质子转移和蛋白质构象动力学的光敏蛋白的时间分辨步进扫描傅立叶变换红外光谱

该程序的总体目标是使用时间分辨 STEP 扫描 FTIR 光谱眼影镜探测两种光敏膜蛋白的质子化动力学和确认变化。这是通过首先形成水合蛋白质膜来实现的，其红外吸收将在细菌视蛋白的减弱全反射配置或通道 Rodin 2 的透射配置中探测。第二步是用合适波长的纳秒激光闪光激发样品，以在蛋白质检测时间内分辨与样品相互作用的红外光强度的变化引发光环反应。

接下来，在干涉仪的移动镜的隐蔽位置重复上述过程，干涉仪控制两个分离光束之间的光程差，直到记录完整的时间分辨干涉图。最后一步是使用傅里叶变换和兰伯啤酒定律将时间分辨干涉图转换为时间分辨红外差分吸收光谱。最终，检查禁令的时间演变，特别是在 MI 一和 CO 双键羧酸区域中，以获得蛋白质中确认和质子化变化的动力学。

大多数现有实验方法的技术的主要优点是它解决了蛋白质中的瞬态质子化变化。此外，它在微秒和毫秒时间尺度上执行此作，这是与探测蛋白质功能最相关的时间范围。这种方法可以帮助回答分子生物物理学和蛋白质科学领域的关键问题，例如在蛋白质的功能机制或蛋白质发生重大变化期间，质子化哪些残基以及它们何时会质子化。

演示该程序将由我实验室的助理研究员完成 首先安装，将衰减的全反射或 TR 附件放入 FTIR 光谱仪的样品室中。测量 4 个倒厘米的宽范围能量谱。通过常规快速扫描 FTIR 光谱法对干净的内部反射元件表面进行分辨率分析，用 20 微升高离子强度缓冲液覆盖 A TR 表面，稍后用于对样品进行再水化。

然后测量缓冲液的 IR 吸收。接下来，去除缓冲液并用水冲洗表面，不要触摸它。通过强烈的气流去除残留液体，将每毫升 6 毫克细菌 Rodin 的蛋白质溶液涂抹在表面顶部的紫色膜中。

在柔和的干燥气流中干燥蛋白质悬浮液，直到形成薄膜。然后测量干膜的吸收光谱。然后，轻轻加入 20 至 40 微升高离子强度缓冲液，使干膜再水化。

用盖子盖住 A TR 支架以防止水分蒸发措施和吸收光谱。通过减去缓冲液的吸收光谱，估计薄膜再水化后残留在表面附近的样品百分比。此时，加入 10 微升通道视蛋白 2，溶解在 dec 侧的低离子强度缓冲液中，位于 20 毫米直径氟化钡窗口的中心。

在微量移液器吸头的帮助下，使用干燥空气温暖均匀薄膜的温和流动将溶液涂抹至 6 到 8 毫米的直径，该薄膜的直径与最大孔径处的红外光束尺寸大致匹配。接下来，使用 1 毫米厚的扁平硅胶 O 形圈。通过在干膜周围添加 3 到 5 微升甘油和水的混合物，以 3 到 5 滴的形式分布，使薄膜水合，然后用第二个窗口将其紧紧关闭。

将氟化钡夹层窗口插入支架中。然后将支架放入样品室中。测量吸收光谱。

确认 A TR 设置中酰胺 1 区域的最大吸收在 0.6 至 1.0 的范围内。使用放置在 A TR 盖顶部的光纤将激光器耦合到样品上。将样品上激光的能量密度调整为每平方厘米/脉冲 2 到 3 毫焦耳。

使用功率计或透射实验，使用镜子将激光带到样品上，如果需要，使用透镜将激光束整理或转移到略高于样品薄膜尺寸的直径。使用 Q 开关将激光脉冲与数据记录同步。同步输出掺钕中庭铝石榴石激光器电子元件的 TTL 脉冲，以触发光谱仪模数转换器。

设置激光器的激发速率以执行时间分辨。在 1800 至 850 反厘米光谱范围内进行步进扫描测量。在光路中放置一个低通滤光片，该滤光片在 1， 950 倒厘米以上不透明，在 1800 倒厘米以下具有良好透射率。

然后将探测器从 AC 耦合模式更改为 DC 耦合模式。此时，通过对探测器施加电流偏置，将 INTERFEROGRAM 的直流电平降至零。重新调整电子增益以更好地利用模数转换器的动态范围。

在此之后，启动 FTIR 光谱仪的步骤扫描菜单。将步进扫描测量的目标光谱带宽设置为氦氖激光波数的八分之一。将光谱和相位分辨率分别设置为 8 个倒厘米和 64 个倒厘米。

选择 appe 函数。然后将 INTERFEROGRAM 采集模式设置为单侧向前。将模数转换器的采样率设置为光谱仪中可用的最高采样率。

将 Trigger for experiment 设置为 external。然后设置要记录的线性间隔数据点的数量，包括 100 个 pret 触发点。接下来，设置每个镜子位置的 co editions 数或光反应的平均值数，然后开始实验。

最后，对细菌、红蛋白重复实验 10 次，对通道红蛋白二的三个不同样品膜重复实验 35 次，每个镜子位置特征有大约 200 个钴添加 在细菌红蛋白干泡沫吸收光谱中可以区分肽键 amite 振动的禁令。当使用低离子强度缓冲液时，膜过度膨胀，从而减少了消逝场探测的蛋白质量。膜溶胀和缓冲液离子强度之间的确切依赖性将取决于脂质的性质等因素。

水合后的薄膜膨胀需要时间才能稳定 dosin 细菌。在紫色膜中，该过程是单指数的，时间常数为 12 分钟。来自典型时间分辨步进扫描、细菌 FDIR 实验的 3D 图。

此处显示了 Redsin。光谱可以在特定时间提取。例如，当细菌 redsin 光周期中的中间状态有望达到其最高种群时。

在细菌杆 Dossin 光循环时间中，吸光度的痕迹在 1， 762 倒厘米处发生变化。关于天冬氨酸 85 的质子化去质子化动力学和在 1， 741 倒厘米处的氢键变化和天冬氨酸的去质子化再现动力学的报告.96。时间轨迹为 1， 670 和 1， 555 倒厘米。

报告 MI 1 和 2 振动的变化，它们都对肽骨架确认敏感。按照这种方法，可以进行其他技术，例如定点神经发生或视网膜酶光谱，以便在蛋白质发育后将振动带分配给蛋白质中的特定残基。这项技术为分子生物物理学领域的研究人员探索大量不同光驱动蛋白质的功能机制铺平了道路。