单通道细胞贴附膜片钳记录
June 9th, 2014
这里描述的是获得当前记录的很长一段距离与细胞贴附膜片钳技术一种离子通道的过程。这种方法允许观察，实时的背后的生物信号开闭通道构象的图案。这些数据的通知关于在不受干扰的生物膜通道属性。
该程序的总体目标是测量通过单个离子通道的电流。这是通过首先在易于处理且有利于实验目标的细胞中异源表达目标离子通道来实现的。第二步是使用火抛光移液器在细胞膜上获得稳定的密封。
接下来，实验者应确定 patch 中存在的通道数，如果是单通道记录电流，则最后一步是处理和分析数据。最终，记录来自单离子通道的电流用于研究这些膜蛋白作用的生物物理特性，这构成了神经元和其他可兴奋细胞如何通信的基础。与允许您测量通过多个活性离子通道的电流的方法相比，这种方法的优势在于，测量通过单个离子通道的电流可以让您可视化和分离特定通道固有的各种响应模式。
这种方法可用于回答神经科学领域的关键问题，例如生理和治疗调节剂会影响神经元之间的交流。通常，不熟悉这项技术的人会很困难，因为很难获得仅包含单个离子通道的低噪声记录。第一次尝试这种方法时，看到有人这样做真的很有用，因为要获得真正稳定的密封，这是这种方法中最重要的事情，你需要以特定的角度轻轻接近细胞，最重要的是，你必须坚持不懈地准备转染。
提前一天将 HEK 2 93 细胞接种在 35 毫米培养皿中，使其在无菌管中达到 50% 至 60% 汇合。制备转染混合物。添加 1 微克每种感兴趣的 CDNA、315 微升双蒸水和 350 微升 42 毫摩尔堆。
最后，滴加 35 微升氯化钙以形成沉淀。涡旋试管 5 秒钟，并向四个培养皿中分别添加 175 μL 转染悬浮液。前一天装盘。
将细胞在 37 摄氏度下孵育 2 小时。孵育后，取出培养基并用 PBS 洗涤。接下来，加入 2 毫升生长培养基，补充 2 毫摩尔氯化镁，以防止 MDA 受体介导的兴奋性毒性。
首先，使用垂直拉拔器从 boy 硅酸盐玻璃中拉出两个对称的记录移液器。接下来，必须进行火焰抛光以获得适当的直径和电阻。接下来，通过打开 QUB 数据采集软件并选择采集窗口来设置记录。
在 layout.单击新数据打开新的 QUB 数据文件，然后输入要使用的实验参数。通过右键单击数据文件，选择属性，然后单击数据选项卡，将振幅缩放调整为每皮安培 0.1 伏特。
用两毫升含钙和镁的 PBS 更换培养基后，将细胞培养皿安装到显微镜载物台上。使用相差显微镜关注细胞视野，以评估细胞是否健康并以单层方式很好地附着在培养皿上。切换到荧光检测以验证转染是否成功。
接下来，设置单声道录制的参数。使用电压保持命令将模式设置为电压钳位，并将施加的电压设置为正 100 毫伏。在关闭位置，根据荧光和整体外观选择密封测试按钮。
选择要修补的细胞，在相差下验证细胞是否很好地附着在培养皿上，是否有很大一部分细胞表面暴露在修补中，其他方面看起来健康。用适用于 NMDA 受体和细胞附着实验的溶液填充新抛光的移液器，然后轻轻轻弹以去除任何气泡。将记录移液器固定在放大器头级上，并确保银线浸入移液器溶液中，以防止浴液进入移液器。
在接近过程中，使用连接到移液器支架的小塑料注射器轻轻施加正压。接下来，使用微型机械手将移液器引导至浴中。闭合电路，将其直接放置在选定进行修补的单元上。
进入浴缸时请注意示波器。移液器阻力应在最佳范围内，同时在显微镜中目视监测管道的位置，并在示波器上监测其电阻。以小增量继续该方法，直到移液器轻轻撞击细胞。
测试信号将略微降低，以表明电阻增加。要形成密封，请拿起注射器并通过侧管轻轻施加轻微的负压。通过拉动注射器柱塞密封的形成，示波器上的测试信号波形完全变平来指示。
在放大器上。将外部命令切换从密封测试切换到关闭。将电压保持命令从 off 切换到 positive，并将增益从 10 x 增加到 100 x。
观察示波器的通道活动，如果存在，则显示为与先前平坦的基线的方形向下偏转。如果示波器上显示通道活动，则按下播放按钮，然后按录制按钮，开始将数据采集到之前打开的 QUB 数字文件中。要停止采集数据，请按 QUB 中的停止按钮，并将 QDF 文件保存为未完全变平的信号，或者变得嘈杂且不稳定的基线可能表明密封较弱。
在这种情况下，取出并丢弃移液器，然后用新的移液器重复执行步骤，直到获得足够的密封。要开始数据分析过程，请在 QUB 中打开记录的数据文件，并在 pre 界面中检查当前跟踪。在 layout.
取消选中标记为 fc 的框，删除数字滤波器以全带宽显示记录的轨迹。目视扫描痕迹以发现不规则和伪影 Brief.电流尖峰可以通过突出显示相同电导等级的相邻干净区域来校正。
右键单击并选择 set erase buffer first（首先设置擦除缓冲区），放大尖峰，直到看到单个采样点。通过仅突出显示此区域来选择要替换的区域。右键单击并选择 erase （擦除） 以更正整个记录的基线。
通过选择基线稳定的记录的早期部分来定义零当前基线。突出显示，右键单击并选择 set baseline。当基准指南出现时，通过目视检查确认它是否准确代表了基准水平。
确定记录中原始数据基线明显偏离设置基线的点。通过在偏差区域内选择一小部分基线来纠正此问题。右键单击并选择 add a baseline node 命令。
当记录偶尔包含过多的噪声或伪影的时间段时，这些时间段无法轻松更正，则应删除这些部分，但首先需要将其分成连续的段。在要丢弃的区域之前高亮显示。右键单击并选择 break segment （中断线段）。
在此之后，突出显示要丢弃的部分，右键单击、选择、删除并按 Enter 键以理想化记录。切换到 layout 下的 MOD 界面。在数据显示面板中，选择包含已关闭事件和未结事件的记录的一小部分。
将光标移动到下面的高分辨率面板中，并在所选跟踪中突出显示代表基线的干净段。将光标移动到下方的模型面板上，右键点击黑色方块，这将代表关闭状态，然后选择 grab。通过突出显示表示开路电导的部分特征，对通道开路重复该过程。
右键单击模型面板中的红色方块，然后选择 grab。通过选择 data source 下的 SEL 按钮，对记录的选定部分执行理想化。然后右键单击弹出面板上建模部分下方的理想化选项卡。
验证所需的分析参数是否正确，然后单击 run。理想化的结果以及所选部分的振幅直方图与数据重叠，以便目视检查理想化。如有必要，调整理想化参数以获得最佳结果，然后重复，通过选择 Data source （数据源） 下的 file （文件） 按钮对整个文件执行理想化。
然后右键单击理想化选项卡，然后单击 Run。将显示整个文件的结果。与数据叠加，仔细检查理想化轨迹与记录数据之间的匹配。
有时，会错误地识别出可以从理想化跟踪中排除的事件。选择 false 事件，右键单击并选择加入 IDL。此处显示的是通过 HEK 2 93 细胞中单个 NMDA 受体的仅钙离子电流。
使用细胞附着膜片钳技术，数据理想化产生振幅直方图，该直方图非常适合该细胞中的两个不同的电导类别。来自 HEK 2 93 细胞的附加记录，一个 Meno 敏感通道被激活负 20 毫米。在恒定施加电压期间通过贴状移液器的汞压。
红色虚线表示零电流电平。这些来自天然通道的记录显示了从神经元的胞体记录的连续 NMDA 受体活性，该神经元从大鼠胚胎的前额叶皮层分离并在培养物中维持 5 天或 27 天。掌握后，此过程可以在 30 分钟到 1 小时内完成，具体取决于录制的持续时间。
按照此程序，可以执行其他方法，如动力学分析和状态建模，以确定通道的门控机制并估计反应速率。观看此视频后，您应该对如何记录和开始分析通过一种离子通道蛋白的电流有很好的了解。
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概述
本文描述了使用细胞附着膜片钳技术测量单一离子通道电流的程序。这种方法能够实时观察通道构象，为了解其生物物理特性提供了洞见。
关键研究组成部分
科学领域
- 电生理学
- 神经科学
- 细胞生物学
背景
- 离子通道对细胞间通信至关重要。
- 了解单通道行为有助于阐明神经元信号传递。
- 细胞附着膜片钳技术允许详细的电流测量。
- 单通道记录可以揭示离子通道的独特响应模式。
研究目的
- 测量单一离子通道的电流。
- 研究离子通道的生物物理特性。
- 增进对离子通道如何参与细胞间通信的理解。
使用的方法
- 在适合的细胞中异源表达离子通道。
- 使用火焰抛光吸管在细胞膜上创建稳定的密封。
- 确定膜片中的通道数量。
- 单通道电流记录和随后的数据分析。
主要结果
- 成功测量单一离子通道的电流。
- 可视化开放-关闭通道构象。
- 对单个离子通道的独特响应模式的洞见。
- 增进对离子通道在神经元通信中的作用的理解。
结论
- 细胞附着膜片钳技术在研究单一离子通道方面是有效的。
- 该方法提供了生物膜中通道特性的宝贵数据。
- 研究结果为更广泛理解神经信号传导机制做出了贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
Single-channel electrophysiology provides direct measurement of ion channel biophysical properties, enabling mechanistic de-risking of therapeutic targets in neuroscience and channelopathy drug discovery. By resolving conformational dynamics and gating mechanisms at molecular resolution, this method supports target validation and lead identification through quantitative functional assessment. It enhances predictive confidence in early discovery by distinguishing specific channel modulation from nonspecific effects, informing go/no-go decisions in portfolio prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring ligand-induced conformational changes in NMDA and PIEZO1 channels.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of single-channel open-closed kinetics.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by isolating channel-specific responses from cellular background noise.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (HEK293, native neurons) for downstream ligand screening and modulator profiling.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible single-channel recordings with quantifiable conductance and open probability metrics.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by resolving subtype-specific and state-dependent pharmacological profiles.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects discovery findings to disease relevance through native cortical neuron recordings of NMDA receptor activity.
- Operational Value: Ensures translational continuity by using identical recording parameters across heterologous and native systems.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by defining biophysical benchmarks for lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing mechanistic insights that inform assay design and compound characterization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving ion channel gating mechanisms under physiological and pharmacological conditions.
- Screening: Delivers assay readiness through stable seal formation and low-noise single-channel recording capable of detecting modulator effects.
- Analytics: Generates quantitative measurements (amplitude histograms, open-closed dwell times) enabling objective comparison of test conditions across experimental groups.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via native neuron recordings that mirror heterologous system findings, strengthening target confidence.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology platform applicable to diverse ion channels (NMDA, PIEZO1) and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence through direct measurement of channel conductance and gating kinetics, reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via fire-polished pipette technique and consistent voltage-clamp parameters across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering unambiguous, single-molecule pharmacological profiles that reduce false positives in lead identification.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by defining quantitative biophysical thresholds for channel modulation that inform preclinical advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, patch-clamp technique, and ion channel biology.
- Depends on specialized instrumentation including micromanipulators, amplifiers, and data acquisition software (QUB).
- Necessitates cross-team standardization of seal quality criteria and baseline correction protocols for data comparability.
- Involves adaptation considerations for different cell types (HEK293, primary neurons) and channel types (ligand-gated, mechanosensitive).
- Limited by the technical challenge of achieving stable, high-resistance seals and maintaining low-noise recordings over extended durations.
