利用时间分辨步进扫描傅里叶变换红外光谱研究光敏蛋白中的质子转移与蛋白质构象动力学

本实验的总体目标是利用时间分辨的步进扫描傅里叶变换红外光谱（STEP scan FTIR spectroscopy）研究两种光敏膜蛋白的质子化动力学及构象变化。首先制备水合蛋白薄膜，其红外吸收可在衰减全反射模式下检测细菌视紫红质，或在透射模式下检测通道视紫红质2。第二步是用适当波长的纳秒激光脉冲激发样品，以启动蛋白中的光循环反应，并检测与样品相互作用的红外光强度随时间变化的情况。

接下来，在干涉仪的移动镜面不同位置重复上述过程，通过调节两束分光之间的光程差，直至记录得到完整的随时间分辨的干涉图。最后一步是利用傅里叶变换和朗伯-比尔定律，将随时间分辨的干涉图转换为随时间分辨的红外差谱吸收光谱。最终，通过分析谱带的时间演化，特别是MI区和羧基中CO双键区域的谱带变化，获得蛋白质构象变化和质子化动力学信息。

该技术相较于大多数现有实验方法的主要优势在于，能够解析蛋白质中瞬态的质子化变化。此外，该方法可在微秒至毫秒的时间尺度上实现这一检测，而这正是研究蛋白质功能相关过程最为关键的时间范围。该方法有助于回答分子生物物理学与蛋白质科学领域中的一些关键问题，例如在蛋白质功能机制过程中，哪些氨基酸残基发生了质子化，以及质子化发生的时间，或蛋白质中重大结构变化出现的时机。

本实验操作将由我实验室的研究助理 Victor Ria 演示。首先，将衰减全反射（attenuated total reflectance，ATR）附件安装到傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）的样品室中。使用常规快速扫描 FTIR 光谱法，在 4 cm⁻¹ 的分辨率下对洁净的内反射元件表面测量宽波段能量光谱。随后，用 20 µL 后续用于样品再水合的高离子强度缓冲液覆盖 ATR 表面。

然后测定缓冲液的红外吸收。接着，移除缓冲液，并用水冲洗表面，注意不要触碰表面。用强气流除去残留液体，随后在表面上均匀铺展约三微升浓度为六毫克每毫升的细菌紫膜蛋白Rodin溶液。

在温和的干燥空气流下将蛋白质悬浮液干燥，直至形成薄膜。然后测定干燥薄膜的吸收光谱。随后，轻轻加入20至40微升高离子强度缓冲液，以重新水合干燥的薄膜。

用盖子盖住 A TR 持样器，以防止水分蒸发并测量吸收光谱。通过减去缓冲液的吸收光谱，估算薄膜再水化后表面残留样品的百分比。此时，在直径为 20 毫米的氟化钡窗片中心，加入 10 微升溶解于低离子强度缓冲液中的通道视紫红质 2（channel opsin two），该溶液以癸基麦芽糖苷（dec alside）作为溶剂。

使用微量移液器吸头，借助温和的干燥暖空气气流，将溶液铺展成直径约六至八毫米的均匀薄膜，其直径应大致与最大光圈处红外光束的尺寸相匹配。接着，使用厚度为一毫米的扁平硅胶O形圈。通过在干燥的薄膜周围滴加三至五滴甘油与水的混合液（总体积为三至五微升），使薄膜充分水合，并用第二块窗口片紧密封合。

将夹有氟化钡的窗口插入样品架中，然后将样品架放入样品室，测定吸收光谱。

确认ATR装置在酰胺一区的最大吸收值处于0.6至1.0范围内。将光纤放置在ATR盖顶部，以将激光耦合到样品中。调节样品处激光的能量密度，使其达到每脉冲每平方厘米2至3毫焦耳。

使用功率计或透射实验，利用反射镜将激光引导至样品，并根据需要使用透镜使激光束准直或偏转，光斑直径略大于样品薄膜尺寸。通过Q开关使激光脉冲与数据记录同步，利用掺钕钇铝石榴石激光器电子装置的同步输出TTL脉冲触发光谱仪的模数转换器。

将激光器的激发频率设置为执行时间分辨步进扫描测量，光谱范围为1800至850 cm⁻¹。在光路中放置一个低通光学滤光片，该滤光片在1950 cm⁻¹以上不透光，而在1800 cm⁻¹以下具有良好的透射性能。

然后将检测器从交流耦合模式切换至直流耦合模式。此时，通过向检测器施加电流偏置，将干涉图的直流电平调至零。重新调整电子增益，以更充分地利用模数转换器的动态范围。

随后，启动傅里叶变换红外光谱仪的步进扫描菜单。将步进扫描测量的目标光谱带宽设置为氦氖激光波数的八分之一。将光谱分辨率和相位分辨率分别设置为 8 cm⁻¹ 和 64 cm⁻¹。

选择一个 appe 函数。然后将干涉图采集模式设置为单向前进。将模数转换器的采样率设置为光谱仪中可用的最高值。

将实验的触发模式设置为外部触发。然后设置要记录的线性等间距数据点数量，其中包括 100 个触发前数据点。接下来，设置每个反射镜位置下光反应的累加次数或平均次数，并启动实验。

最后，对细菌、红藻素进行10次重复实验，并在三种不同的样品膜上对通道红藻素二进行35次重复实验，以使每个镜面位置获得约200次共添加。来自肽键酰胺振动的特征吸收带在细菌红藻素干膜吸收光谱中可被区分。当使用低离子强度缓冲液时，薄膜过度膨胀，导致被倏逝场探测到的蛋白量减少。薄膜溶胀程度与缓冲液离子强度之间的具体依赖关系将取决于多种因素，其中包括脂质的性质。

水合后薄膜溶胀需要一定时间才能达到细菌视紫红质的稳定状态。在紫色膜中，该过程呈单指数形式，时间常数为12分钟。该图为一次典型的随时间分辨步进扫描傅里叶变换红外（FDIR）实验所得的三维图谱。

此处显示了细菌红视紫质。可以在特定时间提取光谱，例如当预计细菌红视紫质光循环中的中间态达到最高数量时。

在细菌视紫红质 Dossin 的光循环中，1,762 cm⁻¹ 处的吸收变化时间轨迹反映了天冬氨酸 85 的质子化与去质子化动力学，而 1,741 cm⁻¹ 处则报告了氢键变化以及天冬氨酸 96 的去质子化与再质子化动力学。1,670 cm⁻¹ 和 1,555 cm⁻¹ 处的时间轨迹。

报告MI一和MI二振动模式的变化，这两种振动均对肽键骨架构象敏感。采用该方法后，还可进一步开展位点定向神经发生或视网膜酶光谱分析等技术，以在该方法建立后将振动谱带指认至蛋白质中的特定残基。该技术为分子生物物理学领域的研究人员探索多种不同光驱动蛋白的功能机制奠定了基础。