Name: 荧光目标阵列的T细胞反应评价中的应用在体内 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: 学习荧光靶标阵列技术，用于体内T细胞反应评估与免疫学研究。该方法可同时检测超过250个参数，通过流式细胞术精确分析CTL细胞毒性T细胞及辅助性T细胞应答。

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本工作获得了澳大利亚国家健康与医学研究委员会的项目资助（项目编号 #1010395，BQ 和 CP；项目编号 #525431，CR），以及项目资助（项目编号 #455395，CP）；澳大利亚肝炎与艾滋病病毒研究中心 2012 年 EOI 拨款（CR 和 RJJ）；以及戈登与格雷特尔·布特斯基金会的资助（BQ 和 CR）。我们谨向 Harpreet Vohra 和 Michael Devoy 致以诚挚感谢，感谢他们对 JCSMR FACS 实验室的出色维护；感谢澳大利亚癌症研究基金会生物分子资源设施（JCSMR，澳大利亚国立大学）提供的多肽合成服务；并感谢澳大利亚吉朗市联邦科学与工业研究组织动物健康实验室的 David Boyle 博士提供原始 HIV 疫苗毒株。

注意：本方案所使用的小鼠均按照澳大利亚国立大学动物实验伦理委员会的指南进行操作，小鼠通过颈椎脱位法实施安乐死。
1. 染料与多肽的制备
<ol>
	<li>染料制备 
	注意：染料预先稀释成不同浓度，以便在不同的荧光强度下标记细胞。CFSE 使用七种浓度，通过 3.5 倍连续稀释获得；CTV 和 CPD 使用六种浓度，通过 3.7 倍连续稀释获得（见表 2-4）。表 2-4 中列出的染料储备浓度将用于将靶细胞标记至表 2-4 中所列的最终染料浓度。染料在接触水溶液后会发生反应，因此在打开染料瓶前，必须先将染料瓶平衡至室温，以尽量减少染料暴露于冷凝水汽中。
	<ol>
		<li>CFSE 
		注意：CFSE 通常以羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFDA, SE；分子量 557.47）形式购买，通常为 25 mg/瓶。
		<ol>
			<li>将 25 mg CFSE 溶解于 4.48 ml DMSO 中，得到 10 mM 的储备溶液。</li>
			<li>对 CFSE 进行连续稀释：将 35 μl 的 10 mM CFSE 储备液加入 87.5 μl DMSO 中，重复此步骤使用稀释后的储备液，以获得表 3中所列的每种染料浓度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>CTV 
		注意：CTV 通常以每包 9 瓶的形式购买，每瓶可用 10 μl DMSO 重悬，生成 10 mM 的染料溶液。
		<ol>
			<li>将全部 9 瓶 CTV 用 90 μl DMSO 重悬并混合，得到 10 mM 的溶液。</li>
			<li>对 CTV 进行连续稀释：将 11 μl 的 10 mM CTV 储备液加入 29.7 μl DMSO 中，重复此步骤使用稀释后的储备液，以获得表 2中所列的每种染料浓度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>CPD 
		注意：CPD（分子量 792.6）通常以 0.5 mg/瓶的形式购买。
		<ol>
			<li>将 0.5 mg CPD 溶解于 63 μl DMSO 中，得到 10 mM 的溶液。</li>
			<li>对 CPD 进行连续稀释：将 11 μl 的 10 mM CPD 储备液加入 29.7 μl DMSO 中，重复此步骤使用稀释后的储备液，以获得表 4中所列的每种染料浓度。 
			注意：染料储备液可在 -20 °C 下保存数月，可反复冻融数次而不显著影响其功能。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>多肽制备 
	注意：MHC I 类分子结合多肽通常用于以 6 种不同浓度脉冲靶细胞，起始浓度为 1 μM，通过 10 倍稀释获得（表 5）。MHC II 类分子结合多肽通常用于以 6 种不同浓度脉冲靶细胞，起始浓度为 400 μM，通过 3 倍稀释获得（表 5）。每种多肽在 PBS 中配制成最终浓度的 2 倍储备液，确保每个多肽浓度的最小体积为 250 μl。多肽储备液可在 FTA 构建前预先配制，并在 -20 °C 下保存，功能不会显著下降。
	<ol>
		<li>制备 MHC I 类分子结合多肽储备液</li>
		<li>将每种多肽表位的最高浓度配制成 2 μM 储备液（2 倍 1 μM）</li>
		<li>对 MHC I 类分子结合多肽进行连续稀释：将 44.4 μl 的 2 μM 多肽储备液加入 400 μl PBS 中。重复此步骤使用稀释后的储备液，以获得表 5中所列的每种多肽浓度。</li>
		<li>制备 MHC II 类分子结合多肽储备液</li>
		<li>将每种多肽表位的最高浓度配制成 800 μM 储备液（2 倍 400 μM）。</li>
		<li>对 MHC II 类分子结合多肽进行连续稀释：将 150 μl 的 800 μM 多肽溶液加入 300 μl PBS 中。重复此步骤使用稀释后的储备液，以获得表 5中所列的每种多肽浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. FTA 制备
注：以下步骤概述了一种FTA的构建过程，该FTA包含经7种不同肽表位在6种不同浓度下致敏的细胞（即. 42个细胞簇）重复6次，共产生252个可分辨的细胞簇。每次重复中均包含一个未用任何表位脉冲的细胞簇（Nil），作为对照。为便于在分析时通过抗体标记区分供体细胞与宿主动物细胞，FTA最好具有与宿主动物不同的CD45同种异型。若无此条件，也可使用其他染料（如PKH-26）对FTA进行标记以实现区分（见步骤2.6）。通常情况下，FTA制备过程从开始到结束需一次性连续完成。
<ol>
	<li>标记42个10 ml锥底塑料管，编号1-42（如 表1 例如）。</li>
	<li>细胞的制备
	<ol>
		<li>从小鼠中分离脾脏和/或淋巴结。通过将组织研磨过筛，制备单细胞悬液 70 μm 用5 ml注射器活塞压过筛网，然后使用血细胞计数板计数细胞。</li>
		<li>将淋巴细胞重悬至最多 200 x 106 细胞/ml，加入含5%胎牛血清（FCS）的11.5 ml 罗切斯特公园纪念研究所1640培养基（RPMI，或等效产品）。注意：应使用富含胺基的缓冲液，以尽量减少染料对细胞的毒性3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CTV 标记 
	注意：细胞最初用 6 种不同浓度的 CTV 进行标记。
	<ol>
		<li>通过反复倒置离心管数次，充分重悬细胞。取1.9 ml细胞悬液加入6个已标记为37-42的10 ml离心管中，注意避免润湿管子的上半部分。</li>
		<li>使用CTV标记细胞时，取下管盖并将管子水平放置。</li>
		<li>添加 83 μl 向试管顶部未润湿的区域加入 PBS，并向其中添加 17 μl 见储备液 CTV 表2 （需注明每种储备液对应哪个试管）。注意：使用未沾湿的试管至关重要，可防止细胞悬液移动以及细胞溶液与染料溶液过早混合。</li>
		<li>盖上管盖，通过涡旋快速且充分地混匀细胞悬液与染料。</li>
		<li>重复步骤 2.3.2–2.3.4，对在指定试管中所述的 CTV 储备溶液进行操作 表2.</li>
		<li>在室温下孵育细胞至少 5 分钟（RT）20 °C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CFSE 标记
	<ol>
		<li>CTV标记后，向每支试管中加入5 ml含5% FCS的RPMI，并通过涡旋充分重悬细胞。
		<ol>
			<li>从第37管中将1 ml细胞悬液转移至第31、25、19、13、7和1管。</li>
			<li>从38号管中将1 ml细胞悬液转移至32、26、20、14、8和2号管。</li>
			<li>从第39管中将1 ml细胞悬液转移至第33、27、21、15、9和3管。</li>
			<li>从第40管中将1 ml细胞悬液转移至第34、28、22、16、10和4管。</li>
			<li>从第41管中将1 ml细胞悬液转移至第35、29、23、17、11和5管。</li>
			<li>从第42号管中将1 ml细胞悬液转移至第36、30、24、18、12和6号管 
			注意：在执行步骤 2.4.1.1–2.4.1.6 时，避免润湿管子的上半部分。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用CFSE标记细胞时，取下管盖并将离心管水平放置。</li>
		<li>向试管顶部未润湿的部分加入 103 ml PBS，然后向其中加入 7 ml 储存液 CFSE（参见 表3 （用于记录哪种储备液分配至哪个试管）</li>
		<li>盖上管盖，通过涡旋快速且充分地混匀细胞悬液与染料。</li>
		<li>对步骤 2.4.2-2.4.4 中所述指定试管内的 CFSE 储存液进行操作 表3.</li>
		<li>在室温下孵育细胞至少 5 min20 °C).</li>
		<li>洗涤细胞：将细胞悬液用 9 ml 的 20 °C 含5% FCS的RPMI，300 × g离心10分钟，沉淀细胞 20 °C 用移液管吸除上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>多肽孵育与细胞洗涤 
	注意：细胞用CTV和CFSE标记后，需用MHC I类和/或MHC II类结合肽段（按1.2步骤制备）进行刺激。其中一种细胞群体必须不加肽段刺激。例如无 表1）并用作计算T细胞反应的阴性对照。
	<ol>
		<li>多肽脉冲
		<ol>
			<li>将细胞重悬于总体积为 250 μl 含5% FCS的RPMI。注意：通常 50 μl 在步骤2.4.7结束时，吸取上清液后仍有细胞悬液残留，因此添加 200 μl 中等量培养基至细胞沉淀。</li>
			<li>添加 250 μl 预配置的肽段储备液（如 表5）至适当标记的试管中（如 表1并务必设置一个仅加入PBS而不加肽段的对照管，作为阴性对照（Nil control）。</li>
			<li>将细胞悬液用涡旋振荡器混匀。注意：每种肽表位及每种肽浓度必须分配至单独的管中，并根据该管中细胞预期的荧光信号清晰记录，因为该细胞簇的荧光特征将用于定义该肽（如 表1 例如）。</li>
			<li>在37°C、5% CO₂的培养箱中孵育细胞 37 °C 1 小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>细胞洗涤
		<ol>
			<li>加入5 ml冰浴冷却的（4 °C) 含5% FCS的RPMI加入细胞悬液中，通过轻柔颠倒试管重悬细胞。将3 ml预冷的（4°C）4 °C) FCS。</li>
			<li>300 × g 离心 10 分钟，沉淀细胞 4 °C使用缓慢的加速度和制动，以确保FCS与细胞悬液之间的界面保持稳定。</li>
			<li>小心地用移液管吸去 RPMI，然后吸去 FCS，注意不要扰动已洗涤的细胞沉淀。注意：使用 FCS 下层液洗涤细胞有助于尽可能去除细胞中的肽溶液，从而在细胞合并时限制细胞群体暴露于多种游离肽的环境中。</li>
			<li>再次洗涤细胞：将细胞沉淀重悬于 10 ml 的 4 °C 含5% FCS的RPMI。300 × g离心10分钟，沉淀细胞 4 °C倒掉上清液。</li>
			<li>将所有细胞群体用移液管加入6 ml培养基后汇集至同一管中 4 °C RPMI 加 5% FCS。300 × g 离心 10 分钟，沉淀收集的细胞 4 °C用移液管吸除上清液。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CPD 细胞标记 
	注意：此时可通过用6种不同浓度的CPD标记肽段致敏的细胞，生成六个组内重复样本。
	<ol>
		<li>加入11.4 ml的 20 °C 用移液器将含5% FCS的RPMI加入合并的细胞沉淀中，充分重悬。</li>
		<li>向标记为 A-F 的 6 个 10 ml 离心管中各加入 1.9 ml 细胞悬液，注意避免润湿管子的上半部分。</li>
		<li>用 CPD 标记细胞时，取下管盖并将管子水平放置。</li>
		<li>添加 92 μl 向试管顶部未润湿的区域加入 PBS，并向其中添加 CPD 储液（参见 表 4 （针对分配给每支试管的储备液量）。</li>
		<li>盖上管盖，通过涡旋快速且充分地混合细胞悬液与染料。</li>
		<li>对步骤 2.6.3-2.6.5 中所述指定试管内的 CPD 储备溶液进行操作 表4注意：与CFSE和CTV不同，CPD的标记浓度与标记细胞的荧光强度之间不存在精确的线性关系，因此为获得多个标记群体之间荧光峰等间距的标记浓度是通过经验确定的（见 表 4).</li>
		<li>在室温下孵育细胞至少 5 分钟（RT）20 °C).</li>
		<li>洗涤细胞两次：用10 ml重悬细胞 20 °C 含5% FCS的RPMI培养基。300 × g离心10分钟，沉淀细胞。 20 °C用移液管吸除上清液，重复一次。</li>
		<li>将所有细胞汇集至一个离心管中，总体积为 8 ml 4 °C RPMI 加 5% FCS，用移液管混匀。300 × g 离心 10 分钟，沉淀收集的细胞 4 °C 用移液管吸除上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>（可选）PKH-26 细胞标记 
	注意：如果无法使用表达与宿主小鼠CD45同种异型差异的细胞构建FTAs，则可用PKH-26进行标记，以区分供体细胞与受体细胞。
	<ol>
		<li>加入2.9 ml的 20 °C 用移液管向合并的细胞沉淀中加入 PBS 并充分重悬。</li>
		<li>将细胞悬液加入一支未润湿的10 ml离心管中，注意避免润湿管子的上半部分。</li>
		<li>取下管盖，将试管水平放置。</li>
		<li>添加 58 μl 将稀释液C（PKH-26染料试剂盒中）加入试管顶部未润湿的区域，并向其中添加 42 μl 1 mM 储存液 PKH-26</li>
		<li>盖上管盖，通过涡旋振荡充分混匀细胞溶液与染料。</li>
		<li>在室温下孵育细胞，至少 10 min（RT）20 °C).</li>
		<li>洗涤细胞两次：用10 ml缓冲液重悬细胞 20 °C 含5% FCS的RPMI。300 × g离心10分钟，沉淀细胞 20 °C用移液管吸除上清液，重复一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向宿主动物注射FTAs 
	注意：用于检测T细胞反应 体内，将FTAs注射到具有活跃免疫反应的动物体内并保留 原位 最长可达24小时。必须将FTAs注射到未经处理的动物体内作为阴性对照，这一点至关重要。
	<ol>
		<li>计数并将细胞重悬于 2.5 x 108 每毫升 PBS 中的细胞数。注射 200 μl 将细胞通过静脉注射到宿主小鼠体内，包括一只未处理的动物作为对照。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 流式细胞术
<ol>
	<li>在 FTA 注射后 18-24 小时，采集宿主小鼠的血液或脾脏（或其他感兴趣的组织）。</li>
	<li>通过研磨组织制备单细胞悬液 70 μm 用5 ml注射器活塞压过带孔的筛子。</li>
	<li>将细胞重悬至最多 65 x 106 细胞/ml，溶于含0.1% BSA的PBS中。</li>
	<li>分配 100 μl 将细胞悬液等分试样加入微孔板的孔中，用于抗体标记。</li>
	<li>使用与CFSE、CTV和CPD光谱兼容的荧光染料标记抗体及荧光活力探针标记细胞。注：若采用FTA检测T细胞时，检测B细胞活化需使用针对B细胞标记物（如B220）和活化标记物（如CD69）的抗体。H 细胞反应2如果FTAs与宿主小鼠存在CD45同种异型差异，则加入抗CD45.1和/或CD45.2抗体。</li>
	<li>添加 100 μl 2× 抗体/活率染料储备溶液（溶于含0.1% BSA的PBS中） 100 μl 细胞等分试样，充分混匀，冰上孵育（4 °C30 分钟</li>
	<li>洗涤细胞：将细胞在 300 x g 条件下离心 5 分钟，进行沉淀。 4 °C 并移除上清液。将细胞重悬于 200 μl 含0.1% BSA的PBS中，300 × g离心5分钟，沉淀细胞 4 °C 并移除上清液。</li>
	<li>将细胞重悬于总体积为 400 μl  含0.1% BSA的PBS，用滤器过滤细胞 70 μm 使用能够检测相关荧光染料和偶联物的流式细胞仪进行流式细胞术分析。最多收集 3 x 106 为了分辨每个FTA细胞簇并获得足够数量的细胞用于统计分析，需采集足够多的淋巴细胞事件。注意：确保使用流式细胞术所需的所有典型对照（如单染对照）。通常，CFSE需使用蓝色激光源（通常为488 nm）激发，并通过中心波长约520 nm的带通滤光片检测；CTV需使用紫色激光源（通常为405 nm）激发，并通过中心波长约450 nm的带通滤光片检测；CPD需使用红色激光源（通常为633 nm或640 nm）激发，并通过中心波长约670 nm的带通滤光片检测。</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>使用标准流式细胞术分析软件分析流式细胞术数据（参见代表性结果，了解所采用的设门策略示例）。</li>
	<li>对于特异性杀伤百分比（% specific killing），计算每组经MHC I类分子结合肽段脉冲处理的FTA细胞簇中的细胞数量，以及未经肽段脉冲处理（“Nil”）的FTA细胞簇中的细胞数量，并使用以下公式计算特异性杀伤百分比。 
	特异性杀伤百分比（% Specific Killing）<img alt="靶标分析公式、比值计算公式、数学过程、研究背景" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51627/formula.jpg" width="200" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式"> 
	注：上述公式中，“primed”指来自被认为对目标肽段产生免疫应答动物的靶细胞，“naïve”指来自未经免疫动物的靶细胞，“peptide”指经肽段脉冲处理的靶细胞，“nil”指未经任何肽段脉冲处理的靶细胞。</li>
	<li>以B细胞活化作为TH细胞活性的衡量指标时，计算来自“primed”动物中经MHC II类分子结合肽段脉冲处理的FTA B细胞上CD69抗体荧光信号的几何平均荧光强度（GMFI），再减去来自“naïve”动物相应FTA B细胞上CD69表达的GMFI，所得差值即为TH细胞活性的度量。</li>
	<li>根据步骤4.2和4.3生成的统计结果，使用GraphPad Prism等数学电子表格软件计算其他定量与定性参数，例如曲线下面积（AUC）和半最大效应浓度（EC50）（有关AUC计算方法的详细说明，请访问： 
	http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?stat_area_under_the_curve.htm；有关EC50的说明，请访问：http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index.htm?reg_the_ec50.htm）。</li>
</ol>

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

基于FTA的检测方法的优势在于能够区分 &#62;通过流式细胞术从单个宿主动物中分离出250个有活力且功能完整的靶细胞群体。这为研究带来了相当程度的复杂性 体内 基于流式细胞术的检测方法，实现了以往无法完成的实验。上述两项动物实验突显了该方法的优势：在单个动物体内，可同时对6个重复样本中7种不同病毒表位在6个浓度下的反应进行监测，从而获得AUC、EC等参数50 待确定T细胞应答 体内.
除了检测T细胞反应外 体内，基于FTA的检测方法可被改进以测量反应 体外1这基本上涉及将FTAs加入培养的T细胞中，以在数小时内测量其反应。 体外一个可能的局限性在于 体外基于FTA的检测方法存在一个倾向，即FTA内被标记的细胞会将标记染料转移至周围细胞1,3这可能导致FTA细胞簇的分辨率降低，因为各群体之间的荧光差异变得不那么明显。这一现象在 体外 与相比的检测方法...

T细胞在适应性免疫应答中发挥核心作用，常被作为免疫治疗中进行干预的靶点。CD4+效应T细胞通过分泌细胞因子来响应外来抗原，这些细胞因子可调控免疫反应的多个方面，并可直接辅助B细胞产生抗体。CD8+细胞毒性T细胞（CTLs）也能通过分泌细胞因子来响应外来抗原，并在直接杀伤表达外来抗原的细胞过程中发挥核心作用。启动这些T细胞效应功能的基本相互作用，是T细胞受体（TCR）与细胞表面MHC分子上呈递的外来肽段之间的结合。CD4+T细胞识别抗原呈递细胞表面MHC II类分子所呈递的肽段，而CD8+T细胞则识别通常表达于微生物感染细胞表面的MHC I类分子所呈递的肽段。
为了评估T细胞在免疫应答中所起的作用，必须采用可靠且灵敏的技术来检测其效应功能。常用的T细胞应答检测方法包括：MHC I类/II类/肽四聚体反应性检测、酶联免疫斑点法（ELISPOT）和胞内细胞因子染色法检测细胞因子产生，以及通过细胞杀伤实验检测其杀伤能力 51Cr释放实验。然而，这些实验通常进行 离体 与 体外 刺激，或对T细胞功能提供有限的见解。理想情况下，在测量T细胞反应时，最好能够评估它们 原位, 体内 因为它们的发生不涉及对T细胞的操作，从而避免因操作导致的功能参数改变 体外 刺激。一些最常用的 体内 T细胞功能检测基于测量细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对经MHC I类分子结合肽段致敏的靶细胞的杀伤作用，靶细胞数量被逐一计数 体内 通过使用CFSE等活体染料进行荧光标记来检测。尽管此类检测方法能够在靶细胞被细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤时实时监测这一过程 体内，他们此前评估杀伤能力的手段较为有限，难以同时检测针对不同浓度及不同类型肽表位的多个靶标的杀伤效应，而这种能力对于评估功能性亲和力和表位变异体交叉反应性等定性参数至关重要。这些检测方法也无法提供有关CD4+ T细胞介导的免疫应答
为了克服当前评估T细胞反应方法中的诸多局限性，我们近期开发了一种基于荧光靶标阵列（FTAs）的多重检测方法，该方法可实现对T细胞反应的监测 &#62;通过流式细胞术在单个动物中同时检测250个靶细胞 1,2. FTAs 由淋巴细胞组成，这些淋巴细胞使用多种浓度和组合的活体染料（如 CFSE、CTV 和 CPD）进行标记，从而允许 &#62;生成250个具有独特荧光的细胞簇。由于这些细胞保持活性且功能完整，可将其注射入动物体内，以监测其与效应T细胞的相互作用。 体内3例如，可将FTA细胞簇与MHC I类分子结合肽共孵育，以评估抗原特异性CTL对靶细胞的杀伤作用1此外，FTA 细胞簇还可与 MHC II 类分子结合肽进行脉冲处理，从而可评估抗原特异性辅助性 T 细胞（T helper cell）H通过评估携带同源肽的滤泡样结构（FTA）中B细胞的活化情况（通过检测活化标志物如CD69、CD44和/或CD62L）来检测其活性2. 由于可同时检测超过250个靶标，因此能够同时测定CTL和TH 针对多个靶细胞簇在不同浓度下脉冲多种肽段并包含大量重复实验的反应。因此，FTA检测提供了前所未有的T细胞效应反应评估水平 体内.
本文详细描述了荧光靶阵列（FTA）的构建方法，并展示了如何将其应用于体内评估T细胞应答。in vivo。该方案描述了通过三种活细胞染料的使用，构建包含252个可区分细胞簇的FTA，其结构由6个重复组成，每个重复包含42个经MHC I类和II类结合肽脉冲致敏的细胞簇。42个细胞簇的标记在10 ml锥底试管中进行，按照表1所示方式将试管放置于试管架中操作较为方便。根据需要，可通过减少每种染料的标记量，对本方法进行调整以适应较少数量的可区分细胞簇1。
我们通过展示该检测方法如何在小鼠小群体中测量重组痘苗病毒疫苗针对多个表位所产生的免疫应答，突显了该检测的实用性。这表明，FTA 检测可通过曲线下面积（AUC）评估和生成半数最大应答所需的有效肽浓度（EC50）的测定，分别用于测量累积应答和功能亲和力。

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Serana</td><td>FCS-500</td><td></td></tr><tr><td>CTV</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>CFDA, SE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>CPD</td><td>eBioscience</td><td>65-0840-90</td><td></td></tr><tr><td>抗-B220 PerCp-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>110730</td><td></td></tr><tr><td>抗-CD69 brilliant violet 605</td><td>Biolegend</td><td>104529</td><td></td></tr><tr><td>PKH-26</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL-1KT</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Scientific Industries Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪（Fortessa 或具有蓝色、红色和紫色激光源的同等设备）</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

体内t细胞应答评估用荧光靶标阵列的应用 in vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

监测T细胞反应的能力 体内 对于深入理解免疫应答机制以及设计免疫疗法具有重要意义。本文描述了荧光靶标阵列（FTA）技术的应用，该技术利用活细胞染料，如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）、紫光激光可激发染料（CellTrace Violet: CTV）和红光激光可激发染料（Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD），对小鼠淋巴细胞进行组合标记 &#62;250 个可分辨的荧光细胞簇。这些 FTA 内的细胞簇可用主要组织相容性复合体（MHC）I 类和 MHC II 类结合肽进行脉冲处理，从而作为 CD8 的靶细胞+ 和 CD4+ T细胞。这些FTA细胞保持存活且功能完整，因此可被注射到小鼠体内，以评估CD8+ T细胞介导的FTA靶细胞杀伤及CD4+ T细胞对FTA B细胞靶细胞的实时辅助作用 体内 通过流式细胞术。由于 &#62;可同时检测250个靶细胞，该技术能够监测T细胞对多个抗原表位在不同浓度下的应答，并可进行多次重复实验。因此，该技术可从定量（例如&#160;反应的累积强度）和定性（例如.&#160;功能亲和力和应答的表位交叉反应性水平。在此，我们描述了这些FTA的构建方法，并举例说明其在评估重组痘病毒疫苗诱导的T细胞应答中的应用。

作为FTA检测应用的一个示例，一只BALB/c小鼠用表达HIV-I表位（VV-HIV）的重组痘苗病毒（VV）进行免疫，并通过252参数的FTA检测评估其对HIV-I CTL表位Gag、Gag mut、Env和Pol，VV CTL表位F2L和F2L mut，以及HIV-I TH细胞表位Gag Th（如文献2所述）的免疫应答（图1B）。Gag（Gag mut）和F2L（F2L mut）的表位变异体不在VV-HIV载体中表达，因此针对这些表位的应答反映了表位变异体交叉反应性T细胞应答。同时，将未经免疫的 naïve 小鼠注射FTA作为阴性对照。通过PKH-26标记将FTA与宿主小鼠细胞区分开，并通过B220抗体染色在流式细胞术中区分FTA中的B细胞（图1A和图1B）。每个动物体内6个重复样本根据CPD荧光进行设门（图1C），而表达不同浓度表位的FTA靶细胞则根据CFSE和CTV荧光进行设门（图1D）。通过比较免疫动物中FTA聚集体的...

详细监测T细胞反应的能力 体内 对于深入理解免疫应答机制具有重要意义。本文描述了荧光靶标阵列（FTAs）在一种 体内 评估T细胞功能的检测方法 &#62;通过流式细胞术同时检测250个参数。

体内T细胞应答评估用荧光靶标阵列的应用 In vivo

在体内监测T细胞反应的能力对于深入理解免疫应答机制以及疫苗和免疫疗法的设计具有重要意义。

本实验的总体目标是利用多参数流式细胞术，在免疫检测中生成多达252种具有不同标记的荧光靶细胞阵列。该目标首先通过使用CFSE和CTV等活细胞染料，以不同的组合和强度对靶淋巴细胞进行标记来实现。下一步是将每种不同的靶淋巴细胞群体分别与候选的MHC I类和MHC II类结合肽表位进行脉冲处理。随后对细胞进行充分洗涤，以维持表位的特异性，然后将细胞汇集并注入动物体内。最后的步骤是从特定组织中收获荧光标记阵列细胞，对其进行标记，并检测MHC肽特异性反应。最终，流式细胞术结果可通过测量靶细胞死亡来显示CTL反应，也可通过测量B细胞靶标激活标志物的上调来显示CD4阳性辅助T细胞反应。该技术相较于传统体内CTL检测方法的一个主要优势在于，可在单个动物体内同时测量超过250种靶细胞。演示该实验操作的是本实验室的研究员Ben Quire。该操作需要从小鼠分离的脾脏和/或淋巴结中获取淋巴细胞，经滤过后重悬于11.5毫升含5%胎牛血清的RPMI培养基中，细胞浓度最高可达每毫升2亿个细胞。FDA的制备始于标记步骤：将42个10毫升锥底塑料管编号为1至42，所有细胞将被七种不同的肽段表位以六种不同浓度刺激，重复六次，以生成252个可区分的细胞簇。现在，通过反复倒置试管数次，充分重悬淋巴细胞。然后取 1.9 毫升细胞悬液加入已标记为 37 至 42 的 10 毫升试管中，注意不要润湿试管的上半部分。现在打开第38号管的盖子，将其水平放置在第38号管的顶部。加入83 µL的PBS。然后根据文本方案中表二所示，加入17 µL相应浓度的CTV储备液。加样后，将离心管涡旋混匀。对39至42号离心管重复此操作，确保每根离心管加入表二所列的不同CTV储备液。现在将细胞在室温下孵育至少五分钟。然后向每支试管中加入含有5%FCS的五毫升RPMI培养基。通过涡旋振荡彻底重悬每支试管中的细胞。按照文本方案中建议的加样模式，将一毫升细胞悬液转移至另外六支试管中。每次转移时，务必避免润湿已加样试管的上部区域。为用CFSE标记细胞，取含有细胞悬液的31至36号试管，打开管盖，并将这些试管水平放置在对应的各支试管旁。首先，加入 103 µL 的 PBS，将其排加至干燥的上部管壁。然后根据文本方案中的表三，加入适量的 7 µL CFSE 储存液，并立即涡旋混匀试管。按照表三中分组的试管重复此操作。确保每个试管加入不同的CFSE储备液。所有试管在室温下孵育至少五分钟。等待五分钟后，洗涤细胞以完成标记。用9毫升室温下含5%FCS的RPMI稀释每种悬浮液。在室温下以300 ×g离心10分钟，使细胞沉淀，并使用移液管通过抽吸法去除上清液。MHC I类和MHC II类结合肽的制备方法见文本方案。本节介绍如何用这些肽对细胞进行脉冲标记。首先，通过将离心管沿金属网架滚动等方式，用残留的培养基重悬细胞沉淀。然后，在含有5% FCS的PMI培养基中，将细胞悬液总体积补至250 µL。每个细胞沉淀大约需要200 µL培养基。接下来，将表五中列出的预配制肽段储备液各 250 微升加入指定的试管中。按照表一中所示的模式操作，并务必设置一个仅含 PBS 的对照管，用于计算 T 细胞反应。关键是要将每种肽段表位和每种肽段浓度分别分配至单独的试管中，并根据该试管中细胞预期的荧光信号清晰记录分配情况。由于该簇的荧光特征将定义此肽段，因此通过涡旋混合各细胞悬液，然后在37摄氏度下孵育细胞1小时。孵育结束后，继续进行细胞洗涤。首先，向每份细胞悬液中加入5毫升冰冻的含5%FCS的RPMI培养基，并通过反复倒置试管重悬细胞。然后在每份细胞悬液下方小心地加入3 mL冰上预冷的FCS沉淀液，于4°C条件下以300 ×g离心10分钟。使用慢速加速和减速，以确保每根试管中的溶液界面保持完整。小心吸除RPMI培养基，再吸除FCS，注意不要扰动已沉淀的洗涤后细胞团块。离心收集沉淀后，再次洗涤细胞，得到经过两次洗涤的细胞沉淀。将细胞重悬于10毫升含5%FCS的冰上预冷的RPMI培养基中，再次离心后弃去上清液。随后，将所有细胞群体合并至一个新的10毫升离心管中，加入6毫升含5%FCS的冰上预冷RPMI培养基，通过离心沉淀合并后的细胞，并用移液管吸除上清液，至此完成整个操作流程的该步骤。通过使用六种不同浓度的CPD标记肽脉冲细胞，可生成六个组内重复样本。首先，向汇集的细胞沉淀中加入11.4毫升室温下含5% FCS的RPMI培养基，并用移液器充分重悬细胞。其次，将1.9毫升细胞悬液分别加入六个新标记为A至F的10毫升离心管中，注意避免润湿管子的上半部分。首先，将CPD未封盖的试管B水平放置在干燥壁上。加入92微升PBS，然后根据表四加入相应体积的CPD储备液。随后涡旋混匀。对试管C和试管F重复此步骤，确保每个试管加入表四中指定的不同CPD储备液。所有离心管混匀后，在室温下孵育五分钟。然后用室温培养基将细胞洗涤两次：第一步，将细胞重悬于 10 毫升室温培养基中；第二步，离心沉淀细胞；第三步，用移液管吸除上清液。然后重复该过程。现在将 A 至 F 管中的所有细胞合并至一个含有 8 毫升冰上预冷培养基的试管中。通过离心收集细胞，随后将细胞注射至动物体内，并进行后续的流式细胞术分析。具体步骤详见文本方案。使用表达HIV V1表位的重组痘苗病毒免疫BC小鼠，并通过252参数FTA检测评估其对多种表位的免疫应答。两种表位变异体gag mute和FTL mute未在载体中表达，且将FTL mute注射至未免疫小鼠。通过PKH26标记将TA与宿主小鼠细胞区分开，FTAB细胞则通过B220抗体染色结合流式细胞术进行区分。六个动物内重复样本均根据CPD荧光进行设门，表达不同浓度表位的FTA靶细胞则根据CFSE和CTV荧光进行设门。通过比较免疫动物中 FTA 簇细胞死亡与未免疫动物中相应 FTA 簇的差异，评估每个重复样本的特异性杀伤比例。通过比较免疫动物与未免疫动物中相应 FTA B 细胞簇的 CD69 上调情况，评估辅助性 T 细胞活性。根据此分析，V-V-H-I-V 感染针对免疫优势 VV 表位 F two L 产生了最强的 CTL 应答，脾脏中 100% 被 0.001 微摩尔或更高浓度表位脉冲的 FDA 靶细胞被清除。除了CTL应答外，FTA检测还通过评估表达H-I-V-M-H-C II类结合表位HIV gag th的FTAB细胞的活化情况，来测量辅助性T细胞应答。这表明在已免疫动物中发生了抗原特异性的B细胞活化，提示产生了针对HIV gag的T细胞特异性辅助性T细胞效应物。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备包含250多个靶细胞的荧光靶标阵列。

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免疫学与感染

荧光目标阵列的T细胞反应评价中的应用<em&gt;在体内</em

蛋白质在质膜内或细胞内特定位置的区室化分布是一种重要的调控机制，可显著影响信号转导的结果；因此，要理解信号转导过程，研究相关蛋白质在空间和时间上的动态行为至关重要。本文介绍了一种基于全内反射荧光（TIRF）显微镜的系统，用于研究T细胞中的信号转导，该系统也具有广泛的适用性。...

一种用于实时同步成像T细胞受体及其相关信号蛋白的TIRF显微镜技术

本视频展示了通过基于荧光的检测方法筛选免疫调节化合物。用这些化合物处理表达绿色荧光蛋白（GFP）表达盒的转基因小鼠来源的T淋巴细胞。增强或减弱的GFP信号可分别用于识别这些化合物的刺激或抑制作用。...

一种基于荧光的检测方法：利用基因工程淋巴细胞筛选免疫调节化合物

我们描述了一种高通量单细胞检测方法，用于测量T细胞与肿瘤靶细胞共孵育时的细胞毒性。该方法采用高密度的弹性体微孔阵列（每个阵列约10万个亚纳升级微孔），将T细胞与靶细胞以特定比例在空间上进行限定，并结合荧光显微镜技术，实时监测效应细胞与靶细胞的结合以及后续的细胞凋亡过程。...

T细胞的定量高通量单细胞细胞毒性检测方法

我们介绍了在小鼠疫苗接种模型中，利用纳米颗粒免疫后，通过整体动物成像和基于流式细胞术的技术来监测抗原特异性CD8+...

纳米颗粒疫苗接种后抗原特异性CD8+ T细胞应答的全动物成像与流式细胞术分析技术

本文描述了如何开展基于（单分子）荧光共振能量转移（FRET）的检测方法，用于测量T细胞抗原受体（TCR）与负载抗原肽的主要组织相容性复合物（MHC）分子之间的结合动力学过程，该过程发生在T细胞与功能化的平面支撑脂双层接触时所形成的免疫突触内。...

测量TCR-pMHC结合 原位 使用基于FRET的显微镜检测法

调控效应CD4+ T细胞在炎症部位间质迁移的机制尚不明确。我们提出一种非侵入性方法，用于可视化观察并操控 体外-引发的CD4 T细胞在炎症耳部真皮中的动态行为研究 原位.

成像炎症真皮中CD4 T细胞的间质迁移

本研究介绍了一种基于荧光的新方法，该方法使用来自转基因小鼠的淋巴细胞。该方法适用于对具有抑制或促进淋巴细胞活化能力的小分子进行高通量筛选（HTS）。...

一种基于荧光的淋巴细胞检测方法，适用于小分子高通量筛选

本方案描述了一种对人肺肿瘤组织切片中经荧光标记抗体标记的驻留性肿瘤浸润CD8 T细胞进行成像的方法。该技术可利用共聚焦显微镜对CD8...

体外 利用共聚焦显微镜成像人肺癌组织切片中的驻留性CD8 T淋巴细胞

本方案描述了一种基于成像的T淋巴细胞激活方法，该方法利用光激活型肽-MHC实现对T细胞激活的精确时空控制。...

利用光激活型激动剂实现T细胞活化的时空控制

本方案描述了非侵入性追踪经基因工程改造以表达嵌合抗原受体的T细胞的方法学 体内...

动态成像嵌合抗原受体T细胞与[18F]四氟硼酸盐正电子发射断层扫描/计算机断层扫描

学习荧光靶标阵列技术，用于体内T细胞反应评估与免疫学研究。该方法可同时检测超过250个参数，通过流式细胞术精确分析CTL细胞毒性T细胞及辅助性T细胞应答。

体内T细胞应答评估用荧光靶标阵列的应用 In vivo

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