Name: 使用福氏痢疾杆菌研究自噬，细胞骨架相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-09T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: 探索福氏痢疾杆菌感染中自噬与细胞骨架相互作用的机制，利用HeLa细胞和斑马鱼幼虫模型进行体外和体内研究。该方法有助于揭示宿主细胞如何通过septin笼限制细菌传播并促进自噬降解。

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SM 实验室的工作由惠康信托研究职业发展奖学金 [WT097411MA] 资助。

1. 监测自噬与细胞骨架 体外 使用组织培养细胞
<ol>
	<li>准备 S. flexneri
	<ol>
		<li>培养皿 S. flexneri 从-80 °C甘油菌种中将M90T（野生型）接种至刚果红胰蛋白胨大豆（TCS）琼脂平板上，37 °C过夜培养。同一平板可用于多次实验。</li>
		<li>挑取单个菌落，置于8 ml TCS培养基中，37 °C摇床过夜培养。 
		注意：刚果红结合表明毒力质粒已被保留。</li>
		<li>为获得指数生长期的细菌，将过夜培养的菌液按1/80比例接种至新鲜TCS培养基中，在37 °C条件下振荡培养至OD600 = 0.3-0.6.</li>
		<li>将细菌亚培养物在1,000 × g离心5分钟。用MEM洗涤沉淀，再在1,000 × g离心5分钟。将沉淀重悬于MEM中，调节至OD600 = 0.3-0.6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于感染的HeLa细胞
	<ol>
		<li>在“完全培养基”中培养HeLa细胞， 即MEM 加 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，补充 1 mM 丙酮酸钠、0.1 mM 非必需氨基酸溶液和 10% 胎牛血清。</li>
		<li>接种 1-1.5 × 105 实验开始前24或48小时，将细胞接种于6孔板中。如需进行显微镜观察，可将细胞接种于6孔板内的玻璃盖玻片上；如需进行活细胞成像，可将细胞接种于35 mm玻璃底培养皿中。 
		注意：为了追踪自噬（autophagy）例如，ATG8/LC3阳性自噬体）和细胞骨架（例如，肌动蛋白尾部，septin笼状结构）的实时动态 志贺氏菌 利用活体成像技术研究感染过程时，可通过转染带有GFP、RFP或CFP标签的质粒，对组织培养细胞进行瞬时转染（参见讨论部分）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>感染
	<ol>
		<li>以感染复数（MOI）为100:1感染细胞 志贺氏菌 （OD600 在MEM中稀释（稀释比例为0.3–0.6）；直接加入已接种于6孔板的HeLa细胞中，细胞应在感染前24–48小时铺板（如1.2节所述），每孔加入2 ml MEM（无血清饥饿处理）。</li>
		<li>为最大限度促进细菌与宿主细胞的黏附，将细菌与细胞在室温下以 700 x g 离心 10 分钟。离心后，在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 30 分钟2 并让感染继续进行。</li>
		<li>用新鲜的MEM洗涤感染的细胞两次，然后加入含庆大霉素的完全培养基（50 μg/ml，用于消除细胞外细菌），根据实验需要孵育1–4小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定与标记用于显微镜观察的感染性HeLa细胞
	<ol>
		<li>用1×PBS洗涤感染的细胞2次，然后在室温下用含1×PBS的4%多聚甲醛固定15分钟。为去除多聚甲醛，再用1×PBS洗涤细胞2次。</li>
		<li>将固定后的细胞在50 mM氯化铵溶液中室温孵育10分钟。用1×PBS洗涤一次，再用0.1%辛基酚聚氧乙烯醚于室温下处理4分钟以通透细胞。 
		注意：可用于透化的辛基酚聚氧乙烯醚替代物，如皂苷或甲醇，可适用于不同细胞结构的保存20.</li>
		<li>用 1× PBS 洗涤细胞，然后在湿盒中与针对自噬关键组分的初级抗体孵育（例如，p62/SQSTM1）或 Septin 细胞骨架（HeLa 细胞中表达 SEPT2、SEPT6、SEPT7、SEPT9 和 SEPT11）孵育 30 分钟（室温）至过夜（4 ºC）。</li>
		<li>用1×PBS洗涤细胞两次，然后在湿盒中与二抗孵育，并用鬼笔环肽标记丝状肌动蛋白（F-actin），室温下孵育30分钟至4 °C过夜。如需对宿主细胞核进行染色，可加入4&#34;，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</li>
		<li>用1×PBS洗涤细胞，然后使用封片剂将玻璃盖玻片封固在载玻片上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>感染的HeLa细胞显微成像
	<ol>
		<li>使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜，配合63X或100X物镜观察感染细胞，以识别DAPI标记的细胞核 志贺氏菌. 
		注意：如图所示 图1A-1C，可以观察到septin笼状结构呈环状，直径约0.6 µm，包围着细胞质中聚合肌动蛋白并募集自噬标志物的细菌。例如p62 和 LC37,8相比之下，能够聚合肌动蛋白尾的细菌不会被 septin 笼状结构区室化，也不会被靶向至自噬途径7,8.</li>
		<li>使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜，配合63X或100X物镜，定量每个显微视野中的胞内细菌数量。同时定量被隔蛋白（septin）笼状结构捕获并靶向自噬的细菌数量，以及形成聚合肌动蛋白尾、逃逸自噬的细菌数量。</li>
		<li>为了确定被 septin 笼或聚合肌动蛋白尾部捕获的细菌所占百分比，需对感染细胞采集 Z 轴层扫图像序列，处理图像后，从至少 3 次独立实验中每组计数不少于 500–1,000 个细菌。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 自噬与细胞骨架的体外功能分析 In Vitro
注意：可采用遗传学和药理学方法在感染的组织培养细胞中干扰自噬，进而监测这些处理对感染进程的影响。
<ol>
	<li>siRNA 介导的基因沉默
	<ol>
		<li>将 0.8 × 105 个 HeLa 细胞接种于含完全培养基的 6 孔板中的玻璃盖玻片上。</li>
		<li>次日使用基于脂质的转染试剂，转染针对自噬和/或细胞骨架标志物的 siRNA。</li>
		<li>在所需孵育时间后，按照第 1.3 节所述方法用 Shigella 感染细胞。</li>
		<li>按照第 1.4 节所述方法固定并标记细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>药理学干预 
	注意：可通过药理学手段干预细胞骨架，例如，使用细胞松弛素 D 或拉特鲁霉素 B 去聚合肌动蛋白细胞骨架，使用诺考达唑去聚合微管，使用布雷维丁抑制肌球蛋白活性，或使用福氯芬农破坏 Septin 蛋白组装。自噬可通过雷帕霉素激活，或通过巴佛洛霉素抑制。
	<ol>
		<li>为在 Shigella 感染期间干预细胞骨架，首先按照第 1.3 节所述方法用 Shigella 感染细胞，并给予足够时间使细菌进入细胞并从吞噬体逃逸至胞质（例如，感染后 &#62;1.5 小时）。</li>
		<li>将药物从储存液（以二甲基亚砜（DMSO）溶解）用 MEM 稀释至终浓度为 5 µM（细胞松弛素 D、拉特鲁霉素 B、诺考达唑）、20 µM（福氯芬农）或 50 µM（布雷维丁），在 37 °C 处理细胞 30 分钟。每孔/管细胞加入的药物体积（DMSO/药物混合液）为每 2 ml 培养基 1–5 µl（取决于储存液浓度）。以等量 DMSO 溶于 MEM 作为阴性对照处理细胞。</li>
		<li>按照第 1.4 节所述方法固定并标记细胞。 
		注意：为干预自噬流（在感染或未感染细胞中），可将雷帕霉素（20 nM）或巴佛洛霉素（160 nM）处理时间延长至 4–12 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质印迹（Western Blot） 
	注意：可通过检测自噬标志物（如 p62 和 LC3）的蛋白水平来定量自噬活性。
	<ol>
		<li>在所需孵育时间后，收集细胞并裂解，用于免疫印迹分析。将蛋白提取物上样于 8%、10% 或 14% 的丙烯酰胺凝胶进行电泳。</li>
		<li>自噬流（即 自噬速率）的分析可参照文献21,22所述方法进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>显微成像与定量分析
	<ol>
		<li>使用落射荧光或共聚焦显微镜，配合 63X 或 100X 物镜，可通过定量显微技术（即 计数自噬体、Septin 笼状结构和肌动蛋白尾）评估 siRNA 或药物处理对 Shigella 感染的影响，方法见第 1.5 节，结果如 图 2A 和 图 2B 所示。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 福氏志贺菌与自噬及细胞骨架相互作用的体内成像
注意：斑马鱼模型 志贺氏菌 感染可用于研究 septin 包裹和自噬 体内19.
<ol>
	<li>准备 S. flexneri
	<ol>
		<li>培养 S. flexneri 如第1.1节所述</li>
		<li>在 OD600 = 0.3–0.6，取8 ml细菌亚培养物，于1,000 × g离心10分钟。用1×PBS洗涤沉淀，再于1,000 × g离心10分钟。</li>
		<li>将沉淀重悬于80 µl含0.1%酚红的1x PBS中，以获得约2,000个细菌/nl。将细菌悬液置于冰上以减缓其生长。 
		注意：在向幼虫注射时，添加酚红有助于观察接种物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备斑马鱼幼鱼用于显微注射 
	注意：斑马鱼以卵的形式产出，在受精后72小时内称为胚胎，此后称为幼鱼。
	<ol>
		<li>按照Westerfield所述方法繁殖成年斑马鱼23 将4条雄鱼和8条雌鱼（通常为2:1的比例）放入一个单独的鱼缸中，鱼缸底部铺有弹珠（可防止成鱼吃掉产出的卵）。或者，在交配前一晚将卵收集篮放入繁殖缸内。 
		注意：在斑马鱼养殖设施开启光照约30分钟后，卵子开始受精。23，并应尽快收集以防止霉菌生长。集卵篮用于收集卵，便于轻松采收，同时保护卵免受成虫侵害。</li>
		<li>收集胚胎，用含0.003%次氯酸钠的胚胎培养基（E2）清洗10分钟。弃去含次氯酸钠的E2溶液，用E2培养基将胚胎洗涤5次，随后将胚胎置于10 cm培养皿中（100个胚胎/50 ml E2培养基），于28 °C培养。</li>
		<li>若胚胎或幼鱼将用于显微镜研究，在受精后24小时向E2培养基中加入0.003% N-苯硫脲以防止黑色素形成。将胚胎置于28 ºC条件下以维持正常发育。 
		注意：斑马鱼幼鱼在受精后72小时即可用于感染实验。</li>
		<li>对于感染和显微镜观察操作，使用含200 g/ml三卡因的E2溶液对斑马鱼幼鱼进行麻醉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>斑马鱼幼鱼静脉和局部感染的制备 
	注意：为评估斑马鱼在实验过程中的存活情况 志贺氏菌 感染，进行尾静脉注射。以观察 septin 及自噬标志物的募集情况 志贺氏菌在局部位点（如尾部肌肉）进行感染操作。
	<ol>
		<li>进行尾静脉注射时，将麻醉后的幼鱼侧向放置，背侧朝向针头。如图所示 图3A将针尖置于泄殖腔开口后方附近，对准尾静脉，刺入皮肤并注入所需剂量的细菌（注射体积为1-5 nl）。 
		注意：静脉注射操作难度较高，需要经过数周的训练才能熟练掌握。使用酚红（不含细菌）进行注射练习有助于准确评估注射部位。 
		注意：在以下情况下 志贺氏菌剂量依赖性实验表明，低剂量感染（&#60;1,000 CFU）在48小时内被清除，而高剂量感染（&#62;4,000 CFU）在48小时内导致宿主死亡19.</li>
		<li>对于尾部肌肉感染，将麻醉后的幼虫按第3.3.1节所述方法进行定位。如图所示 图3A，将针头小心地置于体节肌上方（即，骨骼肌片段）并注射少量（即，1 nl）细菌样品。 </li>
	</ol>
	</li>
	<li>幼虫细菌静脉注射
	<ol>
		<li>按照所述方法拉制硼硅酸盐玻璃微毛细管 24.</li>
		<li>将针连接到三维粗调手动操作器的固定架上，并用精细镊子折断针尖。</li>
		<li>加载针头时，将一滴细菌培养物置于盖玻片上。打开显微注射仪和气体钢瓶，将针尖轻微浸入液滴中，吸入所需量的细菌样品。</li>
		<li>为校准注射体积，将一滴矿物油置于盖玻片上，并注入细菌样品。使用显微测微尺测量液滴直径，计算注入体积 [V = (4/3)πr³]3]. 
		注意：采用40 psi、50毫秒的注射参数，并使用第3.1节所述的细菌制备液，可获得约2,000 CFU/nl。</li>
		<li>使用塑料模具按照Westerfield所述方法制备注射板23.</li>
		<li>将幼虫转移至注射板中，使用细毛刷将其排列整齐。按照第3.3.1节所述方法定向并注射幼虫。</li>
		<li>为评估斑马鱼的存活情况，将感染的幼鱼单独转移至24孔板中，每孔加入1 ml E2培养基，于28 °C培养。在接下来的2–5天内每天观察感染的幼鱼，并绘制存活率随时间变化曲线。图3B). </li>
	</ol>
	</li>
	<li>斑马鱼幼鱼细菌定量的接种方法 
	注意：在无菌操作台内操作，以避免污染。
	<ol>
		<li>为评估感染后0小时注入鱼体内的细菌数量以及在预定时间点进行细菌定量，使用过量三卡因（200–500 mg/L）处死斑马鱼幼鱼。将单个幼鱼置于含200 µl 0.1%辛基酚聚氧乙烯醚和1×PBS的1.5 ml聚丙烯微量离心管中，使用研杵进行机械匀浆。 
		注意：为确认注射体积中的细菌载量，可将等量剂量泵入无菌的1×PBS液滴中并进行涂板培养。</li>
		<li>将斑马鱼幼鱼匀浆在无菌水中进行系列稀释，并接种至溶菌肉汤（LB）琼脂平板上。也可将幼鱼样品接种于刚果红TCS平板以区分不同菌落形态 志贺氏菌 是否保持了毒力质粒。 
		注意：作为对照，需接种3尾以上未感染的鱼，以检测用于感染实验的斑马鱼幼鱼的状态。</li>
		<li>在37 °C条件下将平板过夜培养后，计数细菌菌落。如图所示 图 3C，使用对数尺度表示。 
		注意：感染斑马鱼幼鱼期间的细菌载量也可通过荧光标记进行可视化观察 志贺氏菌 以及第3.7或3.8节所述的显微成像（图3D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>斑马鱼幼虫免疫染色
	<ol>
		<li>在预定时间点，使用过量三卡因处死幼虫。将鱼收集至1.5 ml聚丙烯微量离心管中（每管10至20条幼虫）。</li>
		<li>使用含0.4%辛基酚聚氧乙烯醚的4%多聚甲醛PBS缓冲液（1x PBS）固定幼虫，在旋转摇床上孵育2小时（室温）或过夜（4 °C），以防止幼虫聚集。 
		注意：电子显微镜可用于感染斑马鱼幼鱼的超微结构分析。在此情况下，应将麻醉后的胚胎按照 Mostowy 的方法进行固定和处理 等19.</li>
		<li>用1×PBS含0.4%辛基苯基聚氧乙烯醚洗涤3次，每次5分钟，然后在封闭液（含10%胎牛血清、1% DMSO、0.1%吐温-20的1×PBS）中室温封闭1小时。</li>
		<li>将一抗用封闭液稀释。将幼虫加入稀释后的一抗溶液中，于4 °C在旋转摇床上孵育过夜。一抗的使用参照上文第1.4.3节所述。</li>
		<li>将幼虫在室温下用含0.1%聚氧乙烯单月桂酸山梨醇酐酯的1×PBS缓冲液洗涤4次，每次15分钟。</li>
		<li>将二抗用封闭液稀释。将幼虫加入稀释后的二抗溶液中，于4 °C在旋转摇床上孵育过夜。所用二抗和鬼笔环肽与1.4.4节所述相同。</li>
		<li>室温下用含0.1%聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯的1×PBS溶液洗涤4次，每次15分钟。若需对宿主细胞核进行染色，在第一次洗涤时加入DAPI（终浓度150 nM）。</li>
		<li>为保存荧光标记的幼虫，将其依次置于含15%、30%、60%和80%甘油的梯度溶液中孵育，溶剂为1×PBS与0.1%聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯，每步孵育2小时（室温）至过夜（4 °C）。 
		注意：染色后的幼虫可长期保存（例如在4 °C条件下，于80%甘油中保存（约4个月）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定斑马鱼幼鱼的显微成像
	<ol>
		<li>将固定并包埋于甘油中的幼虫转移至35 mm培养皿中的一小滴80%甘油内（用于体视显微镜观察）或全玻璃底培养皿中（用于共聚焦显微镜观察）。</li>
		<li>拍摄感染幼虫的Z轴层扫图像序列，并根据需要对图像进行处理。</li>
		<li>使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜配合10X或20X物镜进行整体生物成像。随后使用共聚焦显微镜配合40X、63X或100X物镜观察单个细胞，以及自噬标记物和细胞骨架标记物向单个细菌的募集情况 体内19 （图4A 和 4B). 
		注意：将鱼在尾部肌肉处进行感染，并用甘油将鱼体平铺固定于玻璃底培养皿底部，以便于聚焦观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>感染斑马鱼幼鱼的活体显微成像 
	注意：幼虫具有光学通透性，因此 体内 可利用GFP-Lc3转基因斑马鱼品系观察自噬体25按照第3.3节所述方法感染斑马鱼幼鱼，并按照本节所述方法进行样品制备。
	<ol>
		<li>在E2培养基中制备1%低熔点琼脂糖（LMA），并冷却至35–37 °C，以避免对幼虫造成损伤或死亡。将LMA滴加至35 mm培养皿（用于体视显微镜观察）或全玻璃底培养皿（用于共聚焦显微镜观察）中。</li>
		<li>将麻醉后的斑马鱼幼鱼逐个（尽量减少带入的水分）转移至LMA液滴中。使用画笔将幼鱼调整至所需位置，并等待琼脂糖凝固。</li>
		<li>用低熔点琼脂糖（LMA）覆盖整个培养皿表面，并加入含有200 µg/ml三卡因的E2溶液，以防止样品干燥并使鱼类能够从水中进行氧气交换。</li>
		<li>使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜配合10X或20X物镜对整条斑马鱼幼鱼进行成像。使用共聚焦显微镜配合40X、63X或100X物镜观察细菌自噬体（bacterial autophagosomes）即，围绕的 GFP-Lc3 阳性液泡 志贺氏菌) 体内.</li>
		<li>随时间对感染的幼虫进行Z轴层扫成像（例如每2分钟一次，持续数小时，以实时观察自噬体及其动态变化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 体内自噬与细胞骨架的功能分析 In Vivo
注意：可在整体动物水平和单细胞水平上监测自噬的药物学和遗传学干扰对感染进程的影响。
<ol>
	<li>通过吗啉代寡核苷酸注射操控自噬
	<ol>
		<li>将吗啉代寡核苷酸用无菌水重悬，于65 °C温育10分钟，配制成1 mM的储存液。室温保存。 
		注意：吗啉代寡核苷酸注射必须在1-4细胞期胚胎中进行。</li>
		<li>用含0.1%酚红的无菌Dulbecco磷酸盐缓冲液配制吗啉代寡核苷酸工作液。按第3.4.2节所述方法装填注射针，吗啉代寡核苷酸的注射体积可参照第3.4.3节进行校准。 
		注意：酚红有助于观察注射体积。</li>
		<li>制备胚胎定位腔（i.e.，将载玻片用氰基丙烯酸酯胶水粘附于10 cm培养皿盖上，其边缘部分朝向注射针并适当去除）。用少量水将1-4细胞期胚胎转移至该腔内，并用细毛笔将其排列整齐。</li>
		<li>平稳穿透卵膜和卵黄。进入后，踩下脚踏开关，注入所需体积的吗啉代寡核苷酸溶液。 
		注意：注射体积应尽量控制在0.5 - 2 nl；超过5 nl的体积可能导致发育异常并增加胚胎死亡率。</li>
		<li>显微注射后，按第3.2节所述方法对胚胎进行消毒（漂白处理），并在含有E2培养基的培养皿中于28 °C条件下孵育。</li>
		<li>在受精后72小时，对对照组（i.e.，注射对照吗啉代寡核苷酸的斑马鱼幼鱼）或p62功能缺失幼鱼（i.e.，注射p62吗啉代寡核苷酸的斑马鱼幼鱼）按第3.4节所述方法接种Shigella。随后2-5天内按第3.5节所述评估存活率和细菌负荷。按第3.7节及图4C所示方法对固定后的斑马鱼幼鱼进行成像，或按第3.8节所述对活体斑马鱼幼鱼进行成像。 
		注意：吗啉代寡核苷酸的有效剂量可根据其对转录剪接或蛋白质翻译的抑制效率来评估（见讨论部分）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

当监测自噬与细胞骨架时 体外 使用组织培养细胞，第1和第2节中描述的方案可适用于多种类型的组织培养细胞。此外，为追踪自噬（例如，ATG8/LC3阳性自噬体）和细胞骨架（例如，肌动蛋白尾部，septin笼状结构）的实时动态 志贺氏菌 使用活体成像技术研究感染过程时，可按照先前所述方法，对组织培养细胞进行瞬时转染，转染所用质粒可带有GFP、RFP或CFP标签7,8. 以提高被感染细胞的比例 志贺氏菌 (即，考虑到实时分析的需求，通常是可取的 志贺氏菌 可侵染100:1 MOI条件下5-30%的HeLa细胞），直接加入400 µl 志贺氏菌 （OD600 = 0.3-0.6）加入至含有2 ml MEM（无血清饥饿处理）的细胞中，感染后至少等待1.5小时，以确保细菌充分侵入、从吞噬体中逃逸、复制、被自噬识别以及被septin笼状结构包裹。或者，也可使用 志贺氏菌 表达黏附素 AfaE 且在上皮细胞中具有比 M90T 菌株更强侵袭能力的 M90T AfaI 菌株28值得注意的是，M90T AfaI 菌株尚未进行测试 体内 使用斑马鱼。培养板的 志贺氏菌 菌落可在 4 °C 下保存 2–3 天，并用于多次实验。然而，随着时间推移，菌落的 志贺氏菌 丢失毒力质粒的菌株也可能吸收刚果红，从而表现出似乎仍保留毒力质粒的特征。因此，我们建议尽可能使用新鲜的菌种。
在监测感染的细胞生物学过程时 体内，第3和第4节所述方案使用野生型AB系斑马鱼。用于监测 志贺氏菌-白细胞相互作用研究，可使用转基因斑马鱼品系， 例如, mpx：GFP 或 lyz：DsRed 用于中性粒细胞的可视化19,29,30 或 mpeg1:mcherry 用于可视化巨噬细胞19,31. 为了观察自噬过程 体内GFP-Lc3 转基因斑马鱼品系19,24 可按照第3.8节所述使用。
为了干扰自噬作用 体内有效吗啉代寡核苷酸剂量需根据其抑制转录本剪接或蛋白质翻译的效率，通过实验进行评估。建议开展梯度浓度实验，并通过RT-PCR（针对剪接抑制型吗啉代寡核苷酸）或SDS-PAGE（针对翻译抑制型吗啉代寡核苷酸）验证目标分子的敲低效果。32使用硫氰酸胍-苯酚-氯仿法可从斑马鱼胚胎或幼鱼中分离RNA。为从斑马鱼幼鱼（每管8至15条）中提取蛋白质，需在200 µl裂解缓冲液（1 M Tris，5 M NaCl，0.5 M EDTA，0.01%辛基苯基聚氧乙烯醚，以及蛋白酶抑制剂）中用研杵进行机械匀浆。将样品于4 °C、19,000 × g离心15分钟，随后将上清液转移至新管中。加入Laemmli缓冲液，并于95 °C加热15分钟。裂解产物可保存在-80 °C直至使用，并按2.3节所述进行Western blot分析。
斑马鱼是研究发育生物学、遗传学和人类疾病的理想模型生物，因其胚胎透明、繁殖力强、发育迅速且基因组与人类高度保守而被广泛应用于科学研究。 体内 药物应用。可结合使用吗啉寡核苷酸与已建立的药物来调控自噬作用（例如，雷帕霉素和巴佛洛霉素）。未感染和/或感染的幼虫可用雷帕霉素（1.5 µM）或巴佛洛霉素（80 nM）处理，药物溶于E2培养基中，随后通过蛋白质印迹法检测自噬流，具体方法如前所述。 25,33通过自噬调控对感染结果及感染幼虫存活率的影响，可按照第3.5节所述进行评估。
除了研究宿主细胞决定因素外， 体外 和 体内 可采用相关方案评估细菌中参与自噬识别的决定因子，利用在自噬识别上存在差异的细菌突变株进行研究， 例如., 志贺氏菌ΔicsA （the 志贺氏菌 蛋白IcsA招募N-WASP，进而招募Arp2/3复合物，以形成肌动蛋白尾和septin笼；若缺乏IcsA，则无法形成肌动蛋白尾和septin笼 ShigellaΔicsB (志贺氏菌 通过细菌效应蛋白 IcsB 避免自噬反应，该蛋白可阻止自噬机制被招募到 IcsA; 在缺失的情况下，可能会形成更多的 septin 笼状结构，以及更多的自噬现象7,8.
Shigella 并非斑马鱼的天然病原体，其最适生长温度为 37 °C。然而，已有研究表明，在 28 °C 条件下，斑马鱼幼鱼体内仍可表达并发挥功能的毒力因子包括介导 Shigella 侵袭、从吞噬空泡中逃逸以及在细胞质中复制的相关因子19。28 °C 是斑马鱼饲养最常用的温度，也是确保斑马鱼正常发育的标准温度23。值得注意的是，在人类志贺氏菌病中发生的主要致病事件（即 巨噬细胞死亡、上皮细胞内的侵袭与增殖、细胞间传播、宿主上皮组织的炎症性破坏）在 Shigella 感染的斑马鱼模型中均得到了真实再现19。
自噬和细胞骨架基因普遍存在表达，具有广泛的生物学功能。小鼠研究表明，关键自噬基因26或septin基因5的敲除会导致胚胎致死，因此这些基因中的一些可能对斑马鱼的发育也是必需的（尽管由于斑马鱼具有多个旁系同源基因33，这一问题可能有所减轻）。如果情况如此，可通过以下几种替代策略来克服该问题：（i）使用药理学试剂调控自噬和细胞骨架；（ii）可对吗啉代寡核苷酸（morpholinos）进行剂量滴定；（iii）可针对特定细胞类型设计基因敲除；和/或（iv）可靶向那些对动物发育非必需但参与自噬识别的基因（e.g.，p62）。
尽管斑马鱼是研究自噬和细胞骨架的理想模型系统 志贺氏菌 感染领域目前缺乏分子工具。该领域需要开发新工具，并推动目的蛋白的细胞特异性表达。为了敲低自噬/细胞骨架相关基因的表达，需要设计新的吗啉代寡核苷酸序列，并开发用于基因组编辑的 novel 方法（例如，TALEN，CRISPR/Cas9）也可用于斑马鱼研究。同时，一些先前为人类或小鼠研究开发的工具可能同样适用于斑马鱼。
细胞内细菌 S. flexneri 已成为研究生物学关键问题的卓越模式生物，包括细菌如何被免疫系统识别的能力1,2宿主细胞利用septins限制病原体的运动能力 S. flexneri 并将其靶向自噬，这是细胞自主免疫的关键组成部分7,8这些观察结果提示了一种研究自噬及其降解胞质内细菌能力的全新分子框架。目前的主要问题是全面解析其背后的分子与细胞事件，并验证所分析的这些事件 体外 在细菌感染期间 体内 使用相关的动物模型。为此，斑马鱼已被确立为分析的宝贵新宿主 S. flexneri 感染19细菌与宿主细胞之间的相互作用可进行高分辨率成像，斑马鱼模型将有助于深入理解细胞生物学中的相关机制 志贺氏菌 感染 体内斑马鱼幼虫可用于研究细菌自噬在宿主防御中的作用，已有研究表明，自噬功能的紊乱会负面影响宿主在应对感染时的存活率 志贺氏菌 感染19.
由研究产生的观察结果 志贺氏菌，septin 笼状结构与自噬 体外 使用组织培养细胞和 体内 使用斑马鱼幼虫可能有助于深入理解宿主防御机制，还可能为开发抗击传染病的新策略提供思路。
本报告的一个关键目标是解析所分析的分子与细胞事件 体外 (即自噬，肌动蛋白尾部， septin 围笼）在细菌感染期间 体内 在完整生物体的背景下，使用斑马鱼幼鱼进行研究。若不熟悉斑马鱼生物学特性及操作方法，可参考详细的斑马鱼养殖标准操作规程。23 和 体内 斑马鱼感染分析19,35.

志贺氏菌 flexneri一种革兰氏阴性侵袭性肠道致病菌，可从吞噬体逃逸至细胞质，并聚合宿主肌动蛋白细胞骨架，以逃避细胞质免疫应答并促进细胞内和细胞间移动1,2尽管对基于肌动蛋白的运动已有一定理解 体外3,4，限制细菌扩散的机制 体内 尚未完全阐明。这对于更全面地理解先天免疫和宿主防御至关重要。
Septins 是后生动物中高度保守的一类蛋白质，属于鸟苷三磷酸（GTP）结合蛋白，能够组装成异源寡聚复合物，并形成非极性纤维，与细胞膜和细胞骨架相关联5,6。近期研究发现，受感染的宿主细胞可通过将靶向自噬的细菌包裹在“septin 笼”（septin cages）内，从而抑制 Shigella 的肌动蛋白依赖性运动，这揭示了首个能够拮抗肌动蛋白依赖性运动的细胞机制7,8。目前，“septin 生物学与感染”领域尚有广阔的研究空间。由多种病原体（例如，Listeria monocytogenes7,9,10、Mycobacterium marinum7,8、Candida albicans11）诱导的 septin 组装，可能成为宿主防御中的关键问题5,12。
自噬是一种高度保守的细胞内降解过程，因其能够将胞质细菌运送至溶酶体，被视为细胞自主免疫的关键组成部分13,14然而，细菌自噬的作用 体内 限制或促进细菌复制的机制仍不清楚15,16斑马鱼（Danio rerio在幼体阶段，斑马鱼的先天免疫系统已具备功能，且其身体透明，便于观察，因此已成为研究感染的脊椎动物模型17,18近期研究已阐明斑马鱼幼鱼的易感性 S. flexneri一种细菌自噬的范式15，并已使用 志贺氏菌-利用斑马鱼感染模型研究通过调控自噬进行抗菌治疗 体内19.
本报告提供了研究的新工具和检测方法 S. flexneri 自噬与细胞骨架的相互作用。首先，描述了监测自噬-细胞骨架相互作用的实验方案。 志贺氏菌 人乳头瘤病毒HeLa细胞系感染。为评估自噬-细胞骨架相互作用对 志贺氏菌 感染过程 体外，提供了通过siRNA或药理试剂操控自噬和细胞骨架组分的方法。最新研究显示，通过使用 志贺氏菌 斑马鱼幼鱼感染，类似的检测方法可用于研究感染的细胞生物学 体内制备和感染斑马鱼幼鱼的方案，以及评估宿主对感染的反应 志贺氏菌 感染 体内，提供了用于测定宿主存活率和感染幼虫细菌负荷的方案。用于监测septin和自噬标志物募集的方法 志贺氏菌 （使用固定或活体斑马鱼幼鱼）以及检测这些过程作用的方法 体内 [使用吗啉代寡核苷酸（在1-4细胞期胚胎中注射）或药理学试剂（直接加入斑马鱼浴水中）] 的方法也进行了讨论。该计划&#160;该研究有望揭示细胞质宿主反应控制感染所需的机制。

<table><tbody><tr><td>雷帕霉素A1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1793&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>苯并噻嗪</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0560</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃微毛细管&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30038</td><td></td></tr><tr><td>粗调手动操作器&amp;nbsp;</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>细胞松弛素D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>氟氯苯脲&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32974</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG（H+L）抗体</td><td>Molecular Probes</td><td>N/A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG（H+L）抗体</td><td>Molecular Probes</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>JetPEI转染试剂</td><td>Polyplus transfection</td><td>101-01N</td><td></td></tr><tr><td>拉盾菌素B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5288</td><td></td></tr><tr><td>LC3抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-2220</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr><tr><td>MatTek玻璃底培养皿</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.0-14</td><td></td></tr><tr><td>含L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的MEM培养基&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>41090028</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸溶液</td><td>GIBCO</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>显微注射仪&amp;nbsp;</td><td>Narishige</td><td>IM-300</td><td></td></tr><tr><td>微电极拉制仪&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instrument Co., Novato,</td><td>P-87&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P35G-1.0-14</td><td></td></tr><tr><td>单克隆抗乙酰化微管蛋白抗体&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td></td></tr><tr><td>诺考达唑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>N-苯基硫脲&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>鬼笔环肽&amp;nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>酚红溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>p62/SQSTM1抗体</td><td>Cliniscience</td><td>PM045</td><td></td></tr><tr><td>雷帕霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8781</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>GIBCO</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>转染试剂</td><td>Life Technologies</td><td>12252-011</td><td></td></tr><tr><td>含DAPI的Vectashield硬封片介质&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

使用 shigella flexneri 研究自噬-细胞骨架相互作用

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

福氏志贺菌 是一种胞内病原体，可从吞噬体逃逸至胞质溶胶，并聚合宿主肌动蛋白细胞骨架以促进其运动性和扩散。最新研究表明，参与肌动蛋白介导运动的蛋白质也与自噬相关，自噬是一种重要的细胞内降解过程，在细胞自主免疫中起关键作用。值得注意的是，宿主细胞可能通过自噬机制抑制该病原体的肌动蛋白介导运动 S. flexneri 通过将细菌区隔在“septin笼”内并靶向自噬途径来实现。这些观察结果表明，对septin这一类丝状GTP结合蛋白的更全面理解，将为自噬过程提供新的见解。本报告描述了监测由septin介导的自噬-细胞骨架相互作用的实验方案 S. flexneri 体外实验 使用组织培养细胞和 体内 利用斑马鱼幼鱼。这些方案能够从分子、细胞以及整体生物体水平上研究调控细菌扩散的细胞内机制。

组织培养细胞感染后 体外, S. flexneri 可从吞噬体中逃逸并侵入细胞质。在细胞质中，宿主细胞可抑制其基于肌动蛋白的运动能力。 志贺氏菌 通过将细菌分隔在 septin 笼状结构内（图1A). 被 septin 笼捕获的细菌也可被自噬标志物 p62 标记（图1B）以及 LC3（图1C）。这些观察结果揭示了一种限制侵入性病原体扩散的新型宿主防御机制，同时也揭示了自噬与细胞骨架之间新的关联。值得注意的是，自噬标志物的耗竭显著减少了细菌的septin笼样包裹（图 2A，并且研究还表明，septin笼状结构的耗竭会显著减少自噬标志物的募集8因此，至少在以下情况下 志贺氏菌，septin 笼状结构的组装与自噬体的形成可被视为相互依赖的过程。其他细胞在区室化过程中所需的因素包括 志贺氏菌 由septin笼状结构包含的肌动蛋白聚合和肌动蛋白-肌球蛋白活性（图2B).
目前尚无志贺菌病的天然小鼠模型，且对该疾病的研究 志贺氏菌 发病机制、septin 生物学与细菌自噬 体内 可受益于一种新的感染动物模型——斑马鱼幼鱼19. 可通过在不同解剖位点注射细菌来感染斑马鱼幼体，例如用于存活实验的尾静脉注射，以及用于 体内 显微镜技术图3A）。根据剂量的不同， S. flexneri 注射到斑马鱼幼鱼体内的病原体可能在感染后48小时内被清除，也可能导致进行性感染并最终致死（图3B-3D). 志贺氏菌 毒力因子在以下条件下表达： 28 ° C，斑马鱼的最佳生长温度，以及斑马鱼感染 志贺氏菌 严格依赖于其III型分泌系统（T3SS）19，人类疾病中一种关键的毒力决定因子。综上所述，这些观察结果表明，斑马鱼幼鱼代表了一种有价值的新型宿主 体内 分析 志贺氏菌 感染
斑马鱼幼鱼的光学通透性可实现对septin笼状结构的可视化观察 体内 (图 4A)，这一成果此前从未在哺乳动物宿主模型中实现。为补充证明肌动蛋白样GTP结合蛋白（septin）笼状结构可捕获靶向自噬的细菌 体内，可感染表达 GFP-Lc3 的转基因斑马鱼幼鱼，并观察自噬标志物向 志贺氏菌 (图 4B）。用于超微结构分析的 志贺氏菌 自噬体 体内电子显微镜可用于清晰显示细菌被双层膜空泡在细胞质中隔离的现象19自噬被视为细胞自主性免疫的关键组成部分，以及抵抗胞质内细菌的重要防御机制。14-16. 为表征自噬功能 体内，可使用p62吗啉代寡核苷酸处理的斑马鱼幼鱼。与核心自噬机制不同[例如36 种自噬相关蛋白（ATGs）26p62 对于脊椎动物的发育并非必需27 因此，在感染前，斑马鱼幼鱼能够正常发育。值得注意的是，p62 耗尽的幼鱼接种后 S. flexneri 导致显著升高的死亡率和细菌负荷增加19。与……一致 体外 研究显示，隔蛋白笼状结构的组装与自噬体形成相互依赖7,8，septin 募集至 志贺氏菌 在p62耗竭的幼虫中明显减少（图 4C这些数据表明，斑马鱼的存活依赖于 p62 介导的自噬作用来控制细胞内细菌感染。
<img alt="细胞组分的荧光显微镜观察：DAPI、F-actin、SEPT9、p62、GFP-LC3；合并分析。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 体外形成的隔蛋白笼状结构 in vitro。 (A) HeLa细胞感染S. flexneri 4小时40分钟，固定后用SEPT9抗体和鬼笔环肽标记，并通过共聚焦显微镜成像。比例尺，1 µm。 (B) HeLa细胞感染S. flexneri 4小时40分钟，固定后用p62和SEPT2抗体标记，并通过荧光光学显微镜成像。比例尺，1 µm。 (C) HeLa细胞转染GFP-ATG8/LC3，感染S. flexneri 4小时40分钟后，固定并用SEPT2抗体标记，通过荧光光学显微镜成像。比例尺，1 µm。这些图片经修改自Mostowy et al7。
<img alt="Protein expression, Shigella percentage data in siRNA knockdown, bar graphs, Western blot analysis." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 细胞需求 志贺氏菌- Septin 笼状结构的形成。 （A） HeLa 细胞用对照（CTRL）、p62、ATG5、ATG6 或 ATG7 siRNA 处理。收集 siRNA 处理细胞的全细胞裂解液，通过免疫印迹检测 GAPDH、p62、ATG5、ATG6 或 ATG7，以验证 siRNA 沉默效率（上图）。siRNA 处理的细胞随后被感染 S. flexneri 孵育4小时40分钟，固定并标记，用于定量显微分析。图示（底部）表示平均百分比 ± 标准误（SEM） 志贺氏菌 来自每种处理条件下至少3次实验的SEPT2笼内. (B) HeLa 细胞被感染 S. flexneri，用DMSO、细胞松弛素D（CytD）、Latrunculin B（LatB）、诺考达唑（Noco）或blebbistatin（Bleb）处理，在4小时40分钟后固定并进行标记，用于定量显微镜分析。图表表示均值±标准误（SEM）的百分比 志贺氏菌 来自每种处理的两次独立实验的SEPT2笼内. 这些图示已根据 Mostowy 的原图修改而成 等7.
<img alt="Zebrafish infection experiment; graphs show survival vs. time; fluorescence levels indicate infection." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 斑马鱼模型 志贺氏菌 感染。（A） 用于说明斑马鱼幼鱼在体视显微镜下定位方向的图像。（左图）受精后72小时的斑马鱼幼鱼在注射板中呈侧位放置，其背侧朝向注射针。（中图）通过将细菌（红色溶液）注射至泄殖腔孔后方的尾静脉，建立血液感染模型。（右图）通过将细菌（红色溶液）注射至体节上方，实现尾部肌肉感染。 （B） 受精后72小时幼虫注射不同剂量后的存活曲线 S. flexneri 并在指定温度下孵育 28 °C 感染后48小时。有效接种量被分为低（&lt;103 CFU，空心圆圈），中等（~4 x 103 CFU，空心三角）或高（~104 CFU，空心方块）。每个接种量类别的平均值 % ± 标准误（水平条），来自 ≥3 次独立实验。 (C) 通过在LB培养基上平板计数，测定感染后不同时间点单个幼虫匀浆中活菌数量。注意，仅将存活至感染结束的幼虫纳入计数分析。图中同时显示均值 ± 标准误（SEM，水平条表示）。 (D) GFP的分布志贺氏菌 通过荧光体视显微镜在感染后不同时间点进行活体成像，使用低、中或高剂量的接种物（尾静脉注射）进行检测。透射图像（灰色）与GFP荧光（绿色）的叠加图。 （B）-(D)这些图示已根据 Mostowy 的原始内容进行了修改 等19.
<img alt="Fluorescence microscopy, GFP-tagged Shigella, SEPT7, protein colocalization, overlay analysis." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 细胞生物学 志贺氏菌 感染 体内. （A） 斑马鱼幼体在尾部肌肉中接种了GFP-志贺氏菌 （低剂量）处理24小时后，固定，用抗SEPT7抗体（红色）和抗GFP抗体（绿色）标记，共聚焦显微镜成像。比例尺， 5 µm. （B） GFP-Lc3 斑马鱼幼鱼用 mCherry 感染志贺菌 （中剂量）处理4小时，固定后用抗mCherry抗体（红色）和抗GFP抗体（绿色）进行免疫荧光标记，共聚焦显微镜成像。比例尺， 1.5 µm. (C) 经注射对照（CTRL；左图）或 p62（右图）吗啉代寡核苷酸的斑马鱼幼鱼感染了GFP-志贺氏菌 孵育4小时（中剂量），固定后用抗SEPT7抗体（红色）和抗GFP抗体（绿色）标记，通过共聚焦显微镜成像。箭头指示部分示例 志贺氏菌 被困在 septin 笼中的（对照）或未被困在 septin 笼中的（p62 耗竭）细菌，感染后 4 小时。比例尺， 5 µm这些图示已根据 Mostowy 的内容进行了修改 等19.

为了抑制病原体扩散，宿主细胞会重组其细胞骨架以区隔细菌并诱导自噬。使用 志贺氏菌 组织培养细胞感染过程中，宿主与病原体的相关决定因子被鉴定并表征。利用斑马鱼模型 志贺氏菌 感染，对所发现的分子和机制的作用进行研究 体内.

使用 Shigella flexneri 研究自噬-细胞骨架相互作用

志贺氏痢疾杆菌（Shigella flexneri）是一种胞内病原体，可从吞噬体中逃逸进入细胞质，并利用宿主细胞的肌动蛋白细胞骨架进行聚合，以促进……

本实验的总体目标是通过利用斑马鱼幼虫中的组织培养细胞，在体外和体内研究感染过程中控制细菌扩散的细胞内机制。体外方法首先准备志贺氏菌（*Shigella flexneri*），这是一种革兰氏阴性且具有肠侵袭性的细菌病原体。随后用该菌感染细胞，并在感染期间使用RNA干扰或药理学试剂来调控宿主的自噬机制和细胞骨架。为了在体内研究志贺氏菌引起的自噬与细胞骨架之间的相互作用，需在受精后三天对斑马鱼胚胎进行感染，该步骤适用于上述两种方法。最后一步是用自噬和细胞骨架标记物对组织进行标记。最终结果将有助于揭示细胞质宿主反应控制感染所需的机制。相较于李斯特菌等其他细菌，使用凝胶研究细菌自噬的优势在于，凝胶靶向的自噬还可被包裹在起始的笼状结构中。该方法有助于回答自噬研究领域中的关键问题，例如细胞骨架在自噬中的作用是什么，以及自噬在限制或促进细胞内细菌方面的作用是什么？该技术的意义可延伸至其他自噬过程，例如病毒或线粒体的自噬，同时也可能对具有septin或自噬成分的人类疾病具有治疗意义。这些是斑马鱼的示例。志贺氏菌感染至关重要，因为向斑马鱼注射细菌的步骤较难掌握，针头制备和正确注射需要较长时间且要求高精度。斑马鱼感染的显微观察在此方案中需要经验积累。使用福氏志贺菌（*Shigella flexneri*）野生型菌株M9DT，从冻存的甘油菌种中取出，在刚果红三联胰蛋白胨大豆平板上划线接种细菌，并于37°C培养过夜。此外，次日在含10%胎牛血清的MEM培养基中，将大量细胞接种于六孔板中。挑选单个克隆，并于次日在TCS培养基中37摄氏度振荡培养过夜。用新鲜TCS培养基按1:80比例稀释，进行传代培养。当亚培养物在 600 纳米处的光密度值介于 0.3 至 0.6 之间时，以 1000 × g 离心 5 分钟收集细菌。然后用 MEM 重悬菌体沉淀，使其达到相同的光密度。将细胞以100:1的感染复数直接进行感染。将稀释于MEM中的查加氏体加入已铺好的海拉细胞中，并将每孔的MEM总体积补至2毫升。随后，为最大程度促进细菌与宿主细胞的黏附，将培养板在室温下以700 ×g离心10分钟，并继续在室温孵育30分钟，使细菌在感染期内完成对细胞的感染。轻轻洗涤细胞两次。使用新鲜的MEM培养基以进一步清除细胞外细菌，根据经验观察，将细胞在含有庆大霉素的完全培养基中孵育1至4小时。随后，固定并标记感染的细胞。使用63倍或100倍物镜通过落射荧光或共聚焦显微镜成像，以分辨DAPI标记的Septin笼状结构；这些结构呈环状，直径约为0.6微米，包围着细胞质中聚合肌动蛋白的细菌。Septin笼内的细菌也可通过自噬标志物如p62和LC3以及ATG8进行识别。从概念上讲，该实验流程中最困难的部分是在体内和体外识别细菌自噬体及Septin笼结构，这需要精细的显微观察与分析。此外，必须确保在多个生物学重复实验中分析了适当数量的事件，并确保在用沙门氏菌感染海拉细胞后具有统计学意义。首先，让细菌至少有2.5小时的时间进入细胞质。接着，可进行药物处理以作用于细胞骨架。作为阴性对照，在每2毫升含细胞的培养基中加入一至五微升稀释的药物储备液。用含DMSO的MEM培养基处理一组细胞，然后将细胞孵育30分钟，以调节细胞的自噬流。使用20纳摩尔雷帕霉素或160纳摩尔巴佛洛霉素。然后在处理后将细胞孵育4至12小时。按照文本方案中所述的方法固定并标记细胞。该技术可模拟体内凝胶感染与自噬细胞骨架之间的相互作用。开始传代并收集凝胶的方法如前所述：用1倍PBS洗涤细菌，然后在1000 ×g下离心10分钟。然后将细菌重悬于 80 µL 含 0.1% 酚红的 PBS 中，将此样品置于冰上保存。在计划注射前 72 小时，每纳升应含有约 2000 个细菌。从产卵的斑马鱼中收集胚胎，以去除任何细胞外污染物。用含0.003%次氯酸钠的E二培养基清洗胚胎10分钟。10分钟后，更换为E二培养基，并用E二培养基清洗胚胎5次。接着，在10厘米培养皿中加入50毫升E二培养基和最多50个胚胎。在受精后24小时，于28摄氏度下共培养约100个胚胎。在E2培养基中加入0.003%苯硫脲以处理正在发育的胚胎，防止黑色素形成，从而避免干扰显微观察。使用含200微克/毫升三卡因的E2培养基对72小时的幼鱼进行麻醉处理，开始实验。然后使用显微操作器和精细镊子，在显微镜下折断显微注射针的尖端，并检查断裂情况。现在首先装载注射针，将一滴细菌培养物转移到显微镜载物台上的盖玻片上。其次，打开显微注射仪和气体钢瓶。第三，将针尖插入液滴中。第四，填充针管，以评估在 cha 感染期间斑马鱼的存活情况。使用细毛刷进行尾静脉注射。将麻醉后的幼虫侧向放置在注射板上，使其背侧朝向针头。此时针尖应靠近泄殖腔开口，并对准尾静脉。然后刺穿皮肤，注入一簇体积为五纳升的细菌悬液。成功注入尾静脉的标志是观察到酚红沿静脉延伸。从技术上讲，尾静脉注射是该操作中最困难的部分，需要使用斑马鱼幼鱼进行练习。共聚焦显微镜观察也可能具有挑战性，因为幼鱼需要适当处理。注射后，将每只感染的幼虫单独转移至含有1毫升E2培养基的24孔板的各个孔中。在28°C条件下孵育培养板，并每天观察胚胎情况。以观察Septin和自噬标记物的募集情况。在尾部肌肉等局部位置注射Ella。按照前一节所示方法准备注射幼虫。将斑马鱼侧向放置，并将针头置于肌肉上方。随后，将针头刺入两个体节之间的空隙，并向其中注射约一纳升的Ella。若成功注射至尾部肌肉，由于酚红缓冲液的作用，被注射的体节会呈现红色。同时，已准备好在37摄氏度下融化的E2培养基中含0.1%低熔点琼脂糖。将琼脂糖液滴逐一加入玻璃底培养皿中。用极小体积的溶液将注射后的幼虫转移至琼脂糖液滴中，在液滴中按所需方向摆放幼虫，并让琼脂糖凝固。接下来，用LMA覆盖整个培养皿，随后用含三卡的E2处理。然后每隔两分钟采集Zacks，持续数小时。在受感染的组织培养细胞中，沙门氏菌从吞噬体逃逸至胞质溶胶，宿主细胞骨架可在此重排，并将细菌包裹在类似septin笼状的结构中进行区室化。被分隔蛋白笼捕获的细菌会被自噬标记物如 P62 和 LC3 所识别。斑马鱼是研究 CHA 感染体内过程的一种有价值的新型宿主。根据感染剂量的不同，斑马鱼可在感染后 48 小时内清除低剂量感染，或在高剂量情况下因感染而死亡。斑马鱼RV的光学透明性使得在体内可视化观察septin笼状结构成为可能，这一成果此前尚未在其他脊椎动物模型中实现，从而补充了septin笼可捕获靶向自噬的细菌的证据。通过感染表达GFP-LC3的转基因斑马鱼，可实时观察LC3阳性自噬体在体内对胞内炭疽杆菌（cha）的招募情况，以表征自噬过程。P62 morpho处理的幼鱼被注射炭疽杆菌（chala）或对照物。结果显示，morpho处理的幼鱼表现出正常的septin笼结构。然而，在 P 62 形态处理的幼虫中，septin 向 chala 的募集减少，表明 P 62 是自噬机制中的一个必要组分。一旦掌握该技术，PHI 幼虫实验可在操作得当的情况下于一至两小时内完成。其他方法，例如利用 CRISPR-Cas 系统进行基因组编辑，可用于操控斑马鱼基因组。此外，还可构建新型荧光标记的斑马鱼品系，通过活体成像在凝胶感染过程中实时追踪自噬与细胞骨架的动态变化。Chaga Septin 笼已被用于研究自噬与细胞骨架之间的相互作用，并为感染和细胞生物学领域的研究人员揭示细胞骨架在自噬中的新功能铺平了道路。请注意，操作 Ella 时可能具有极高危险性，在执行该实验步骤时，必须始终在二级生物安全实验室环境中进行，并采取相应防护措施。

use-of-shigella-flexneri-to-study-autophagy-cytoskeleton-interactions

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