单通道细胞贴附式膜片钳记录

本实验的总体目标是测量单个离子通道中的电流传导。首先，将目标离子通道在易于操作且适合实验目的的细胞中进行异源表达。第二步，使用火焰抛光的玻璃微电极在细胞膜上形成稳定的封接。

接下来，实验人员应确定膜片中存在的通道数量，若为单通道记录电流，则最后一步是对数据进行处理和分析。最终，通过记录单个离子通道的电流，可用于研究这些膜蛋白发挥作用的生物物理特性，这是神经元及其他可兴奋细胞间通信机制的基础。与能够测量多个活性离子通道电流的方法相比，该方法的优势在于，通过单个离子通道的电流测量，可直观分辨并分离出特定通道所固有的多种响应模式。

该方法可用于解答神经科学领域中的关键问题，例如生理性和治疗性调节剂如何影响神经元之间的通讯。通常，初次接触该技术的研究人员会遇到困难，因为很难获得仅包含单一离子通道且噪声较低的记录。初次尝试该方法时，观察他人实际操作非常有帮助，因为要获得真正稳定的封接（这是本方法中最重要的环节），必须以特定角度轻柔地接近细胞，而最重要的是，操作者必须具备足够的耐心。在进行转染前需做好充分准备。

提前一天将HEK 293细胞接种于35毫米培养皿中，使其在无菌条件下达到50%至60%的融合度。配制转染混合液：加入1微克目标cDNA、315微升双蒸水和350微升42毫摩尔的HEPES。

最后，逐滴加入35微升氯化钙以形成沉淀。涡旋混匀试管5秒，然后向四个培养皿中每个加入175微升转染悬浮液。前一天已接种。

将细胞在37摄氏度下孵育两小时。孵育结束后，移除培养基，并用PBS洗涤。接着加入2毫升生长培养基，其中添加2毫摩尔的氯化镁，以防止MDA受体介导的兴奋性毒性。

首先，使用垂直拉制仪从硼硅酸盐玻璃毛细管中对称地拉制两根记录电极。接着，需进行火焰抛光，以获得合适的直径和阻抗。然后，打开QUB数据采集软件并选择采集窗口，完成记录前的设置。

在布局界面下，通过点击“新建数据”打开一个新的 QUB 数据文件，并输入将要使用的实验参数。通过右键点击数据文件，选择“属性”，然后点击“数据”选项卡，将幅度缩放调整为每皮安 0.1 伏特。

用含有钙和镁的 2 毫升 PBS 替换培养基后，将细胞培养皿安装到显微镜载物台上。使用相差显微镜观察细胞区域，以评估细胞状态是否健康，并以单层形式良好贴附于培养皿上。切换至荧光检测，以确认转染成功。

接下来，设置单通道记录的参数。将模式设为电压钳制，并通过电压钳制指令将施加电压设为正100毫伏。在关闭状态下，根据荧光信号和整体外观选择封接测试按钮。

选择一个细胞进行封接，在相差显微镜下确认该细胞已牢固贴附于培养皿表面，具有较大面积的暴露表面可用于封接，且整体形态健康。用适合NMDA受体和细胞贴附实验的溶液填充一支 freshly polished 玻璃电极，并轻轻弹动以排除任何气泡。将记录电极固定在放大器的电极架上，并确保银丝浸入电极溶液中，以防止浴液进入电极内部。

接近过程中，使用连接至移液管固定器的小型塑料注射器轻轻施加正压。接着，利用显微操作器将移液管导入浴液中。闭合电路后，将移液管定位在选定进行膜片钳记录的细胞正上方。

进入浴液时请注意示波器上的信号。在显微镜下目视观察移液管位置的同时，通过示波器监测其电阻值，确保移液管电阻处于最佳范围内。以微小步进继续推进，直至移液管轻轻接触细胞。

测试信号会略微下降，表明电阻增加。为形成封接，拿起注射器，通过侧管轻轻施加轻微的负压。当在示波器上观察到测试信号波形完全变平时，即表示封接形成成功。

在放大器上，将外部指令开关从“封接测试”切换至“关闭”；将电压钳制指令从“关闭”切换至“开启”，并将增益从 10 × 提高至 100 ×。

在示波器上观察通道活性，如果存在活性，将显示为从先前平坦基线向下的方形偏转。若示波器上显示出通道活性，可开始采集数据：在 QUB 中按下播放按钮，随后按下记录按钮，将数据存入先前已打开的数字文件中。要停止数据采集，请在 QUB 中按下停止按钮，并保存 QDF 文件。信号未能完全变平，或基线变得嘈杂且不稳定，可能提示封接较弱。

在此情况下，移除并丢弃移液管，使用新的移液管重复上述步骤，直至获得足够的封接。要开始数据分析过程，请在 QUB 中打开记录的数据文件，并在预界面中的布局下检查电流轨迹。

取消勾选标有 fc 的复选框，移除数字滤波器，以全带宽显示记录的轨迹。目视扫描轨迹，查找不规则现象和伪迹。电流尖峰可通过选中相同电导类别中相邻的干净区域进行校正。

右键单击并选择“设置擦除缓冲区”，然后放大尖峰，直到可观察到单个采样点。通过仅高亮显示待替换区域来选中该区域。右键单击并选择“擦除”，以校正整个记录的基线。

通过选择记录中基线稳定的早期部分来定义零电流基线。选中后右键单击并选择“设置基线”。当基准线出现时，通过目视检查确认其准确反映了基线水平。

在记录中找出原始数据基线明显偏离设定基线的位置。通过选择偏离区域内的一小段基线进行校正。右键单击，然后选择“添加基线节点”命令。

当记录中包含偶尔出现的噪声或伪影，且无法轻易校正时，应删除这些部分，但需先将其分割为连续的片段。在要丢弃的区域之前立即进行选中，右键单击并选择“分割片段”。

随后，选中要丢弃的区段，右键单击，选择“删除”，然后按回车键以优化记录。在布局中切换到 MOD 界面。在数据展示面板中，选择一段包含封闭事件和开放事件的小片段记录。

将光标移至下方高分辨率面板中，并在选定的轨迹内高亮一个能代表基线的干净片段。将光标移至下方模型面板，右键单击代表关闭状态的黑色方块，然后选择“抓取”。通过高亮代表开放电导的部分轨迹，重复上述操作以获取通道开放状态。

在模型面板中右键单击红色方块并选择抓取。通过在数据源下方选择 SEL 按钮，对记录中选定的部分执行理想化。然后在弹出面板的建模部分下方的理想化标签上单击右键。

确认分析所需的各项参数正确无误后，点击运行。理想化结果及所选区域的幅值直方图将叠加显示在原始数据上，以便直观检查理想化效果。如有必要，可调整理想化参数以获得最佳结果并重复此步骤；如需对整个文件进行理想化处理，可在数据源下方选择“文件”按钮，对整份文件执行理想化。

然后右键单击理想化标签页并点击运行。将显示整个文件的结果。结合数据，仔细检查理想化轨迹与记录数据之间的匹配情况。

偶尔会出现被错误识别的事件，这些事件可从理想化的轨迹中排除。选择错误的事件，右键单击并选择“join IDL”。图中显示的是通过中国台湾HEK 293细胞中单个NMDA受体的钙离子电流。

采用细胞贴附式膜片钳技术，数据理想化后可生成幅度直方图，该直方图在此细胞中可很好地拟合为两个不同的电导类别。在持续施加电压的条件下，对HEK 293细胞进行贴附式记录，当通过膜片移液管施加负20毫汞柱压力时，可激活一种对压力敏感的通道。

红色虚线表示零电流水平。这些来自天然通道的记录显示了从大鼠胚胎前额叶皮层分离并培养5天或27天的神经元胞体上记录到的持续性NMDA受体活性。一旦熟练掌握，该操作可在30分钟至1小时之间完成，具体时间取决于记录的持续时长。

通过该实验步骤，还可进一步开展动力学分析和状态建模等方法，以确定离子通道的门控机制并估算反应速率。观看本视频后，您应对如何记录单个离子通道蛋白的电流以及初步分析方法有了较为清晰的理解。