用于表征鱼藤酮诱导的帕金森病模型中自发性及惊吓诱导运动行为的方法 果蝇

本实验的总体目标是确定在鱼藤酮诱导的果蝇帕金森病模型中，惊吓诱发的以及长期自发性运动行为的变化。该目标通过在添加鱼藤酮的食物上培育果蝇以诱导表型来实现。第二步，将果蝇进行惊吓反应检测，并使用双瓶装置进行长期自发运动行为检测。在果蝇活动监测仪中获得的结果显示，根据对惊吓反应和长期自发运动的定量分析，鱼藤酮暴露会导致果蝇出现运动功能缺陷。

这些方法有助于回答果蝇研究领域中神经退行性疾病和运动障碍模型的关键问题，例如惊吓诱发运动和长期自发运动中的缺陷。首先，在标准的果蝇小瓶中加入1.5克即用型果蝇培养基，并加入5毫升去离子水配制培养基，其中含有适当剂量的鱼藤酮。

随后，使用二氧化碳麻醉8至12只日龄为1至3天的雄性果蝇，并将其转移至含有药物的试剂瓶中。将食物添加药物后，使果蝇在水平放置的试剂瓶中恢复麻醉状态20分钟。然后将试剂瓶直立放置于25摄氏度、12小时光照/12小时黑暗循环的培养箱中，继续完成后续实验。

接下来，将一个标准的果蝇小瓶倒置在另一个小瓶上，并用胶带密封接缝处，以制成双瓶装置。然后使用永久性记号笔在小瓶周围画出标记线，将双瓶装置均分为三段，每段长度为6.33厘米。在药物暴露三天后，将果蝇转移至双瓶装置中。

更换接缝处的胶带，让果蝇在新环境中适应15分钟。然后将小瓶置于白色背景上，并设置好数码相机。确保整个装置都能完整地呈现在单张照片画面中，双瓶装置和计时器均可见，且所有果蝇都处于清晰对焦状态。

标记相机和小瓶的位置，以确保各次试验之间的画面一致，并在相机视野中清晰显示试验编号和药物处理信息。随后，将双小瓶装置在台面上轻轻敲击三次，确保所有果蝇均落至小瓶底部，然后立即启动计时器。每5秒对装置拍摄一张照片，持续1分钟。

然后让果蝇不受干扰地恢复一分钟。每次试验之间间隔一分钟的恢复时间，再重复该实验两次。查看图像并记录随时间推移各区域内的果蝇数量，以进行计算：用15毫升去离子水和适当浓度的鱼藤酮，重新配制三克速溶OPH培养基。

五分钟后，小心地将试管垂直放入透明小瓶中，并通过旋转试管将固体食物装填至高度约一厘米。接着，轻轻将塑料瓶盖推入试管末端，避免产生气泡。用二氧化碳麻醉一天大的雄性果蝇，并用画笔小心地将每只果蝇逐一放入各试管中。

然后用一小团棉花塞住管子的末端。将管子水平放置，让果蝇从二氧化碳中恢复15分钟，并确保所有果蝇均存活且活跃。将管子插入果蝇活动监测仪（DAM）中，并检查所有管子相对于DAM的位置是否一致。

将DAM置于25摄氏度、12小时光照/12小时黑暗的培养箱中。接着，将DAM连接至数据采集系统。然后在首选项中打开DAM软件。

选择10分钟的时间段长度并开始数据采集，让程序连续采集七天的数据。接着，打开DAM文件扫描程序，通过点击“选择输入数据”来访问监测数据。然后选择合适的监测范围，并将时间段长度设置为10分钟间隔。

接下来，在输出文件类型中选择通道文件，并将所有其他选项保留为默认设置。然后点击扫描数据，并将文件保存到指定文件夹。最后，将数据导入昼夜节律数据分析软件，以获得每分钟计数。

经过三天不同剂量的 roone 暴露后，野生型 Canton s 果蝇在暴露于较高剂量时表现出惊吓反应缺陷。30 秒后，装置上部区域的果蝇百分比较低，而下部区域的果蝇百分比较高，提示存在惊吓反应缺陷；在自发运动行为实验中也观察到类似趋势。每分钟活动次数通过果蝇活动监测仪（Drosophila Activity Monitor，DAM）进行测定。

暴露后第四天，暴露于250微摩尔和500微摩尔鱼藤酮的果蝇每分钟计数显著减少。这些检测方法可方便地用于表征其他食管疾病模型中的运动缺陷以及治疗药物的疗效。