶段，完整地分离出胚胎，用于后续的发育生物学和分子生物学研究。该操作首先沿蛋壳纵向切割，然后轻柔地将蛋内容物倾倒至WHE纸上。接着，定位连接区，并切除周围卵黄，从而保持胚胎完整。然后将胚胎转移至培养皿中，洗涤后进行固定或速冻，以备后续分析。最后，去除固定后的胚胎的卵黄膜，以更清晰地观察胚胎结构。最终，通过C两杂交和EDU处理，分别显示了在甲基汞处理下，斑胸草雀早期胚胎发育阶段的基因表达和细胞增殖情况。该技术的主要优势在于其能够最大限度地减少胚胎组织损伤。这使得研究人员能够在发育的各个阶段对形态学和基因表达进行研究。该方法有助于解答比较发育生物学和毒理学中的关键问题，例如不同毒素对发育最早阶段的影响。该技术的可视化演示至关重要，因为在解剖过程中定位Zno连接处并去除Vilin膜可能较为困难，早期胚胎结构脆弱且不易观察。在收集斑胸草雀的卵并按照文本方案进行孵化后，准备以下解剖所需材料：一把洁净的手术刀、一把尖头镊子、两把超细尖镊子、三支移液管、一份XPBS以及4%多聚甲醛。如果需要固定胚胎，请在解剖显微镜的底座上放置一张10厘米×10厘米的瓦楞纸，以提供一个洁净且不吸水的解剖操作表面。根据斑胸草雀发育指南确定的时间点，从孵箱中取出鸡蛋。接着，使用光纤照明灯，将鸡蛋沿其垂直轴线握住，透过蛋壳照射光线，透过透射光观察蛋内情况（照蛋）。将光源尖端置于蛋的后方，观察并定位蛋黄及正在发育的胚胎。随后将解剖刀置于蛋黄对侧，施加轻微压力，沿蛋的纵轴从顶端到底端切开。用拇指和食指轻轻挤压蛋的尖端底部，或将镊子沿切口轻轻撬开蛋壳，以取出蛋内含物。观察卵黄中可见为微弱白环的明区连接带。该区域环绕着发育中的胚胎，使用尖头镊子调整卵黄方向，使胚胎位于中央，以便将胚胎与胚外组织分离。穿刺卵黄边缘以释放压力，并沿胚盘两侧的卵黄直径方向进行单次切割。继续制作对角线切口，直至成功分离含有胚胎的卵黄部分。使用移液管去除卵黄边缘，保留少量卵黄以润滑胚胎，防止其在转移过程中撕裂。通过将装有1× PBS的移液管尖端以45度角置于胚胎盘旁并朝向胚胎底部，缓慢挤出少量1× PBS缓冲液，从而清洗胚胎盘。将胚胎转移至一个小的塑料培养皿中。通过向培养皿中加入更多PBS，并在胚胎附近滴加PBS来清洗胚胎。轻轻晃动培养皿以清洗并去除残留的卵黄。然后倾斜培养皿以吸去废液缓冲液。若需立即对胚胎进行原位杂交固定，则加入4% PFA浸没胚胎，随后将PFA直接滴加在胚胎上使其展平，防止卷曲。在甲醇梯度溶液中脱水后，于4°C孵育12小时。如果胚胎处于第1至第8期之间，使用超细镊子夹住延伸出连接区边缘的卵黄膜，将其从胚胎上移除。小心地多次翻转胚胎，以洗去残留的卵黄颗粒，并使胚盘从卵黄膜上松脱。如果连接区与卵黄膜之间未出现间隙，可用超细尖镊子轻轻刮擦连接区，使其与膜松脱。然后抓住卵黄膜和胚胎盘在连接区的周边边缘，轻轻将卵黄膜从胚胎上拉开。若需在解剖后快速进行胚胎的速冻，立即将2至3毫升的1×PBS加入培养皿中，并倾斜培养皿以使胚胎与卵黄颗粒分离。吸除液体后，重复洗涤两到三次，再用尖头镊子将胚胎转移至预先标记的微量离心管中，于液氮中速冻，随后在-80摄氏度条件下保存。使用光纤光源灯、蜡烛和鸡蛋进行EDU细胞增殖实验。为确定胚胎或蛋黄的位置，应在鸡蛋上标记与胚胎或蛋黄相对的一侧，以确保在显微注射过程中不损伤胚胎。接下来，用油泥将一个60毫米的塑料培养皿内壁塑造成碗状，以固定鸡蛋并保持其所需的方向。调整标记位置的方向，以便插入显微注射针。将两根玻璃毛细针拉钝后，其中一根用于在卵上穿孔并用矿物油回填，将第二根针装入显微注射仪中。将显微注射仪的单次注射体积设定为 59.8 纳升，然后使用 10 毫摩尔的 EDU 储备液装填显微注射针，并用拉钝的玻璃毛细针小心地在标记位置的卵壳上穿刺一个小孔，注意避免卵壳破裂或将碎片掉入卵腔内。将鸡蛋调整至小孔与待插入的显微注射针成45度角对齐。然后使用显微操作仪，将装有试剂的注射针插入腔内约一厘米，并将所需体积的EDU溶液注入卵黄或胚胎中。立即用多层塑料膜包裹鸡蛋及黏土支架，并用胶带将包裹边缘固定于培养皿底部，以防止在转移至孵育过程中发生移位。将鸡蛋置于稳定的表面上，在 37 摄氏度下孵育，直至达到所需发育阶段，然后按照文本方案去除塑料包裹膜并解剖胚胎。本图显示了经解剖和固定后的胚胎进行的 NC2 杂交实验，这些胚胎曾暴露于低剂量甲基汞中，以检测正交同源盒基因（ortho identical homeo box）的表达情况。从头部结构的背侧和腹侧视图可见，与未处理的胚胎相比，经处理的胚胎在 11 阶段出现明显的神经发育延迟。在 12 阶段，左侧所示的四枚胚胎组经过了相同时间的孵育。然而，左上方的两个未经处理的胚胎发育至六期，而左下方的两个经汞处理的胚胎仅发育至五期。这些胚胎经反义探针处理，以显示无背景染色；图中所示为注射了EDU并过夜孵育的第二天胚胎中的增殖细胞。点击化学法显示体节的侧缘、尾芽以及头部区域存在细胞增殖。该凝胶包含从解剖获得的16期斑胸草雀胚胎中提取的RNA样本，这些胚胎未经处理或经1.2百万分之一浓度的甲基汞处理，表明本视频所展示的解剖方法在掌握后可实现高质量RNA的提取。若操作得当，该解剖过程可在一分钟内完成。在本操作过程中，重要的是要从一定角度观察卵黄以定位胚胎，因为早期胚胎可能难以观察。遵循本操作步骤。还可采用其他方法，如原位杂交、细胞增殖检测以及用于定性分析的 RNA 提取等，以回答发育学和毒理学研究中的其他问题。

dissection-downstream-analysis-zebra-finch-embryos-at-early-stages

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

解剖和斑马雀胚胎下游分析在发展的早期阶段

使用整体封片法 原位 将分子生物学与生物体生物学相联系的杂交技术

斑马鱼脊髓中的增殖、模式形成、分化和轴突导向等发育过程可被便捷地建模。本文介绍一种优化斑马鱼胚胎固定的方法，以实现对这些事件的清晰可视化。...

斑马鱼胚胎的解剖与侧向封片：脊髓发育分析

延时共聚焦成像是一种用于表征胚胎发育的有力技术。本文中，我们描述了该方法，并对野生型以及 pdgfra, smad5, 和 smo...

利用4D共聚焦显微镜分析斑马鱼颅面形态发生

斑马鱼胚胎是发育生物学研究的理想模型。在胚胎发育过程中，斑马鱼胚胎带有卵黄团，给样本的观察与分析带来了三维结构上的挑战。本实验方案描述了如何制备整体样本的二维平面封片 原位 经 (WISH)...

用于整体染色斑马鱼胚胎标本观察与分析的平铺制备 原位 杂交

本文所述方法利用能够进行光学切片的荧光解剖显微镜，以及简单的重新调整策略来校正焦平面和层面漂移，从而实现对斑马鱼胚胎器官发育过程的延时分析。...

利用配备光学切片功能的解剖显微镜通过延时成像分析斑马鱼肾脏发育

有丝分裂对每一种生物都至关重要，其缺陷常导致癌症和发育障碍。利用本成像方案并以斑马鱼作为模型系统，研究人员可以在活体脊椎动物中观察有丝分裂过程，以及当有丝分裂过程出现异常时所产生的多种缺陷。...

活体斑马鱼胚胎中观察有丝分裂及其动态过程

本文介绍了一种分离幼体斑马鱼性腺组织的实验方案，该方法将有助于开展斑马鱼性别分化与维持机制的研究。...

斑马鱼幼体性腺组织的解剖

本方案展示了一种基于荧光的方法，用于可视化血管系统并量化其复杂性 Xenopus tropicalis在对胚胎进行遗传学和/或药理学干预后，将荧光染料注入跳动的心脏，数分钟后即可对血管系统进行成像，以研究心血管发育过程。 体内.

胚胎血管生成的可视化与定量分析 Xenopus tropicalis

本文介绍了斑马鱼后部体轴的三维组织培养方案，可实现对脊椎动物体节形成的活体研究。该外植体模型能够控制体轴伸长、调控形态发生素来源，并实现组织水平上具有亚细胞分辨率的活体成像。...

一种用于研究斑马鱼脊椎动物体节分化的三维尾部外植体培养方法

本文描述了一种在完整卵膜内利用光片显微镜对早期斑马鱼胚胎进行成像的样品制备策略。该方法分析了胚胎在原肠胚形成70%期和胚芽期时于卵膜内所采取的不同方位，并详细阐述了如何利用光片显微系统在整个胚胎范围内获得细胞尺度分辨率的成像策略。...

早期斑马鱼胚胎的光片显微成像与样品制备策略

学习斑马雀早期胚胎解剖技术，用于发育生物学和毒理学研究。该方法可完整分离Taeniopygia guttata胚胎，支持形态学分析、基因表达检测及RNA提取等下游应用。

斑马雀胚胎早期发育阶段的解剖与后续分析

探索更多视频