基于釉原蛋白-壳聚糖水凝胶的开发 体外 具有致密界面的牙釉质再生

本实验的总体目标是建立一种利用AMLO和壳聚糖水凝胶进行表层牙釉质重建的制备方案。该过程首先制备酸蚀处理的牙片；第二步，制备新鲜的AMLO和壳聚糖水凝胶。

接下来，将AMLO和kitan水凝胶涂覆于牙片表面。最后，在人工唾液中利用AMLO chizen水凝胶再生牙釉质。最终，可通过超声处理和纳米压痕技术评估新形成层的机械强度及其与天然釉质的结合能力。

该技术的应用前景在于开发一种可用于成人和儿童患牙牙釉质的治疗方法，能够阻止早期龋损的发展，重建因龋损而流失的牙釉质，保存牙齿结构，并防止蛀牙进一步进展。本次操作演示由我实验室的博士后研究员 Dr. Chittar 一进行。首先选取一颗无修复且无龋损的人类第三磨牙。

使用水冷式低速金刚石锯将牙冠纵向切割成两毫米厚的切片，然后通过超声方式去除磨牙的牙根部分。用离子水清洗切片两分钟，再用离子水冲洗三次，以模拟侵蚀性病损。用30%磷酸对两片切片进行酸蚀处理30秒。

然后立即用去离子水冲洗，再进行超声处理。将蚀刻后的切片再次清洗两分钟，并用去离子水冲洗。

重复三次。用于制备卡桑储备液。首先将1%（重量/体积）的卡桑溶解于1%（体积/体积）的乙酸溶液中，随后在80°C下搅拌过夜。

将溶液冷却至室温后，通过0.45微米滤膜过滤 esan，然后加入1摩尔氢氧化钠将pH值调节至5.0。配制钙和磷酸盐储备溶液时，称取氯化钙并配制成0.1摩尔的溶液。接着涡旋振荡溶液直至澄清，并用1摩尔氢氧化钠将pH值调节至11。

然后称取二碱磷酸钠，配制0.1摩尔的溶液，并涡旋至溶液澄清。为制备AMLO基因改性水凝胶，将960微升新配制的1%esan溶液加入含有200微克重组猪源AMLO基因的离心管中。

然后涡旋振荡溶液至澄清。接着，向含有奥扎尼的AMLO溶液中加入25 µL的0.1 M氯化钙溶液，随后加入15 µL的0.1 M磷酸氢二钠溶液。涡旋振荡溶液5分钟。

然后小心加入1摩尔氢氧化钠，将AMLO和奥扎尼溶液的pH值调节至6.5。当pH值达到6.5时，AMLO和奥扎尼水凝胶将形成，从而在AMLO和奥扎尼水凝胶中启动牙釉质再生。首先，用1摩尔氢氧化钠将人工唾液溶液的pH值调节至7.0，并将该溶液在4摄氏度下保存。然后使用注射器将约20微升的AMLO和奇曾水凝胶涂抹于边缘牙片上，并将其置于室温下的干燥器中。

两小时后，向唾液溶液中加入 300 PPM 的氟化钠，然后将牙片转移至含有 30 毫升该溶液的烧杯中。用铝箔覆盖烧杯，随后将烧杯置于 37 摄氏度的烘箱中。最后，在 3 至 7 天后取出牙片，在经 AMLO 和 chizen 水凝胶修复 7 天后，蚀刻的牙釉质表面会形成一层厚度为 15 微米的类釉质层，将牙片置于干燥器中室温下干燥至恒重。

新生成的层由高度有序的晶体阵列构成，晶体直径约为50纳米，优先沿垂直于表面的c轴方向生长。注意，这些针状晶体被组织成束状结构，类似于天然釉质的基本结构单元。修复层的选区电子衍射图像呈现出弧形图案，表明新生成的晶体具有层级排列的取向特征。

沿 0 0 2 方向的 X 射线衍射分析证实，新生成的层由羟基磷灰石构成，这些羟基磷灰石沿晶体学 C 轴排列，这与扫描电子显微镜及选区电子衍射观察结果一致。本图显示了新生层与天然釉质之间界面的微观结构。请注意，新生晶体并未沿原始釉质晶体的方向生长，而是在蛋白质介导的羟基磷灰石生长过程中，相对于天然釉质晶体呈垂直取向。新生层与釉质基底之间的界面处无明显间隙。

在纳米尺度上，牙釉质与再生晶体融合在一起，形成了无缝的界面。经过10分钟的超声处理后，AMLO Genin 壳聚糖水凝胶中形成的新生层仍与牙釉质表面紧密连接，且经 tizen 水凝胶处理但不含 amelogen 的样品其有序结构得以保留。然而，牙釉质与修复层之间出现明显的大间隙，可清晰区分新生层与天然牙釉质。

在本实验中，新生成的层中的 AMLO genin 通过免疫荧光标记进行检测，新生成层内出现的绿色荧光证实了 AMLO genin 的存在。如图所示，经过酸蚀处理后，釉质表面的硬度和模量分别下降了近 98% 和 88%。使用不含 AMLO genin 的奥占水凝胶处理的对照组，在硬度和模量方面仅表现出有限的改善。

相比之下，在 AMLO 和 ozan 水凝胶中矿化后，其模量增加了近四倍，硬度增加了九倍。在体外及后续的模型评估中，该方案可进一步拓展用于设计治疗釉质缺陷（如早期龋损和侵蚀）的技术。