Name: 结合DNA-RNA荧光原位杂交（FISH）研究X染色体失活的分化雌性小鼠胚胎干细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 54 s
Description: 学习DNA-RNA荧光原位杂交技术，用于研究雌性小鼠胚胎干细胞中的X染色体失活机制。该方法可同时检测RNA和DNA，帮助研究者观察基因调控过程。

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作者感谢过去和现在伊拉斯姆斯医学中心生殖与发育系所有成员在过去几年中提供的有益且富有启发性的讨论。我们还要感谢三位匿名审稿人提供的宝贵反馈意见。Gribnau 实验室的工作得到了荷兰研究委员会（NWO-VICI）资助以及欧洲研究理事会（ERC）启动基金的支持。

1. 诱导雌性胚胎干细胞分化以启动X染色体失活
注意：雌性小鼠胚胎干细胞（可应要求提供）在经明胶包被并接种小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的标准胚胎干细胞培养条件下培养。本文假设读者已熟悉标准的细胞培养技术39-41。为诱导分化，将在T25培养瓶中培养的胚胎干细胞从MEFs中分离，并接种至分化培养基中。
<ol>
	<li>从 ES 细胞培养物中移除 ES 培养基，并用细胞培养用 PBS 洗涤两次。</li>
	<li>加入1.5 ml胰蛋白酶-EDTA（预热至37 °C），于37 °C孵育细胞7分钟。孵育至3.5分钟时，轻轻摇动培养皿以分散细胞集落。</li>
	<li>通过加入3.5 ml分化培养基中和胰蛋白酶-EDTA活性。轻轻吹打细胞以获得单细胞悬液，并收集至15 ml离心管中。在200 × g条件下离心5分钟，弃上清，将细胞重悬于10 ml分化培养基中。</li>
	<li>将细胞悬液加入未包被明胶的培养皿中，在细胞培养箱中孵育1小时。注意：MEF细胞能够贴附于未包被明胶的培养皿，而ES细胞则保持悬浮状态。</li>
	<li>同时，将灭菌的玻璃盖玻片（24 × 24 mm）放入6孔板中，加入0.2%明胶，室温下孵育至少5分钟。</li>
	<li>1 小时后，收集预包被的 ES 细胞培养物的上清液，其中主要含有未贴壁的 ES 细胞。将 ES 细胞接种至含有盖玻片的 6 孔板中。注意：使用 ⅙th 一个融合的T25培养瓶用于6孔板中的6个孔。这样可在分化3天后获得融合的分化孔。每天更换培养基。对于更长时间的分化过程，将预先铺板的ES细胞接种于含分化培养基的细菌培养皿中，并置于细胞培养箱内集成的细胞摇床上孵育。这将使细胞形成拟胚体，可在固定前1-2天将拟胚体接种至盖玻片上。</li>
</ol>
2. 用于后续 DNA-RNA FISH 分析的分化 ES 细胞固定
<ol>
	<li>从分化培养物中移除分化培养基，并用细胞培养用 PBS 洗涤两次。注意：添加 PBS 时应小心，以防止细胞被冲走。</li>
	<li>移除细胞培养用 PBS，并加入 4% 多聚甲醛（PFA）/PBS 固定细胞，在室温下孵育 10 分钟。警告：PFA 具有毒性，吸入或接触皮肤、眼睛时可能造成严重健康风险；此外，PFA 具有致癌性。</li>
	<li>移除 4% PFA/PBS，用 70% 乙醇洗涤盖玻片 3 次。注意：充分洗涤至关重要，因为任何残留的 PFA 都会干扰后续的 FISH 步骤。盖玻片可在 70% 乙醇中于 -20 °C 保存数月，待后续进行 FISH 分析。</li>
</ol>
3. FISH 实验中DNA探针的标记
注意：获取目的基因的 DNA 片段（RNA FISH 的最小长度需 &#62;2 kb，DNA FISH 则需 &#62;20 kb），或覆盖目的基因的 BAC 克隆。对于 RNA 检测，探针可比 DNA 检测更短，因为转录通常会产生多个转录本，可被同时检测到。而对于单拷贝 DNA 链上的强信号检测，则需要更长的探针，以确保掺入足够数量的半抗原从而实现有效检测。建议选择非转录的基因组区域来设计 DNA 探针。此外，在联合 DNA-RNA FISH 实验中，使用较短的探针检测 RNA 有助于避免同时检测到 RNA 的转录位点，尽管这种情况仍不能完全排除。为检测小鼠 Xist，曾使用一段 5.5 kb 的 cDNA 探针。对于 X 染色体的检测，可使用多个 BAC 探针，例如 BAC RP23-100E1 与 BAC CT7-474E4 的混合物，这两个 BAC 位于 Xist 位点附近，已获得良好的检测结果。根据具体的目标基因或染色体，可能需要尝试多种不同的探针组合以获得最佳效果。凡涉及 RNA-FISH 所用材料的操作，均应使用无菌滤芯吸头、无 RNA 酶的 H2O，并在洁净环境中进行。 
<ol>
	<li>取 1 µg DNA，用 H2O 稀释至总体积为 16 µl。加入 4 µl 地高辛或生物素标记溶液（参见试剂），涡旋混匀后于 16 °C 孵育 90 分钟。注意：此时地高辛或生物素标记的核苷酸将通过切口平移法被掺入。</li>
	<li>在此期间，准备 G50 柱以去除未掺入的核苷酸。取一个 2 ml 注射器，移除活塞，并在注射器内加入灭菌棉。将悬浮液中的 G50 球体加入注射器中直至填满，将注射器放入 15 ml 离心管中，以 642 × g 离心 1 分钟。注意：此时注射器中约有 80% 应被 G50 填满。若 G50 量不足，请重复此步骤。</li>
	<li>90 分钟后，向切口平移反应混合物中加入 40 µl H2O，然后将反应液加入 G50 柱中。在柱子下方放置一个空管，以 642 × g 离心 2 分钟。收集穿流液至一个反应管中。</li>
	<li>用移液器测量穿流液的体积，并加入 H2O 使总体积达到 200 µl。通过加入 13.3 µl 鲑鱼精 DNA（10 mg/ml）、13.3 µl 酵母 tRNA（10 mg/ml）、26.7 µl 小鼠 Cot-1 DNA（1 mg/ml）和 28 µl 2 M NaAc（pH 5.6）进行沉淀。涡旋混匀后，加入 533 µl 冰冷的 100% 乙醇。轻轻振荡试管，然后在 4 °C 下以 16,200 × g 离心 30 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用 70% 乙醇洗涤沉淀两次。在 4 °C 下以 16,200 × g 离心 5 分钟，风干沉淀。加入 50 µl 50+ 杂交溶液，在 37 °C 孵育 30 分钟以促进溶解。注意：标记探针可在 -20 °C 下保存数年。警告：50+ 杂交溶液含有甲酰胺，具有毒性，可刺激皮肤、眼睛和呼吸系统，且具有致畸性。</li>
</ol>
4. 固定细胞的通透化、预处理及用于DNA-RNA联合荧光原位杂交的杂交
<ol>
	<li>通过移除70%乙醇并向6孔板中加入细胞培养用PBS，使固定在盖玻片上的细胞重水化。孵育5分钟。共重复三次。</li>
	<li>移除细胞培养用PBS，向6孔板中加入0.2%胃蛋白酶以通透细胞。将6孔板置于37 °C水浴中孵育4分钟。移除胃蛋白酶，并用无RNase的H2O灭活。</li>
	<li>用4% PFA/PBS在室温下孵育5分钟，对细胞进行后固定。固定后，用细胞培养用PBS洗涤两次，每次5分钟。</li>
	<li>依次用70%乙醇孵育3分钟、90%乙醇孵育3分钟、100%乙醇孵育3分钟，以脱水细胞。将盖玻片从6孔板中取出，室温下晾干数分钟。</li>
	<li>将盖玻片置于65 °C加热板上孵育1小时，以老化细胞。</li>
	<li>通过将以下试剂混合，对FISH探针进行预杂交：每张待分析的盖玻片加入25 µl 50+杂交液、0.5 µl小鼠Cot-1 DNA、1 µl生物素标记的Xist探针和1 µl地高辛标记的BAC探针（用于检测X染色体）。涡旋混匀后，在99 °C变性5分钟。立即于37 °C孵育45分钟，使Cot-1 DNA与探针中存在的重复序列杂交。</li>
	<li>老化后，在载玻片上滴加50 µl变性缓冲液（含70%甲酰胺/2x SSC/10 mM磷酸盐缓冲液），将盖玻片细胞面向下置于其上。于65 °C孵育2分钟。</li>
	<li>将盖玻片放回6孔板中，用冰冻的70%乙醇在4 °C孵育5分钟，进行后固定。</li>
	<li>依次用70%乙醇孵育3分钟、90%乙醇孵育3分钟、100%乙醇孵育3分钟，以脱水细胞。将盖玻片从6孔板中取出，室温下晾干数分钟。</li>
	<li>在载玻片上滴加预杂交的探针，将盖玻片置于其上进行孵育。将载玻片放入湿盒中，盒内加入50 ml 50%甲酰胺/2x SSC，于37 °C过夜孵育。</li>
</ol>
5. 杂交后洗涤及探针的抗体介导检测
<ol>
	<li>在6孔板中加入2x SSC，预热至42 °C。在过夜孵育后加入盖玻片，并于42 °C孵育5分钟。</li>
	<li>移除2x SSC，将盖玻片在42 °C下用50%甲酰胺/2x SSC孵育10分钟。总共重复3次（总洗涤时间为30分钟）。</li>
	<li>移除50%甲酰胺/2x SSC，于室温下用Tris-盐水-Tween（TST）洗涤载玻片2次，每次5分钟。</li>
	<li>在新的玻片上每张盖玻片滴加50 µl Tris-盐水-BSA（TSBSA），将盖玻片倒置，在TST湿润的避光孵育盒中室温孵育30分钟以进行封闭。</li>
	<li>将盖玻片转移回6孔板中，用TST洗涤2次，每次5分钟。</li>
	<li>在新的玻片上每张盖玻片滴加50 µl羊抗地高辛抗体（1:500，溶于TSBSA），将盖玻片倒置，在TST湿润的避光孵育盒中室温孵育30分钟，进行第一次孵育步骤。</li>
	<li>将盖玻片转移回6孔板中，用TST洗涤2次，每次5分钟。</li>
	<li>在新的玻片上每张盖玻片滴加50 µl与FITC偶联的兔抗羊抗体（1:250，溶于TSBSA），将盖玻片倒置，在TST湿润的避光孵育盒中室温孵育30分钟，进行第二次孵育步骤。</li>
	<li>将盖玻片转移回6孔板中，用TST洗涤2次，每次5分钟。</li>
	<li>在新的玻片上每张盖玻片滴加50 µl与FITC偶联的山羊抗兔抗体（1:250，溶于TSBSA），将盖玻片倒置，在TST湿润的避光孵育盒中室温孵育30分钟，进行第三次孵育步骤。</li>
	<li>将盖玻片转移回6孔板中，用TST洗涤2次，每次5分钟。</li>
	<li>在新的玻片上每张盖玻片滴加50 µl鼠抗生物素抗体（1:200，溶于TSBSA），将盖玻片倒置，在TST湿润的避光孵育盒中室温孵育30分钟，进行第四次孵育步骤。</li>
	<li>将盖玻片转移回6孔板中，用TST洗涤2次，每次5分钟。</li>
	<li>在新的玻片上每张盖玻片滴加50 µl与罗丹明偶联的驴抗鼠抗体（1:250，溶于TSBSA），将盖玻片倒置，在TST湿润的避光孵育盒中室温孵育30分钟，进行第五次孵育步骤。</li>
	<li>将盖玻片转移回6孔板中，用TST洗涤2次，每次5分钟。</li>
	<li>在新的玻片上每张盖玻片滴加50 µl与罗丹明偶联的山羊抗马抗体（1:250，溶于TSBSA），将盖玻片倒置，在TST湿润的避光孵育盒中室温孵育30分钟，进行第六次孵育步骤。注：山羊抗马抗体可识别驴抗鼠抗体；若条件允许，使用山羊抗驴抗体同样有效。</li>
	<li>将盖玻片转移回6孔板中，用TST洗涤2次，每次5分钟，再用Tris-盐水（TS）额外洗涤5分钟。</li>
	<li>依次在70%乙醇中孵育3分钟、90%乙醇中孵育3分钟、100%乙醇中孵育3分钟以脱水。将盖玻片从6孔板中取出，室温下静置数分钟使其自然干燥。</li>
	<li>在玻片上滴加一滴含DAPI的封片剂（见试剂部分），将盖玻片倒置覆盖其上。用指甲油封片，并通过荧光显微镜观察FISH结果（图1）。</li>
</ol>

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<li>Chaumeil, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Xist+RNA+in+the+formation+of+a+repressive+nuclear+compartment+into+which+genes+are+recruited+when+silenced%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced.</a> Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).</li>
<li>Okamoto, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eutherian+mammals+use+diverse+strategies+to+initiate+X-chromosome+inactivation+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Eutherian mammals use diverse strategies to initiate X-chromosome inactivation during development.</a> Nature. 472, 370-374 (2011).</li>
<li>Gribnau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+chromosome+choice+occurs+independently+of+asynchronous+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">X chromosome choice occurs independently of asynchronous replication timing.</a> J Cell Biol. 168, 365-373 (2005).</li>
<li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+nascent+RNA%2C+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li>
<li>Van Tine, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+in+situ+detection+of+RNA%2C+DNA%2C+and+protein+using+tyramide-coupled+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous in situ detection of RNA, DNA, and protein using tyramide-coupled immunofluorescence.</a> Methods Mol Biol. 292, 215-230 (2005).</li>
<li>Pollex, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-Cell+Imaging+Combined+with+Immunofluorescence%2C+RNA%2C+or+DNA+FISH+to+Study+the+Nuclear+Dynamics+and+Expression+of+the+X-Inactivation+Center%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live-Cell Imaging Combined with Immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to Study the Nuclear Dynamics and Expression of the X-Inactivation Center.</a> Methods Mol Biol. 1042, 13-31 (2013).</li>
<li>Chaumeil, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+immunofluorescence%2C+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization%2C+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes%2C+transcriptional+activity%2C+nuclear+organization%2C+and+X-chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).</li>
<li>Lin, S., Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+culturing+mouse+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 690, 31-56 (2011).</li>
<li>Meissner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+manipulation+of+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation and manipulation of murine embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 482, 3-19 (2009).</li>
<li>Nichols, J., Ying, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+propagation+of+embryonic+stem+cells+in+serum-+and+feeder-free+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum- and feeder-free culture.</a> Methods Mol Biol. 329, 91-98 (2006).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

联合DNA-RNA荧光原位杂交（FISH）在技术上具有挑战性，因为适用于DNA FISH的条件可能对稳定性较差的RNA分子过于剧烈。已有多种方法被用于在同一个细胞中同时研究DNA和RNA，从而避免了必须在同一时间使用探针同时检测DNA和RNA的需求。例如，在叠加法中，首先进行RNA FISH，对细胞成像并记录坐标；随后，使用同一张载玻片进行DNA FISH，此过程中RNA FISH的信号会丢失；完成DNA FISH后再次对细胞成像，然后将RNA FISH和DNA FISH获得的图像进行叠加。尽管该方法在几乎所有情况下均可行，因为固定后的细胞DNA较为稳定，不会受到初始RNA FISH处理的影响，但该方法非常耗时，至少需要四天时间。另一种方法是先进行RNA FISH，然后通过添加固定剂来固定RNA FISH信号，再进行DNA FISH。虽然这种方法也可行，但在固定过程中可能会损失部分来自RNA FISH的荧光信号，这尤其会影响低水平表达转录本的检测。本文所介绍的方法经过优化，可在一次FISH实验中同时检测一个RNA靶标和一个DNA靶标，其优势在于仅需两天即可在单次实验中获得可靠的结果。
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通过荧光方法研究细胞与组织 原位 杂交（FISH）自20世纪70年代末引入以来1，使研究人员能够在亚细胞水平上研究基因、染色质结构和基因表达。DNA FISH 常用于细胞遗传学和核型分析2，癌症诊断3 和胚胎植入前遗传学筛查4，并在分子学研究中发挥重要作用5-6 因为它能够在天然环境中检测核酸。通过RNA FISH进行单细胞表达分析，可检测染色体上正在转录的天然初级转录本和非编码RNA，相较于在群体水平上评估基因表达的技术（如定量RT-PCR、全基因组表达分析或Northern印迹）具有优势。通过直接可视化源自其转录位点的RNA转录本，研究人员已发现基因表达具有随机性7，并且有时具有等位基因特异性8该技术的改进甚至实现了对细胞内单个mRNA分子的检测与定量9-11.
荧光原位杂交（FISH）的基本原理是利用高度特异性的沃森-克里克（Watson-Crick）碱基配对，使细胞内的核酸与核酸探针发生杂交。探针可通过直接或间接方式被检测，从而产生可在显微镜下观察到的信号。早期尝试使用放射性标记探针，但存在安全性问题、空间分辨率有限以及每次只能检测一个靶标等缺点12-14。随后发展出的非放射性标记物，包括荧光染料、半抗原和酶，使得FISH得以广泛应用于分子生物学常规实验中。FISH探针可通过化学方法将荧光分子直接连接至核酸序列15，或通过整合荧光标记的核苷酸实现直接标记16-19；也可通过整合半抗原（如生物素和地高辛）后，利用与荧光报告分子偶联的特异性抗半抗原抗体进行免疫学检测，从而实现间接可视化20-21。后一种方法可通过多层荧光标记抗体的级联反应实现信号放大，增强原始信号，从而检测低水平表达的RNA分子。通过结合直接与间接标记技术以及多种不同的半抗原，可在同一细胞内同时可视化多个靶标。
FISH 实验流程中最重要的步骤之一是探针与其靶标的杂交。理论上，探针应仅特异性地结合其靶标，但在实际操作中，这种特异性并不总能实现，因为探针可能结合到同源区域，且杂交条件未必始终适合特定的 DNA 区域或 RNA 分子。因此，杂交后的洗涤步骤尤为重要，因为它可以提高 FISH 实验的严谨性，防止 FISH 探针的非特异性结合，从而避免产生高水平的背景噪音。由于 RNA 分子为单链结构，可直接与 FISH 探针进行杂交；相比之下，双链 DNA 分子则需先经过变性处理，才能使探针结合。这通常通过加热样本实现，从而使 DNA 发生变性。然而，在这种较为剧烈的条件下，脆弱的单链 RNA 分子可能会丢失。因此，联合进行 DNA 与 RNA 的 FISH 检测需要对实验条件进行大量优化，其技术难度明显高于单独检测 RNA 或 DNA 的实验。
本文介绍了一种联合、同步进行的DNA-RNA荧光原位杂交（FISH）详细实验方案，该方法使我们能够在分化中的雌性小鼠胚胎干细胞中研究X染色体失活（XCI）过程。22-24XCI 是女性胚胎发育的关键表观遗传机制25，导致雌性个体中两条X染色体之一发生异染色质化，从而使其失活26-27这一过程的关键是非编码RNA Xist28-30，该过程受RNF12调控22-23 和 REX124 蛋白质 Xist 在胚胎发育过程中或胚胎干细胞分化时，该基因在未来的失活X染色体（Xi）上表达上调 在 体外，并可沿X染色体扩散，从而招募染色质重塑酶，导致X染色体的转录失活31这种扩散 Xist RNA 可通过 RNA FISH 显示为 X 染色体上的包被，也称为 Xist 云。由于雌性胚胎干细胞可能因基因组不稳定而丢失其中一条X染色体，我们及其他研究者已采用DNA-RNA联合荧光原位杂交技术（FISH）来研究X染色体失活（XCI），以确保仅对核型稳定的细胞进行这一重要过程的分析22,32-34与所有分子生物学技术一样，已有多种不同的优秀实验方案被发表35-38在此，我们介绍我们的方法，该方法从诱导小鼠胚胎干细胞分化开始，随后对细胞进行固定，通过缺口平移法对FISH探针进行标记，对固定后的细胞进行预处理以增强通透性并促进探针摄取，将探针与靶序列杂交，最后利用荧光标记的抗体对探针进行检测。本方案可实现对目标序列的准确检测 Xist 两天内对RNA和X染色体进行研究，该技术的基本原理可能适用于其他系统和研究领域。

<table><tbody><tr><td>雌性小鼠胚胎干细胞</td><td></td><td></td><td>可根据要求提供</td></tr><tr><td>小鼠胚胎成纤维细胞</td><td></td><td></td><td>可从E13.5胚胎中分离获得，或通过商业来源获取 &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Millipore</td></tr><tr><td>胚胎干细胞培养基</td><td></td><td></td><td>DMEM、15% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 mg/ml 链霉素、非必需氨基酸、0.1 mM &amp;#947;-巯基乙醇和 1,000 U/ml LIF。过滤除菌后于 4 &amp;#176;C 保存，最多保存 2 周。</td></tr><tr><td>LIF</td><td>Chemicon</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960085</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>青霉素&amp;ndash;链霉素 (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#947;-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>胚胎干细胞分化培养基</td><td></td><td></td><td>IMDM-Glutamax、15% 热灭活胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 mg/ml 链霉素、非必需氨基酸、37.8 &amp;#956;l/L 单硫代甘油和 50 &amp;#956;g/ml 抗坏血酸</td></tr><tr><td>IMDM-Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>31980-030</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸 (50 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>单硫代甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>T25 细胞培养皿</td><td>Greiner Bio-one</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>6 孔细胞培养板</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养级 PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 0.25% (v/v) 胰蛋白酶/0.2% (w/v) EDTA 的 PBS 溶液</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 管</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>24 × 24 mm 盖玻片</td><td>Menzle</td><td>780882</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>配制 0.2% 明胶/细胞培养 PBS 溶液，并进行高压灭菌</td></tr><tr><td>胃蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7000</td><td>用 0.01 M HCl (pH 2.0) 稀释至 0.2%</td></tr><tr><td>无水乙醇（100%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32221-2.5L</td><td>使用无水乙醇和无 RNA 酶水配制 70% 和 90% 的乙醇溶液</td></tr><tr><td>无 RNA 酶水</td><td>Baxter</td><td>TKF7114</td><td></td></tr><tr><td>无菌滤芯吸头</td><td>Rainin Bio Clean</td><td>GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F</td><td></td></tr><tr><td>地高辛标记试剂盒（DIG-缺口平移法）</td><td>Roche</td><td>11745816910</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记试剂盒（生物素-缺口平移法）</td><td>Roche</td><td>11745824910</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5080</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 注射器</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>灭菌棉</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 管</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>酵母 tRNA 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15401-029</td><td></td></tr><tr><td>鲑鱼精 DNA 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 cot-1 DNA 1 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 台式微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5417R</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 冷冻离心机</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5810R</td><td></td></tr><tr><td>2 M NaAc, pH 5.6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7670</td><td></td></tr><tr><td>50+ 杂交溶液</td><td></td><td></td><td>50% 甲酰胺、2x SSC、50 mM 磷酸盐缓冲液 pH 7、10% 硫酸葡聚糖 pH 7</td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Acros organics</td><td>3272350000</td><td></td></tr><tr><td>硫酸葡聚糖</td><td>Fluka</td><td>31403</td><td></td></tr><tr><td>10 mM 磷酸盐缓冲液, pH 7</td><td></td><td></td><td>加入 57.7 ml 1 M Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 和 42.3 ml 1 M NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;；使用 DEPC 处理水并进行高压灭菌</td></tr><tr><td>变性缓冲液</td><td></td><td></td><td>70% 甲酰胺/2x SSC/10 mM 磷酸盐缓冲液 pH 7</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>2 M Tris pH 7.5 溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-生理盐水-Tween 洗涤液 (TST)</td><td></td><td></td><td>100 ml 10x 生理盐水、50 ml 2 M Tris、500 &amp;#956;l Tween-20，加无 RNA 酶水至 1 L</td></tr><tr><td>10x 生理盐水溶液</td><td></td><td></td><td>将 85 g NaCl 溶解于 1 L 无 RNA 酶 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 中，高压灭菌</td></tr><tr><td>Tris-生理盐水-BSA (TSBSA)</td><td></td><td></td><td>500 &amp;#956;l 10x 生理盐水、250 &amp;#956;l 2 M Tris、1 ml 100x BSA、3.25 ml 无 RNA 酶 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>BSA，纯化，100x</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>羊抗地高辛抗体</td><td>Roche diagnostics</td><td></td><td>用 TSBSA 以 1:500 稀释使用</td></tr><tr><td>与 FITC 偶联的兔抗羊抗体</td><td>Jackson labs</td><td></td><td>用 TSBSA 以 1:250 稀释使用</td></tr><tr><td>与 FITC 偶联的山羊抗兔抗体</td><td>Jackson labs</td><td></td><td>用 TSBSA 以 1:250 稀释使用</td></tr><tr><td>鼠抗生物素抗体</td><td>Roche diagnostics</td><td></td><td>用 TSBSA 以 1:200 稀释使用</td></tr><tr><td>与罗丹明偶联的驴抗鼠抗体</td><td>Jackson labs</td><td></td><td>用 TSBSA 以 1:250 稀释使用</td></tr><tr><td>与罗丹明偶联的山羊抗马抗体</td><td>Jackson labs</td><td></td><td>用 TSBSA 以 1:250 稀释使用</td></tr><tr><td>Tris-生理盐水洗涤液 (TS)</td><td></td><td></td><td>10 ml 10x 生理盐水、5 ml 2 M Tris、85 ml 无 RNA 酶 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>含 DAPI 的 Vectashield 封片剂</td><td>Vectorlabs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>指甲油</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

联合dna-rna荧光检测 原位 杂交（fish）技术研究分化后雌性小鼠胚胎干细胞中的x染色体失活

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

荧光原位杂交（FISH）是一种能够在细胞中检测核酸的分子技术。DNA FISH 常用于细胞遗传学和癌症诊断，可检测基因组的异常，这些异常通常具有重要的临床意义。RNA FISH 可用于检测细胞中的 RNA 分子，在基因表达调控研究中提供了重要的见解。在同一细胞中联合进行 DNA 和 RNA FISH 在技术上具有挑战性，因为适用于 DNA FISH 的条件可能对脆弱的单链 RNA 分子过于剧烈。本文介绍了一种易于应用的实验方案，可实现Xist RNA 与 X 染色体编码 DNA 的联合同步检测。该 DNA-RNA 联合 FISH 方案也可能适用于其他需要同时检测 RNA 和 DNA 的研究体系。

利用上述联合DNA-RNA荧光原位杂交（FISH）方案，我们已能够在分化中的雌性胚胎干细胞中可视化X染色体失活过程。图1展示了一个典型的DNA-RNA FISH实验示例，其中我们同时检测到了Xist（在失活X染色体上表现为所谓的Xist RNA云状信号，在活性X染色体上则表现为基础转录的点状信号）以及X染色体上的一个区域，该区域呈现为点状信号。请注意，其中一个点状信号位于Xist云状信号内部，表明Xist云确实沿X染色体定位并包被其表面。使用本方案时，在超过99%的细胞中均可检测到正确的DNA信号（数据未显示）。与单独的RNA-FISH相比，采用联合DNA-RNA FISH方法所观察到的Xist云状信号有时显得更大，这可能是由于变性的DNA占据的空间更大所致。我们已在人类胚胎干细胞、人类淋巴细胞以及多种物种来源的不同成纤维细胞系中获得类似结果，并且该相同方案已被用于研究多个X染色体连锁位点的基因表达，包括Rnf12。此外，当该方案应用于未分化的雌性胚胎干细胞时，可检测到两个X染色体上均存在基础水平...

荧光原位杂交（FISH）可在细胞内天然环境中检测核酸。本文介绍一种通过FISH同时联合检测RNA和DNA的实验方案，可用于研究小鼠胚胎干细胞中的X染色体失活。

联合DNA-RNA荧光检测 原位 杂交（FISH）技术研究分化后雌性小鼠胚胎干细胞中的X染色体失活

荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization, FISH）是一种能够检测细胞中核酸的分子技术。DNA FISH 常用于……

本实验的总体目标是通过同时结合DNA和RNA荧光原位杂交（即DNA-RNA FISH）技术，研究雌性小鼠胚胎干细胞分化过程中的X染色体失活现象。该目标首先通过诱导雌性小鼠胚胎干细胞分化来实现。在此模拟正常着床后胚胎发育的过程中，X染色体失活被启动，导致编码未来失活X染色体的Xist RNA转录增强并发生累积。第二步是使用偏醛固定已分化的胚胎干细胞。接下来，通过缺口平移法，用生物素或地高辛标记DNA片段，制备用于检测X染色体DNA和囊肿RNA的探针。最后一步是进行DNA-RNA FISH实验。将已分化的胚胎干细胞进行通透和变性处理，然后与标记的FISH探针杂交，再使用荧光标记的抗体检测探针中的生物素或地高辛。最终，通过免疫荧光显微镜观察雌性细胞中两条染色体的位置，并可视化来自发生失活的X染色体上的cyst RNA的表达情况。与FISH等后续分别检测RNA和DNA的方法相比，本技术的主要优势在于，使用我们的方案可在不到两天的时间内，在同一标本中同时检测这两种核酸。尽管联合进行DNA和RNA的FISH检测具有较大挑战性，因为检测DNA或RNA的最佳条件存在显著差异。但通过本文所介绍的方案，我们几乎能够在所有分析的细胞中同时检测到来自两条X染色体的RNA和DNA。 这使我们能够研究X染色体失活过程，该过程发生在雌性小鼠胚胎干细胞分化或异常雌性小鼠发育期间。尽管该方法可为X染色体失活这一在小鼠早期胚胎发育中发生的重要而引人入胜的过程提供深入见解，但它也可能适用于其他生物系统，特别是在需要检测来源于天然染色质的RNA转录本的情况下。随着人们对非编码RNA在生物系统中重要性的认识日益加深，单细胞方法往往优于评估整个细胞群体的替代方法。我们预计该实验方案将对广泛的科学界有所帮助。将雌性小鼠胚胎干细胞（ESL）在标准ESL条件下培养于经明胶包被并接种小鼠胚胎成纤维细胞（ORMs）的培养皿中，以启动诱导分化程序。从ESL培养物中移除ES培养基，用细胞培养用PBS洗涤两次。加入1.5毫升预先在37摄氏度温育的胰蛋白酶-EDTA溶液，于37摄氏度孵育细胞7分钟。孵育3.5分钟后，轻轻摇动培养皿以分散细胞集落。通过向细胞中加入 3.5 毫升分化培养基来灭活胰蛋白酶 EDTA，用移液器将细胞反复吹打以获得单细胞悬液，并收集至 15 毫升离心管中。在 200 ×g 条件下离心 5 分钟。将细胞收集于 10 毫升分化培养基后，将细胞悬液加入未包被明胶的 10 厘米培养皿中，于细胞培养箱中孵育 1 小时。在此条件下，MES 细胞能够贴附于未包被明胶的培养皿表面，而 ES 细胞则保持悬浮状态。在此期间，将无菌玻璃盖玻片放入六孔板中，加入0.2%明胶，室温孵育至少五分钟。一小时后，在室温下收集预培养eSL细胞的上清液，其中主要含有未贴壁的eSL细胞。将eSL细胞稀释后，接种于含有盖玻片的六孔板中。开始此操作时，先从分化培养物中移除分化培养基，并用细胞培养用 PBS 洗涤两次。添加 PBS 时务必小心，以防止细胞被冲走。通过加入 4% 多聚甲醛 PBS，在室温下孵育 10 分钟，以固定细胞。10分钟后，去除多聚甲醛，并用70%乙醇将盖玻片洗涤三次。为制备用于标记的DNA探针，首先将每种相应的DNA各一微克溶于水中，总体积为16微升。然后加入4微升地高辛或生物素标记溶液，涡旋混匀，在16摄氏度孵育90分钟。这将通过NIC翻译掺入生物素或地高辛标记的核苷酸。同时，准备G 50柱。为去除未整合的核苷酸，取一个2毫升注射器，移除活塞，并向注射器中加入灭菌棉。加入G 50珠子及溶液以填充注射器。然后将注射器置于15毫升离心管中，在642 ×g条件下离心1分钟。离心后，注射器约80%体积应充满G 50。90分钟后，向每个NIC翻译反应体系中加入40 µL水，并将反应液转移至G 50柱中。在柱子下方放置一个空管，以642 ×g离心两分钟。收集流出液至一个反应管中。用移液器测量流出液的体积，然后加水至总体积为200 µL。为沉淀流穿组分，加入鲑鱼精子DNA、酵母tRNA、小鼠捕获的1D NA以及2摩尔的醋酸钠，通过涡旋混合。加入533微升预冷的100%乙醇，混匀后在4°C、16,200 ×g条件下离心30分钟。离心结束后，弃去上清，用70%乙醇在4°C、16,200 ×g条件下离心5分钟，洗涤沉淀物，重复两次，然后将沉淀物空气干燥。当沉淀干燥后，加入50 µL杂交溶液，在37°C下孵育30分钟。为促进渗透前的溶解，需将固定后的细胞重新水化：移除70%乙醇，向细胞中加入细胞培养用PBS，以暴露盖玻片。孵育5分钟，共重复三次，以充分通透细胞。移除细胞培养用PBS，向六孔板中加入0.2%胰蛋白酶。将六孔板置于37°C水浴中孵育4分钟。随后，去除种籽并用无RNA酶的水进行灭活。固定后，在室温下用4%多聚甲醛PBS溶液孵育5分钟以对细胞进行后固定，然后用细胞培养液或PBS洗涤两次，每次5分钟。通过依次在70%乙醇中孵育3分钟、90%乙醇中孵育3分钟以及100%乙醇中孵育3分钟，对细胞进行脱水处理。随后将盖玻片从六孔板中转移出来，并将盖玻片干燥数分钟。将盖玻片置于65摄氏度的加热板上孵育1小时，以老化细胞。在此期间，通过将每张待分析的盖玻片所需的荧光原位杂交探针与小鼠封闭液1D NA混合，预先进行探针杂交。25 微升 50 加杂交溶液。加入 1 微升生物素标记的 Cyst 探针、1 微升地高辛标记的 BAC 探针（用于检测 X 染色体）以及 0.5 微升小鼠 Cot-1 DNA，涡旋混匀后在 99 摄氏度下变性 5 分钟。立即在 37 摄氏度下孵育 45 分钟，使 Cot-1 DNA 与探针中存在的重复序列杂交。当盖玻片上的细胞老化后，在载玻片上滴加50微升脱成熟缓冲液，并将盖玻片细胞面朝下置于脱成熟缓冲液上。在65摄氏度孵育两分钟。随后将盖玻片转移回预装有冰冻70%乙醇的六孔板中，对细胞进行后固定，并孵育五分钟。将细胞依次在70%乙醇中孵育3分钟、90%乙醇中孵育3分钟和100%乙醇中孵育3分钟以进行脱水。从六孔板中取出盖玻片，静置数分钟使其自然干燥。在玻璃载片上滴加预杂交的探针，并将盖玻片覆盖于其上，置于孵育器中孵育。将载玻片放入加有50毫升50%IDE和2×SSC的湿化室中，在37摄氏度下孵育过夜。过夜孵育后，将盖玻片从玻片转移至已加入预热至42摄氏度的2×SSC溶液的六孔板中。在42摄氏度下孵育5分钟。移除两倍浓度的XSSC，加入含50%甲酰胺的两倍浓度XSSC。在42摄氏度下孵育10分钟。用含50%甲酰胺的两倍浓度XSSCA溶液洗涤，每次10分钟，共洗涤三次，每次均在42摄氏度下进行。第三次洗涤后，除去50%甲酰胺的2×SSC，用TST（Tris盐水Tween）在室温下洗涤载玻片两次，每次五分钟，以进行封闭。每张载玻片上加入50微升Tris盐水BSA（T-S-P-S-A），盖上新的盖玻片，并将盖玻片倒置放在新玻片上，在TST湿润的避光孵育室中室温孵育30分钟。30分钟后，将盖玻片重新转移至六孔板中，用TST洗涤两次，每次五分钟。进行一抗孵育时，在新的玻片上每张盖玻片加50微升羊抗原和抗体，将盖玻片倒置放在玻片上，在TST湿润的避光孵育室中室温孵育30分钟。随后，将盖玻片与一系列荧光标记抗体共同孵育，以增强原始信号，具体步骤详见随附的手稿。在与一系列荧光标记抗体孵育后，将细胞依次在70%乙醇、90%乙醇和100%乙醇中各孵育3分钟进行脱水。从六孔板中取出盖玻片，室温下静置数分钟使其自然干燥。最后，在每张玻片上滴加一滴封片剂，并加入一滴 dappy。将盖玻片倒置盖在上面，并用指甲油密封玻片。采用此方案进行 DNA-RNA 联合 FISH，可在分化中的雌性 ES 细胞中观察 X 染色体失活现象。该图展示了一个典型的 A-D-N-A-R-N-A 原位杂交实验示例，其中同时检测了囊泡 RNA 和 X 染色体的一个区域。囊泡 RNA 是一种非编码 RNA，在 X 染色体失活过程中起关键作用。在此处正在分化的雌性 ESL 细胞中，使用生物素标记的 CD NA 探针检测囊泡 RNA，并通过与鲁米诺偶联的抗体进行可视化，结果显示为红色。使用标记的BAC探针（xigen）检测X染色体，并通过与FITC偶联的抗体进行可视化，显示为绿色；细胞核经DPI复染，显示为蓝色。在几乎所有细胞中均可检测到两条X染色体。既可检测到来自失活X染色体的大囊泡聚集区域（囊泡云），也可检测到来自活性X染色体的基础囊泡表达（囊泡定位点）。并非每个细胞核中都能检测到囊泡样微点，因为在细胞分化过程中，未来有活性的X染色体上的基础囊泡表达会停止。需要注意的是，部分来自X染色体的微点信号位于囊泡云内，这表明囊泡云确实沿X染色体定位并对其进行编码。一旦掌握，该技术可在不到两天的时间内完成，且若操作得当，结果可靠。观看本视频后，您应能够充分理解如何诱导雌性小鼠胚胎干细胞分化、如何固定这些细胞，以及如何制备细胞以进行DNA-RNA联合荧光原位杂交（FISH）。请记住，为确保实验成功，必须严格按照本方案中指定的条件，保持温度和孵育时间恒定。此外，务必在洁净的环境中操作。如果使用不同的细胞类型或研究不同的生物系统，可能需要进行一些优化，以获得最佳结果。祝您的实验顺利。

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