Name: 神经病理性疼痛小鼠坐骨神经掴型号 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: 学习在小鼠坐骨神经周围植入聚乙烯套环以建立神经病理性疼痛模型的方法。该模型通过von Frey纤维丝测试评估机械性痛觉过敏，可用于研究疼痛机制及评估去甲替林和加巴喷丁类药物的治疗效果。

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本工作由法国国家科学研究中心（合同号 UPR3212）、斯特拉斯堡大学以及脑与行为研究基金会（Brain & Behavior Research Foundation）的 NARSAD 青年研究者资助项目资助。 &amp;#38; 行为研究基金会（资助 I.Y）。出版费用由Neurex网络（上莱茵河地区Interreg IV计划）资助。

实验方案已获批准 &#34;斯特拉斯堡动物实验伦理委员会&#34; （CREMEAS）
1. 爪退缩阈值的基线测量
<ol>
	<li>在开始实验操作前，让小鼠在动物饲养设施中适应至少10天至2周。</li>
	<li>使小鼠适应von Frey测试装置以及第4节中描述的von Frey操作流程。</li>
	<li>手术前，按照第4.3节所述方法，使用von Frey纤维丝评估小鼠的机械性足爪缩足阈值。注意：需在不同日期重复该操作，直至获得至少三个连续稳定的缩足阈值。</li>
	<li>将小鼠分配至不同的实验组，确保各组在初始阶段的足爪缩足阈值之间无显著差异。</li>
</ol>
2. 套管植入手术操作步骤
<ol>
	<li>称量动物体重。注意：小鼠体重应超过 20 g，方可进行下述套管插入操作。</li>
	<li>通过腹腔注射给予混合麻醉剂（氯胺酮 17 mg/ml 和赛拉嗪 2.5 mg/ml 溶于 0.9% NaCl）4 ml/kg，可提供约 45 分钟&#160;的麻醉效果。</li>
	<li>用镊子轻夹后肢足垫，检查足底反射是否消失，并检查角膜反射是否消失，以确认动物已完全麻醉。</li>
	<li>使用电动剃毛器将右侧后肢从膝关节至髋关节区域的毛发剃除。</li>
	<li>用棉签蘸取眼部保护用液体凝胶涂抹于眼睛表面。</li>
	<li>将动物置于左侧卧位，右后肢置于一小枕头上，并用胶带将其固定于枕头上。</li>
	<li>使用纱布或棉签蘸取氯己定和&#160;70% 乙醇对术区进行消毒。</li>
	<li>以食指定位股骨，沿股骨方向平行切开皮肤，切口长约 0.5 cm，位于股骨前方约 1.5 mm 处。</li>
	<li>使用两根已灭菌的细棒分离靠近股骨的肌肉组织。注意：切勿切割肌肉。通常肌肉层可轻松分离，无出血现象，此时坐骨神经即可显露。若出现出血，可用无菌棉签吸除血液。</li>
	<li>将两根已灭菌的细棒插入坐骨神经下方，以暴露其主干，并用无菌生理盐水（0.9% NaCl）润湿神经。</li>
	<li>借助一根尖头钢棒和一把动脉夹，夹持预先准备好的无菌分段 PE-20 聚乙烯套管（套管长度 2 mm，内径 0.38 mm，外径 1.09 mm）。
	<ol>
		<li>将尖头钢棒插入套管内，使其略微张开。</li>
		<li>利用套管的侧向开口，将动脉夹从套管一端沿平行方向插入，并旋转动脉夹 180°，使其夹住与侧向开口相对的一侧。夹闭动脉夹后，取出尖头钢棒。注意：旋转操作旨在使套管处于最佳插入位置，同时动脉夹有助于维持套管部分张开状态。动脉夹的型号与尺寸对本步骤至关重要。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>由第二位实验人员持两根细棒置于神经下方，轻轻分开细棒，以充分暴露约 4 mm 长的一段坐骨神经。</li>
	<li>将 2 mm 套管套入坐骨神经主干，起始端从动脉夹远端开始，先将套管靠近髋部近端的一侧套入神经相应位置。</li>
	<li>使用镊子轻轻挤压套管远端两侧，使其闭合，注意避免挤压或改变套管形状。旋转套管以确认其已正确闭合。</li>
	<li>使用外科打结法缝合剃毛区域的皮肤切口。</li>
	<li>将小鼠置于左侧卧位，放入清洁的饲养笼中。在热灯下保温直至小鼠苏醒。</li>
	<li>额外提供饮水，并将部分饲料直接放置于饲养笼内。</li>
</ol>
3. 假手术对照组的手术操作
<ol>
	<li>采用与上述步骤 2.1 至 2.9 相同的手术操作，然后继续执行步骤 2.15 至 2.17。对于假手术对照组，省略仅涉及套管插入的步骤 2.10 至 2.14。</li>
</ol>
4. von Frey 测试
<ol>
	<li>将小鼠分别放入带有孔洞的透明独立盒子（7 cm × 9 cm × 7 cm）中，盒子置于一块升高的光滑不锈钢穿孔板上（1 m × 50 cm，圆孔直径5 mm，孔边缘间距2.5 mm）。注意：此装置可同时测试最多12只小鼠。手术动物可在术后次日进行测试，但建议恢复3天，以减少假手术对照组中观察到的术后痛觉过敏。</li>
	<li>测试前让动物适应环境15分钟。</li>
	<li>按照递增力度的顺序，将von Frey纤维丝施加于每只后足的足底表面。说明：von Frey纤维丝为具有校准直径的塑料细丝，长度为5 cm，固定在手持式施加器上。纤维丝施加的速度、弯曲程度以及持续时间均可能影响本测试所获得的阈值3。在目前的小鼠实验中，最常用的纤维丝力度为0.16、0.4、0.6、1、1.4、2、4、6、8和10 g。
	<ol>
		<li>将选定的纤维丝施加于左后足足底，直至纤维丝刚好弯曲。重复此操作连续3至5次，然后对右后足进行相同操作。完成双侧后足测试后，再测试下一只动物。说明：应避免接触足部外侧边缘，因其可能更为敏感。预期反应包括足部回缩、突然抽动或舔足行为。若在5次测试中至少出现3次预期反应，则视为阳性反应。每只足始终至少测试3次；若前3次测试中仅观察到1次或2次反应，则需进行第4次和第5次测试。在C57BL/6J小鼠中，术前测试应从1.4 g纤维丝开始；术后测试则应从0.4 g纤维丝开始。若使用首个测试纤维丝即观察到阳性反应，则在步骤4.3.2中应改用力度更低（而非更高）的纤维丝进行测试。</li>
		<li>根据步骤4.3.1的方法，使用同一纤维丝依次测试其余动物。待所有动物完成该纤维丝测试后，从第一只动物开始，使用下一更大力度的纤维丝重复测试。持续该过程，直至所有小鼠均出现阳性反应。说明：每只动物需测试至连续两种力度的纤维丝均产生阳性反应为止。将其中产生阳性反应的较低力度纤维丝所对应的克数（g）视为该动物的足底回缩阈值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

该 &#34;袖带&#34; 该模型最初在大鼠中建立，通过在坐骨神经周围植入多个套管，以获得标准化且可重复的慢性压迫损伤6然后对其进行改造，以植入单个套管7,8，尽管一些研究团队仍在使用多次套管插入的方法19-22随后将其应用于小鼠9,23，这使得使用转基因动物成为可能。套管通常长2 mm，但在大鼠中也使用过其他长度。22聚乙烯管的选择取决于物种：小鼠使用PE-209，以及 PE-6024,25 或 PE-907,8,26,27 在大鼠中。
机械性异常性疼痛通过 von Frey 纤维丝进行测量。在此测试中，足爪回缩阈值的绝对值可能取决于动物所站立的表面28或纤维丝弯曲的持续时间3，但这些因素并不影响神经病理性异常性疼痛的检测。
“&#34;套管&#34;”模型对于神经病理性疼痛机制的研究具有重要意义。该模型曾被用于研究有髓和无髓纤维的形态学变化6,29，以及感觉神经元、初级传入神经元和脊髓神经元的功能改变19,21,22,30-35。该模型还证实了胶质细胞的激活以及神经元阴离子梯度的中枢性改变，参与了脊髓伤害性感受神经元活动及其反应的改变，并参与了神经病理性异痛的发生24,36-38。此外，该模型也被用于研究谷氨酸受体7,39-41、阿片受体16,42-45以及烟碱型受体46的作用。
该模型的另一个优势在于其对神经性疼痛现有治疗方法的响应性， 即，加巴喷丁类药物和抗抑郁药。与临床观察相似：加巴喷丁类药物在高剂量时既表现出急性、短暂的镇痛作用，又在连续给药数天后呈现延迟出现且持续的缓解作用；三环类抗抑郁药和选择性5-羟色胺及去甲肾上腺素再摄取抑制剂在相关剂量下无急性镇痛效应，但需经过1至2周治疗后才显现延迟性持续缓解作用；而选择性5-羟色胺再摄取抑制剂氟西汀则无效。16因此，该模型适用于研究这些治疗方法背后的分子机制16-18,44,45,47，这可能揭示出可在患者中进行验证的新治疗靶点48-51.
最后，该模型还允许研究神经病理性疼痛的焦虑抑郁后果。临床上，这些后果影响约三分之一的神经病理性疼痛患者，但在临床前研究中，相较于疼痛的感觉方面，对此研究较少。在此模型中，存在时间依赖性的类焦虑和类抑郁表型的发展52，因此可针对其相关机制进行研究。
该神经病理性疼痛小鼠模型采用标准化袖带和操作程序，可使机械性异常性疼痛的个体间差异较小。该模型可使用基因修饰动物17,18,44-47,52，具有持久的异常性疼痛、对临床常用治疗方案有反应，以及焦虑抑郁样症状随时间进展等特点，因此适用于研究神经病理性疼痛及其治疗的多个方面和后果，已为该研究领域提供了有价值的信息。

神经病理性疼痛通常为慢性疼痛，由影响躯体感觉系统的损伤或疾病引起。受损的感觉神经元以及中枢神经系统内整个伤害性感觉通路发生的适应不良性改变，均参与了这一复杂综合征的发生发展。目前已在啮齿类动物中建立了多种用于研究神经病理性疼痛及其治疗的模型1-3。
根据已知的病因，神经病理性疼痛模型旨在模拟糖尿病中观察到的多发性神经病变、周围神经损伤、中枢损伤、三叉神经痛、化疗后继发的神经病变、带状疱疹后神经痛等。&#160;啮齿类动物周围神经损伤的多种模型主要针对坐骨神经，这些模型依赖于对该神经的压迫和/或切断。事实上，坐骨神经手术操作相对简便，并可支持基于足底回缩反射的行为学检测。慢性神经压迫模型包括例如：慢性压迫性损伤（CCI）4,5，坐骨神经套管6-9，坐骨神经部分结扎（PSL）10，脊神经结扎（SNL）11或腓总神经结扎12. 被称为的模型 &#34;脊神经损伤保留模型&#34; 坐骨神经分支选择性损伤（SNI）也被广泛应用。该方法包括对坐骨神经三个终末分支中的两个进行紧密结扎和横断，而第三个分支保持完整。13-15以坐骨神经为靶点的多种神经病理性疼痛模型，均会导致损伤侧后足出现慢性机械性异常性疼痛（即对通常不会引起伤害性感受的刺激产生伤害性反应）。
本文详细描述了小鼠神经病理性疼痛的&#34;套管模型&#34;的手术操作步骤。该模型通过在坐骨神经主干周围植入聚乙烯套管来建立6-9。文中还介绍了使用冯·弗雷细丝（von Frey filaments）的方法，这些细丝可用于评估该模型中持续存在的机械性异常性疼痛这一痛觉症状。

<table><tbody><tr><td>PE-20 聚乙烯导管</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2-59-8323</td><td>术前剪开</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Centravet</td><td>IMA004</td><td></td></tr><tr><td>盐酸赛拉嗪</td><td>Sigma</td><td>X1251</td><td>术前新鲜配制</td></tr><tr><td>Ocry-gel</td><td>Centravet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>FST</td><td>11003-12</td><td>52.5 mm 直头</td></tr><tr><td>微型动脉夹</td><td>FST</td><td>p130 18038-45</td><td></td></tr><tr><td>带孔板</td><td>CTTM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>von Frey 纤维丝</td><td>Bioseb</td><td>NC-12775</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠神经病理性疼痛的坐骨神经套管模型

The Sciatic Nerve Cuffing Model of Neuropathic Pain in Mice

神经病理性疼痛是由损害或影响躯体感觉系统的病变或疾病所引发的。该综合征源于受损的感觉神经元以及中枢神经系统内整个伤害性感觉通路发生的适应不良性改变。它通常呈慢性病程，且治疗困难。为了研究神经病理性疼痛及其治疗方法，研究人员已在啮齿类动物中建立了多种动物模型。这些模型基于已知的病因，从而可模拟外周神经损伤、中枢损伤以及与代谢、感染或化疗相关的神经病变。小鼠的外周神经损伤模型常以坐骨神经为靶点，因其易于暴露，并可在后肢足掌进行伤害性感觉测试。这些模型通常依赖于神经压迫和/或切断。本文详细描述了小鼠神经病理性疼痛的&#34;套管模型&#34;的手术操作流程。在该模型中，将一段标准化长度（2 mm）的PE-20聚乙烯套管单侧植入坐骨神经主干周围。该操作可诱导持久的机械性异常性疼痛，i.e.，即对原本非伤害性刺激产生伤害性感受反应，可通过von Frey纤维丝进行评估。本文除详细介绍手术及检测方法外，还讨论了该模型在研究神经病理性疼痛机制、疼痛的感觉与焦虑抑郁相关表现，以及神经病理性疼痛治疗方面的应用价值。

数据以均值 ± 标准误表示。根据实验设计，采用多因素方差分析（ANOVA）或非配对t检验进行统计分析。在这些分析中，假手术组与结扎手术组，以及生理盐水处理与药物处理均被视为组间因素。适当时，对时间过程数据采用重复测量分析。事后比较采用邓肯检验（Duncan test）。统计学显著性定义为 p&lt;0.05。
当采用上述描述的实验步骤时，套管植入会导致同侧痛觉过敏，如图所示。 图1小鼠一旦适应测试程序，其在von Frey试验中的足底撤回阈值将随时间保持稳定，且不受手术操作的影响。 本身，如假手术动物所示。但应注意，假手术小鼠通常会出现短暂的术后异常性疼痛。当存在此类异常性疼痛时，爪退缩反应在术后数天内即恢复至基线水平。在Cuff小鼠中，同侧异常性疼痛在术后最初几天即已出现，并可持续超过2个月（参见 9，以及 图1；F8,344=29.5，p&lt;0.001）。在C57BL/6J小鼠中，通过上述von Frey试验测量时，套管诱导的异常性疼痛保持在同侧；但在其他条件下，也可观察到对侧足爪出现异常性疼痛。8C57BL/6J小鼠的基础值通常在4至6克之间，但测试方案可能影响这些数值。
三环类抗抑郁药是神经病理性疼痛的临床一线治疗药物之一。在此模型中，三环类抗抑郁药去甲替林（5 mg/kg，腹腔注射，每日两次）经过约2周的治疗后可缓解神经病理性异痛，如图2所示（F7,91=15.3，p&lt;0.001；事后检验：(CuffNor=Sham)&gt;CuffSal，第29至34天，p&lt;0.001）。在此剂量下，未观察到抗抑郁药的急性镇痛作用16,17。为了模拟患者长期服药所获得的持续性疼痛缓解效果，可在每日早晨给药前而非给药后对小鼠进行测试。该操作方式可用于评估既往多日治疗所引发的持久效应。在此情况下，需持续治疗1至2周方可观察到神经病理性异痛的持久缓解。当治疗中断后，通常在3至4天内出现症状复发18。除部分抗抑郁药外，加巴喷丁类药物也是神经病理性疼痛的首选治疗方案。加巴喷丁在此模型中具有急性且短暂的镇痛作用16，但若每日在给药前对动物进行测试，则还可表现出延迟出现但持久的抗异痛作用（图3；p&lt;0.001）。该作用起效速度较抗抑郁药物更快。
<img alt="术后时间压力变化图，比较套管组与假手术组、同侧与对侧足爪。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51608/51608fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51608/51608fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 小鼠神经病理性疼痛套管模型中的机械性足爪缩足阈值。 成年雄性 C57BL/6J 小鼠适应 von Frey 实验操作，直至获得稳定的基线值（基线值在图中以时间点 0 表示）。双侧足爪均进行测试。套管组小鼠表现出同侧机械性异常性疼痛，表现为缩足阈值降低（每组 n=10）。
<img alt="压力-时间曲线图；术后治疗效果；生理盐水与去甲替林比较分析；图2。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51608/51608fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51608/51608fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 三环类抗抑郁药的延迟性抗异常性疼痛作用。 术后两周，小鼠每天两次（上午和下午）接受腹腔注射0.9% NaCl或5 mg/kg盐酸去甲替林（每组n=5或6）。在上午给药前进行von Frey试验。通过该方案可观察到去甲替林的延迟性抗异常性疼痛作用，该作用需持续给药约12天方可显现。
<img alt="假手术组和结扎组治疗前后压力比较的柱状图。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51608/51608fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51608/51608fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 加巴喷丁类药物的抗异常性疼痛作用。 术后三周，小鼠每天两次（上午和下午）接受腹腔注射0.9% NaCl或10 mg/kg加巴喷丁（每组n=5）。在上午给药前进行von Frey试验。通过该方案可观察到加巴喷丁具有延迟但持久的抗异常性疼痛作用。数据展示的是治疗开始前以及治疗第6天的结果。

神经病理性疼痛是由影响躯体感觉系统的损伤或疾病引起的后果。小鼠神经病理性疼痛的“套管模型”是将聚乙烯套管植入坐骨神经主支周围。使用冯·弗雷丝（von Frey）纤维丝检测机械性异常性疼痛。

神经病理性疼痛是由于损害或影响躯体感觉系统的病变所致。该综合征源于躯体感觉系统发生的适应不良性改变……

本实验的总体目标是建立一种继发于外周神经压迫的神经病理性疼痛小鼠模型。在完成动物的术前准备后，暴露坐骨神经主干，并将聚乙烯套管环绕该神经放置，随后关闭切口。为了检测足部的敏感性，将小鼠放入透明盒子中，盒子下方为带孔的金属板。随后将一系列逐渐增大的冯·弗雷丝（Von Frey filaments）施加于足部，直至动物对压力产生持续反应。最终，通过绘制冯·弗雷试验随时间测得的机械阈值，可观察到在手术侧足部出现持久性、同侧的机械性异常性疼痛。该模型有助于回答疼痛研究领域的一些关键问题，例如神经病理性疼痛的潜在机制。它还可用于研究现有治疗方法，以测试新的治疗药物，或研究神经病理性疼痛所导致的焦虑和抑郁后果。然而，该方法的视觉演示至关重要，因为套管的植入步骤若无视觉辅助则难以准确描述。为评估机械性足底缩足阈值，首先将小鼠分别置于透明的独立盒中，盒子下方为带孔的钢板，每次测试最多可同时检测12只动物。使用von Frey纤维丝，这些具有校准直径的塑料细丝连接在手持式施加器上。弯曲时，每根细丝施加的压力与其直径成正比。在小鼠实验中，最常用的细丝范围为0.16至10克。应从最轻的压力开始。在测量小鼠阈值时，将细丝施加于左后爪，直至细丝开始弯曲。避免接触爪子的侧缘，因其可能更为敏感。动物会对细丝的刺激产生反应。如果足爪出现退缩或抽动反应，则重复刺激两次，若动物对全部三次刺激均有反应，则测试另一侧足爪；否则，在测试另一侧足爪前需总共施加五次刺激。使用选定的冯·弗雷细丝依次对每只小鼠进行测试，随后对下一根细丝重复该过程。如果动物对同一根纤维丝产生三次反应，则视为阳性结果。当连续两种纤维丝均得到阳性评分时，停止对该只足爪的测试。对于给定小鼠，足爪回缩阈值取这两个克值中较低者。两侧前爪的数值可能不同。每天重复此操作，直至获得至少三个连续且稳定的阈值。然后进行手术。记录动物体重，应超过20克，并使用氯胺酮和赛拉嗪对动物进行麻醉。检查动物是否无足垫或角膜反射。用棉签将保护性凝胶涂抹于眼睛表面。然后从膝盖到臀部剃除右后肢的毛发。接着将动物侧卧，右后肢向上放置在小枕头上，并用胶带固定该腿。用氯己定和70%乙醇对暴露的皮肤进行消毒。首先通过触诊找到股骨。然后在股骨后方约1.5毫米处，沿与股骨平行的方向做一个0.5厘米长的切口。接着使用灭菌棒分离靠近股骨的肌肉组织，但不要切断肌肉。应暴露坐骨神经的主干。如果出现出血，务必使用棉签将血液吸干，以用于假手术对照组。至此，完成对小鼠进行套管手术的操作。在坐骨神经下方插入两根细棒，以暴露神经的主干。滴加一滴生理盐水以保持神经湿润。现在用一根尖头钢棒和一个动脉夹夹住一个分叉套管。然后插入血管夹，并将其旋转180度，使其夹住套管与侧向开口相对的一侧。现在关闭血管夹，并移除尖头棒。接下来，让助手将两根棒置于神经下方并轻轻分开。为了便于接触神经，将两毫米的套管插入坐骨神经的主分支周围。首先将套管位于血管夹远端的部分套入神经靠近髋部近端的区域。然后用镊子轻轻闭合套管，确保套管正确闭合。将其翻转。现在，取出棒材并缝合皮肤使其闭合。使用手术结扎法，将小鼠转移至其干净的饲养笼中，并将小鼠置于左侧。使用加热灯保持其温暖，直至小鼠苏醒。在笼内添加额外的食物和水，以便小鼠自行摄取营养。术后次日可对动物进行缩足阈值降低的检测，但最好等待三天，以减少该操作引起的术后高敏感性。与假手术对照组相比，结扎小鼠表现出同侧痛觉过敏，持续时间超过两个月。给予小鼠每日两次、每次每千克体重五毫克的去甲替林（一种三环类抗抑郁药），经过约两周的治疗后可缓解神经病理性痛觉过敏。如果中断治疗，小鼠通常会在三到四天内复发。该模型对另一种治疗神经病理性疼痛的药物加巴喷丁类药物也敏感。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在麻醉小鼠中找到坐骨神经的主干，并在其周围放置套管。在这种神经病理性疼痛模型中，单丝测试可进一步用于评估机械阈值并研究药物反应。

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神经病理性疼痛小鼠坐骨神经掴型号

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