从蜘蛛中提取毒液及显微解剖毒腺用于蛋白质组学和转录组学分析

本实验的总体目标是提取蜘蛛毒液并分离其毒腺，用于转录组学和蛋白质组学研究。首先需准备通过电刺激采集毒液所需的仪器和试剂。第二步是在解剖显微镜下用镊子固定已麻醉的蜘蛛。随后对蜘蛛施加脉冲电流，并用微毛细管收集释放出的毒液。

最后一步是在两到三天后解剖蜘蛛的毒腺。最终利用质谱法或其他蛋白质组学分析方法分析毒液，以确定其组成毒液蛋白的序列。该方法的可视化演示至关重要，因为毒液采集步骤难以掌握，涉及一系列需要快速而谨慎完成的协调操作。

首先，将电刺激器的电源线插入电源插座，并将外部脚踏开关连接至外部信号输入端口。接着，确保极性开关处于正常模式，将正极电极连接到电刺激器的红色输出端子，将负极电极连接到黑色输出端子。然后将刺激器设置为以下推荐的初始参数。

通过将鳄鱼夹连接到正极和负极电压表测试引线上，测试电极输出。然后打开刺激器电源开关，并使用脚踏板输送电流。准备轻质镊子时，先将其中一个镊臂涂上液态塑料，等待四小时使塑料涂层完全干燥；塑料干燥后，用单层棉质缝纫线紧密缠绕另一个镊臂尖端15毫米，并将线末端打结固定。

接下来，使用锋利的剪刀剪去钝头皮下注射针的针尖，针孔需足够小以免伤害蜘蛛，但又足够大以避免堵塞。用砂纸将开口处打磨光滑，并将针头连接到真空废液收集装置。然后，在解剖显微镜视野下，利用固定在磁性底座上的带乙烯基涂层的双叉夹具，将超轻镊子水平放置并保持紧密闭合状态，其中塑料涂层的叉臂朝上，涂有丝线的叉臂朝下。

接着，将正极鳄鱼夹连接到线段上游的底部镊子尖端，将负极鳄鱼夹连接到钝头金属真空针上。然后将正极导线置于线段与鳄鱼夹之间的镊子尖端上，负极导线置于钝头真空针上。为测试电压表电路电流，踩下脚踏板以确认检测到足够的电流，并在佩戴护目镜的情况下取下导线。

准备若干根微毛细管用于毒液采集。接着，在培养皿中放置一条固定用橡皮泥条，并将微毛细管置于其上。戴手套的手握住一根微毛细管的一端，用无菌金属镊子夹住另一端，在本生灯火焰上方加热，同时将该端从火焰中缓慢拉出，使管端拉长形成细长尖端，而另一端保持固定不动；随后在解剖显微镜下检查微毛细管末端，并用无菌金属镊子在拉细的一端制造一个微小的斜面开口。

关闭管盖并将管子置于冰上。开始蜘蛛固定时，打开 CO2 室的气体，然后用长金属镊子将蜘蛛从密闭的塑料收集瓶中转移到 CO2 室内。

将蜘蛛置于室内 5 到 10 分钟，并通过用长柄镊子轻轻拨动来检查蜘蛛是否已不再活动。然后使用含有生理盐水的移液管将镊子上的丝线润湿。

接下来，通过抓住蜘蛛的前肢，将其从 CO₂ 气室中取出。使用钝头解剖镊子并戴上手套，将麻醉后的蜘蛛移至轻型镊子装置上。然后分开闭合的轻型镊子的叉状部分，将蜘蛛的头胸部置于镊子叉之间。

让镊子的钳口闭合，以确保蜘蛛被牢固固定但未被压碎。迅速将蜘蛛腹面朝上放置，使其背甲朝下， resting 在涂有丝线的镊子钳口上，腹面朝向塑料涂层，同时正极仍连接在底部的钳口上。接下来，调节解剖显微镜的放大倍数、焦距和光源，直至蜘蛛的头胸部及毒牙清晰可见。开始采集毒液时，打开真空泵，并用水喷洒蜘蛛的毒腺区域。

使用第二个钝头注射器针头，通过真空针吸除水分以去除杂质。接着，将真空针的负极接触蜘蛛的吻部，并用脚踏板施加一个脉冲。蜘蛛的腿部会收缩，毒液将以透明液滴的形式从螯牙中渗出。

必要时抽走反流物。随后用微毛细管尖端收集毒液液滴，并将毛细管尖端转移至含有水的0.5毫升离心管中，使水自动吸入毛细管内。操作时应避免毛细管刺穿蜘蛛，以及避免蛛丝和纺器胶质污染毛细管。

接下来，将带有管适配器的转移注射器连接到微毛细管的另一端（与收集尖端相对的一端），将毒液溶液重新排入离心管中，并将离心管置于冰上，随后将含有毒液的离心管保存于负80摄氏度条件下。完成毒液采集后，将一个打开的塑料收集瓶及其瓶盖放置在蜘蛛附近，以便快速转移。用一只手握住钝头解剖镊子，小心夹住蜘蛛的腿部，同时用另一只手小心打开轻质镊子。

然后用钝头镊子将蜘蛛移入收集管中。在采集毒液后两到三天内，迅速盖紧管盖，将蜘蛛置于CO2麻醉室中进行麻醉，随后装满液氮容器并将其放置在解剖显微镜旁。用RNA Away清洁解剖区域和镊子。

然后，用一个×的氯化钠柠檬酸钠溶液填充一个小的培养皿，并将其置于解剖显微镜下。接着，将蜘蛛从CO2室转移到培养皿中，用镊子迅速分离头胸部与腹部。然后用镊子夹住头胸部，在解剖显微镜下将其固定，并将窖器置于视野范围内。

使用第二把镊子的尖端从侧面切断头胸部与毒腺体侧部相连的角质层。用第二把镊子夹住毒腺体，轻轻来回拉动，直至将毒腺完全拉出。整个操作不得超过15分钟。

将腺体从矿井中分离，并转移至一个耐冻存的0.5毫升离心管中。将封闭的离心管置于液氮中，结合质谱技术与由毒腺cDNA文库生成的序列数据库，从而实现对毒液蛋白的鉴定。拉罗无头肽（Laro inept peptide）是利用质谱技术从黑寡妇蜘蛛毒液中鉴定出的36种蛋白质之一。

请务必注意，操作黑寡妇等蜘蛛时可能极为危险，进行该实验步骤时应始终采取预防措施，例如佩戴防护手套。