Name: 单通道细胞贴附膜片钳记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 7 s
Description: 学习使用细胞贴附膜片钳技术测量单个离子通道电流的方法。该技术可实时观察通道构象变化，揭示离子通道的生物物理学特性，为理解神经元信号传导机制提供重要数据支持。

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本工作由F31NS086765（KAC）、F31NS076235（MAP）、R01 NS052669（GKP）和EIA9100012资助。&#160; 作者感谢Eileen Kasperek在分子生物学和组织培养方面的专业知识和帮助；感谢Jason Myers分享了早期前额叶皮层神经元的相关数据。&#160;

1. 细胞培养与蛋白表达
<ol>
	<li>在单层培养条件下维持HEK293细胞（ATCC编号CRL-1573），传代次数控制在22至40代之间（包括ATCC进行的传代），使用添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素混合液的DMEM培养基，在5% CO2、37 °C条件下培养。实验间期，将细胞以5-20倍稀释度传代至T25培养瓶中，终体积为10 ml。注意：在此传代范围内使用细胞可确保良好的细胞状态，有利于形成理想的封接和保持膜片稳定性。</li>
	<li>转染时，将HEK293细胞以约105个/皿的密度接种于35 mm培养皿中，相当于每皿接种约0.5-0.6 ml细胞悬液，并加入2 ml培养基培养18-24小时。</li>
	<li>在无菌的1.5 ml离心管中，按以下顺序配制可供四个35 mm培养皿使用的转染混合液：(1) 每种cDNA各1 μg（GluN1、GluN2A和GFP）；(2) 315 μl双蒸水（ddH2O）；(3) 350 μl 42 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）；(4) 逐滴加入35 μl 2.5 M CaCl2，用于形成沉淀。</li>
	<li>涡旋振荡管子5秒，然后将175 μl转染混合液分别加入前一天接种的四个35 mm培养皿中（此时细胞融合度约为50-60%），在37 °C孵育2小时。</li>
	<li>吸除转染液，用PBS洗涤一次，更换为含2 mM MgCl2的2 ml生长培养基，以防止NMDA受体介导的兴奋性毒性9。注意：转染后24-48小时可进行电生理记录。</li>
</ol>
2. 电极制备
<ol>
	<li>使用垂直拉制仪拉制硼硅酸盐玻璃管，制备2个对称的记录电极。根据所得尖端的大小和几何形状，进一步使用抛光仪修整电极。注意：尖端尺寸可通过视觉和电学方法评估。视觉上，外径应在1.4–5.6 μm范围内。电学上，当充满细胞外溶液时，理想尺寸的尖端应产生12–24 MΩ范围内的电阻（见图2B）。</li>
	<li>使用一种灌注液，对于细胞贴附式实验，该溶液应模拟可产生最大通道活性和高电流幅度的细胞外环境。注意：对于NMDA受体，该溶液应包含饱和浓度的激动剂（谷氨酸和甘氨酸）、1 mM EDTA（用于螯合二价阳离子抑制剂和阻断剂），并以生理浓度的钠离子（150 mM）作为唯一的通透性离子（单位为mM：1 谷氨酸、0.1 甘氨酸、150 NaCl、2.5 KCl、1 EDTA 和 10 HEPBS，用1 N NaOH调节pH至8.0）。</li>
</ol>
3. 细胞贴附式膜片钳记录
<ol>
	<li>打开 QuB 数据采集软件（www.qub.buffalo.edu），在“layout”下选择采集窗口。通过点击“File”下拉菜单中的“New Data”创建一个新的 QuB 数据文件（QDF），并输入以下初始参数：采样率 40 kHz；A/D 缩放 3,000；输出通道 1；A/D 数据大小 2。通过右键点击数据文件，选择“properties”，然后点击“data”选项卡，将幅度缩放调整为 0.1 V/pA。注意：这些参数可使用细胞贴附模式下的模型细胞针对每个实验系统进行优化。有关使用 QuB 软件进行数据采集及 QDF 属性的更多说明，请访问 www.qub.buffalo.edu。</li>
	<li>选择一个含有表达离子通道细胞的 35 mm 培养皿，将培养基替换为含钙和镁的 2 ml PBS；将培养皿安装到显微镜载物台上，使用相差显微镜聚焦细胞区域，以评估细胞健康且以单层形式牢固贴附于培养皿（图 1A）。切换至荧光检测以确认转染成功（图 1B）。注意：荧光强度的范围可作为蛋白表达水平的粗略指标。</li>
	<li>进行单通道记录时，将放大器输出增益设为 ×10，补丁配置设为 β = 1，模拟滤波器设为 10 kHz，模式设为电压钳，施加电压设为 +100 mV。在电压保持命令处于“OFF”位置时，选择“seal test”按钮。</li>
	<li>根据荧光强度和细胞健康状况选择待补丁的细胞。在相差显微镜下确认细胞牢固贴附于培养皿，细胞表面有较大区域暴露可用于补丁，并且整体形态健康。注意：在接近和进行膜片钳操作期间，应保持相差照明，以避免细胞荧光漂白。</li>
	<li>用一支新抛光的移液管吸取适量溶液，使其刚好接触电极，并轻轻摇动以排除可能滞留在尖端的气泡。通过拧紧移液管夹的密封螺丝，将记录移液管固定在放大器头架上，并确保银丝浸入移液管溶液中。</li>
	<li>使用一个小型（5 cc）塑料注射器，通过连接管路与移液管夹相连，轻轻施加正压，以防止杂质进入并在接近过程中堵塞移液管尖端（图 2A）。</li>
	<li>使用显微操作器将移液管导入浴液，并将其定位在选定用于补丁的细胞正上方（图 1C），以闭合电路。注意示波器上的信号，应显示一个矩形波形，对应放大器的封接测试信号（图 2B）。注意：移液管进入浴液后，其电阻在理想范围内为 12–24 MΩ。对于 5 mV 的测试信号，测得的电流范围约为 20–40 pA。</li>
	<li>在通过显微镜目视监测移液管位置的同时，通过示波器电学监测移液管电阻，逐步微调接近，直至移液管轻轻接触细胞，测试信号略有下降，表明电阻增加（图 2B）。</li>
	<li>为形成封接，拿起注射器，通过拉动注射器活塞，经侧向管路施加轻微负压，使细胞膜被吸入记录移液管尖端，从而启动 GΩ 级电阻封接的形成10。注意观察示波器上的测试信号波形，封接形成时波形完全变平，仅可见电容瞬变（图 2B）。注意：若信号未完全变平或基线变嘈杂，表明封接较弱，存在显著的电流泄漏。这将导致无法分辨单个通道电流。若出现此情况，应将移液管从细胞上撤回并移出浴液，从头架上取下并丢弃。使用新抛光的移液管重复操作，直至获得足够质量的封接（≥ 1 GΩ）。</li>
	<li>在放大器上，将外部命令开关从“seal test”切换至“off”；将电压保持命令切换至“正”（此前设为“off”）；并将增益提高至 ×100。在示波器上观察通道活动，若存在活动，将显示为从先前平坦基线上出现的方形向上偏转（图 2C）。</li>
	<li>若示波器上显示通道活动，通过按下“play”按钮，随后按下“record”按钮，将数据采集至此前打开的 QuB 数字文件中。要停止数据采集，按下 QuB 中的停止按钮，并通过“File”下拉菜单中的“Save Data As…”将 QDF 文件保存至计算机硬盘上易于检索的位置。</li>
</ol>
4. 数据预处理与理想化
注意：通过统计分析可以从单通道记录中提取重要信息，该分析将每个数据点分配到适当的电导类别（在最简单的情况下，为关闭或开放状态）。此过程称为数据理想化，以下简要描述在 QuB 中使用分段 k 均值（SKM）方法11进行数据理想化的过程。
<ol>
	<li>在 QuB 中打开数据文件，并在“Layout”下的“Pre”界面中查看电流轨迹。通过取消勾选标有“Fc.”的复选框，显示未经过数字滤波的原始记录数据。</li>
	<li>目视检查记录以发现异常和伪迹（图4A）。对于轨迹中出现的短暂电流尖峰（图4A），可通过选择同一电导水平下相邻的干净区域，高亮该区域，右键并选择“set erase buffer”进行校正。放大尖峰至可分辨单个采样点，选中需替换的区域，仅高亮该部分后右键选择“erase”进行擦除。</li>
	<li>通过选择记录早期基线稳定的区域，高亮后右键选择“set baseline”，为整段记录定义零电流基线。请验证出现的参考线是否准确代表基线水平（在 图4B 中以紫色显示）。</li>
	<li>识别原始数据基线明显偏离所设基线的区域。通过在偏离区域内选择一小段基线，右键并选择“add a baseline node”命令进行校正。</li>
	<li>识别记录中包含过多噪声或无法轻易校正的伪迹区域（图4C）。高亮需删除的区域，右键并选择“delete”。注意：此操作将导致动力学信息丢失：处理后的记录会变短，拼接点之后的数据点将看似与噪声前区域连续。</li>
	<li>使用 SKM 算法11对记录进行理想化处理时，首先高亮轨迹中包含开放和关闭事件的部分，进入“Layout”下的“Mod”界面。在“model”面板中，高亮一段能代表整个文件基线的干净轨迹区域，右键黑色方块（关闭态）并选择“grab”。对通道开放事件，高亮开放电导区域，右键“model”面板中的红色方块并选择“grab”。</li>
	<li>通过在“Data Source”下的“File”按钮中选择整个记录进行理想化处理。右键“Modeling”部分下方的“Idealize”标签，确认分析所需参数设置正确，然后点击“Run”。理想化结果以及整段文件的幅度直方图将叠加在原始数据上，以便直观检查理想化效果（图5）。注意：理想化不充分可能导致生成“假事件”，即 QuB 检测到并未真实发生的通道开闭事件。在由放大器模拟滤波器和采样率决定的记录分辨率范围内，SKM 检测开/闭事件的分辨率可通过设置分析的“dead time”进行控制。最佳 dead time 需通过试错法确定，且依赖于采样率，但通常的经验法则是选择 2–3 个采样点的 dead time12。</li>
	<li>为验证理想化结果是否准确反映原始数据，需手动扫描理想化轨迹。若发现理想化错误，高亮假事件所在轨迹段，右键并选择“Join Idl”。注意：有关 QuB 中各项命令和功能的更多选项及详细说明，请参阅 QuB 在线手册（www.qub.buffalo.edu）。</li>
</ol>

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260, 799-802 (1976).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Piccolino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+electricity+and+the+birth+of+electrophysiology%3A+the+legacy+of+Luigi+Galvani%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Animal electricity and the birth of electrophysiology: the legacy of Luigi Galvani.</a> Brain Research Bulletin. 46, 381-407 (1998).</li>
<li>Albright, T. D., Jessell, T. M., Kandel, E. R., Posner, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Science%3A+A+Century+of+Progress+and+the+Mysteries+that+Remain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural Science: A Century of Progress and the Mysteries that Remain.</a> Neuron. 25, (2000).</li>
<li>Popescu, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modes+of+glutamate+receptor+gating%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modes of glutamate receptor gating.</a> The Journal of Physiology. 590, 73-91 (2012).</li>
<li>Morimoto-Tomita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoinactivation+of+Neuronal+AMPA+Receptors+via+Glutamate-Regulated+TARP+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Autoinactivation of Neuronal AMPA Receptors via Glutamate-Regulated TARP Interaction.</a> Neuron. 61, 101-112 (2009).</li>
<li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).</li>
<li>Huang, Z., Li, G., Pei, W., Sosa, L. A., Niu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+protein+expression+in+single+HEK+293+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhancing protein expression in single HEK 293 cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 142, 159-166 (2005).</li>
<li>Raymond, L. A., Moshaver, A., Tingley, W. G., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptor+ion+channel+properties+predict+vulnerability+to+cytotoxicity+in+a+transfected+nonneuronal+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptor ion channel properties predict vulnerability to cytotoxicity in a transfected nonneuronal cell line.</a> Mol Cell Neurosci. 7, 102-115 (1996).</li>
<li>Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysics+and+Structure+of+the+Patch+and+the+Gigaseal%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal.</a> Biophysical Journal. 97, 738-747 (2009).</li>
<li>Qin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+single-channel+currents+using+the+segmental+k-means+method+based+on+hidden+Markov+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Restoration of single-channel currents using the segmental k-means method based on hidden Markov modeling.</a> Biophys J. 86, 1488-1501 (2004).</li>
<li>Colquhoun, D., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aColquhoun%2C+D+%22chapter+in+Single-channel+recording.+2nd+edn+eds+B.+Sakmann+and+E+Neher%22">chapter in Single-channel recording. 2nd edn eds B. Sakmann and E Neher</a>. , Plenum Press. (1995).</li>
<li>Popescu, G., Auerbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modal+gating+of+NMDA+receptors+and+the+shape+of+their+synaptic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Modal gating of NMDA receptors and the shape of their synaptic response.</a> Nat Neurosci. 6, 476-483 (2003).</li>
<li>Colquhoun, D., Hawkes, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+properties+of+ion+channel+openings+and+bursts+in+a+membrane+patch+that+contains+two+channels%3A+evidence+concerning+the+number+of+channels+present+when+a+record+containing+only+single+openings+is+observed%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Stochastic properties of ion channel openings and bursts in a membrane patch that contains two channels: evidence concerning the number of channels present when a record containing only single openings is observed.</a> Proc R Soc Lond B Biol Sci. 240, 453-477 (1990).</li>
<li>Kussius, C. L., Kaur, N., Popescu, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnanolone+Sulfate+Promotes+Desensitization+of+Activated+NMDA+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pregnanolone Sulfate Promotes Desensitization of Activated NMDA Receptors.</a> J. Neurosci. 29, 6819-6827 (2009).</li>
<li>Amico-Ruvio, S., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stationary+gating+of+GluN1%2FGluN2B+receptors+in+intact+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Stationary gating of GluN1/GluN2B receptors in intact membrane patches.</a> Biophysical Journal. 98, 1160-1169 (2010).</li>
<li>Borschel, W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+reaction+mechanism+of+neuronal+NMDA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Gating reaction mechanism of neuronal NMDA receptors.</a> J Neurophysiol. 108, 3105-3115 (2012).</li>
<li>Colquhoun, D., Hatton, C. J., Hawkes, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quality+of+maximum+likelihood+estimates+of+ion+channel+rate+constants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The quality of maximum likelihood estimates of ion channel rate constants.</a> The Journal of Physiology. 547, 699-728 (2003).</li>
<li>Kussius, C. L., Kaur, N., Popescu, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnanolone+Sulfate+Promotes+Desensitization+of+Activated+NMDA+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pregnanolone Sulfate Promotes Desensitization of Activated NMDA Receptors.</a> The Journal of Neuroscience. 29, 6819-6827 (2009).</li>
<li>Popescu, G., Auerbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modal+gating+of+NMDA+receptors+and+the+shape+of+their+synaptic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Modal gating of NMDA receptors and the shape of their synaptic response.</a> Nat Neurosci. 6, 476-483 (2003).</li>
<li>Popescu, G., Robert, A., Howe, J. R., Auerbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+mechanism+determines+NMDA+receptor+response+to+repetitive+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reaction mechanism determines NMDA receptor response to repetitive stimulation.</a> Nature. 430, 790-793 (2004).</li>
<li>Prieto, M. L., Wollmuth, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+Modes+in+AMPA+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gating Modes in AMPA Receptors.</a> The Journal of Neuroscience. 30, 4449-4459 (2010).</li>
<li>Poon, K., Nowak, L. M., Oswald, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+Single-Channel+Behavior+of+GluA3+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterizing Single-Channel Behavior of GluA3 Receptors.</a> Biophysical Journal. 99, 1437-1446 (2010).</li>
<li>Smith, T. C., Wang, L. -Y., Howe, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+Conductance+Levels+of+Native+AMPA+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous Conductance Levels of Native AMPA Receptors.</a> The Journal of Neuroscience. 20, 2073-2085 (2000).</li>
<li>Coste, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo1+and+Piezo2+Are+Essential+Components+of+Distinct+Mechanically+Activated+Cation+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Piezo1 and Piezo2 Are Essential Components of Distinct Mechanically Activated Cation Channels.</a> Science. 330, 55-60 (2010).</li>
<li>Coste, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo+proteins+are+pore-forming+subunits+of+mechanically+activated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Piezo proteins are pore-forming subunits of mechanically activated channels.</a> Nature. 483, 176-181 (2012).</li>
<li>Benndorf, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenndorf%2C+K+%22chapter+in+Single-channel+recording.+2nd+edn+eds+B.+Sakmann+and+E+Neher%22">chapter in Single-channel recording. 2nd edn eds B. Sakmann and E Neher</a>. , Plenum Press. (1995).</li>
</ol>

本文作者声明不存在任何竞争性财务利益。

在离子通道研究领域，一个重要的研究方向是阐明导致通道开放或通道门控机制的一系列事件。对于大多数通道而言，这一过程十分复杂，涉及多个动力学步骤，而这些步骤无法从宏观的多通道信号中推导得出。相比之下，通过设计实验观察单通道记录中开放/关闭事件的序列，可以获得关于门控机制的更详细信息。本文所述方法利用了NMDA受体所具有的胞外配体结合域，从而可在恒定条件下进行微创的膜片钳记录。根据配体和受体的特性，该方案可能需要适当调整，方可适用于其他配体门控离子通道的研究。
单通道活性记录提供了两类有价值的信息。首先，由于可以直 接测量单通道电流幅度，因此可设计实验以获取有关孔道特性的信息，例如通道电导、通透性和选择性。其次，由于开放和关闭事件的持续时间也可从记录中直接测量，因此可设计实验以获得有关门控行为的动力学信息，从而推断通道的操作机制。对于这两类实验，有意义的统计分析都需要将电流轨迹中的每个单独数据点归类到特定的电导类别中。本文介绍了一种实现该目的的方法，即使用分段k-均值（SKM）11算法，但也可通过其他多种复杂程度不同的算法实现，包括半阈值法、SCAN12<...

生物膜之间的快速通讯几乎完全依赖于寡聚孔道形成膜蛋白，这类蛋白通常被称为通道。这些蛋白在激活信号、门控机制和电导特性方面存在广泛差异。其孔道对离子具有选择性的通道蛋白被归类为离子通道；它们的激活会在膜上产生离子电流，且其反应可通过电生理技术以高分辨率实时记录。激活信号涵盖多种化学和物理输入，包括浓度梯度、机械力和电场力以及温度，因此可将离子通道进一步分类为配体门控型、机械敏感型、电压门控型或热敏感型。本文描述了使用膜片钳技术记录两种通道单通道活性的实验方案：一种是配体门控通道NMDA受体，另一种是机械敏感通道PIEZO1。&#160;
膜片钳电生理学是首个且应用最广泛的实验方法，其灵敏度足以实现对单个分子的观测1,2。除了这种极高的灵敏度外，该方法还极大地拓展了适用于电生理记录的生物样本范围，并使得在完整膜结构中观察离子通道成为可能。首先，由于电压钳制和电流记录均由同一电极完成，因此该技术可用于记录小细胞或膜片上的信号。该技术揭示，离子通道不仅存在于青蛙肌肉、电鳗电板或鱿鱼巨大轴突等可兴奋膜中3,4，更广泛存在于单细胞或多细胞生物的所有类型细胞膜中，包括细胞内膜系统，是跨膜信号转导机制中普遍存在的基本组分。尤为重要的是，仅需将玻璃微电极贴附于完整细胞表面即可记录跨膜电流，这为在天然、未受干扰的膜环境中记录离子通道活性提供了前所未有的机会。因此，本实验方案所描述的细胞贴附式膜片钳技术，能够在离子通道的天然环境中持续监测其活性达数十分钟甚至更长时间。
在正常的热涨落条件下，所有蛋白质（包括离子通道蛋白）都会在较宽的时间尺度上发生结构变化，其中最快且最频繁的重排最可能表现为侧链运动，而较慢且较少发生的改变则表现为整个结构域或亚基的重新定位，或在某些情况下表现为翻译后修饰或蛋白质-蛋白质相互作用5,6。观察单个分子产生的长时间活性有助于理解完整生理膜中离子通道的功能动力学，并为所观察分子的操作机制提供有价值的信息。&#160;
与目前对不同细胞类型和发育阶段中离子通道多样性的日益深入理解相比，关于天然细胞膜中离子通道分子组成的知识仍然有限。所有离子通道均为多聚体蛋白，且大多数天然离子通道由多种亚基组装而成，从而产生分子多样性广泛的蛋白质，这通常伴随着不同的电导和门控特性。因此，具有明确分子组成的离子通道通常通过在异源表达系统中进行表达来研究。特别是HEK293细胞——一种永生化的人胚胎肾细胞的克隆系7，已被广泛接受为表达重组离子通道的首选系统。将&#160;HEK293细胞作为离子通道电生理学研究的首选系统，其诸多优势包括培养和维持长期稳定细胞系的简便性与低成本，其具备对哺乳动物蛋白进行翻译后折叠、加工和转运的能力，以及在许多情况下，其对目标通道的内源性表达水平极低甚至完全缺失7,8。在HEK293细胞中表达重组离子通道并研究其功能特性，仍是获取离子通道结构-功能关系信息、特定离子通道亚型特性及其在天然组织中作用的重要方法。本文所述的实验方案既适用于在HEK293细胞中表达的重组离子通道，也适用于天然离子通道。
总之，膜片钳技术凭借其无与伦比的单分子信号分辨能力，至今仍是观察单个分子行为的最直接方法。在细胞附着模式下，膜片钳记录可实现长时间的观测，若用于单个分子，可为离子通道的功能机制提供极为深入的见解。以下介绍一种从含有单个离子通道蛋白的细胞附着式膜片上获得高分辨率电流记录的实验方案。

<table><tbody><tr><td>化学试剂</td><td>Sigma</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃</td><td>Sutter</td><td>BF-150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>明场倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td>1x51</td><td>Nikon 也提供类似显微镜</td></tr><tr><td>荧光光源箱</td><td>X-cite</td><td>Series 120</td><td></td></tr><tr><td>液体光导管</td><td>X-cite</td><td>OEX-LG15</td><td></td></tr><tr><td>微操纵器</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>示波器</td><td>Tektronix</td><td>TDS1001</td><td></td></tr><tr><td>放大器</td><td>Molecular Devices</td><td>Axon Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>防震台</td><td>TMC</td><td>63561</td><td></td></tr><tr><td>NIDAQ 数据采集卡</td><td>National Instruments</td><td>776844-01</td><td></td></tr><tr><td>拉针仪</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>电极抛光仪</td><td>Narishige</td><td>Microforge MF-830</td><td></td></tr><tr><td>法拉第屏蔽笼</td><td>TMC</td><td>8133306</td><td></td></tr><tr><td>高速压力钳</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>ALA HSPC</td><td></td></tr><tr><td>压力/真空泵</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>ALA PV-PUMP</td><td>用于 HSPC-1</td></tr></tbody></table>

单通道细胞贴附式膜片钳记录

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

离子通道蛋白是生物膜间快速通讯的通用装置。它们所产生的离子流的时间特征取决于每个通道蛋白的内在特性，以及其产生和调控的机制，这是当前研究的重要领域。通过观察单个分子产生的长时间电流，可以获得有关离子通道蛋白运作动态的信息。本文描述了一种获得单通道细胞贴附式膜片钳电流记录的方案，用于在HEK293细胞中异源表达或在皮层神经元中天然表达的配体门控离子通道——NMDA受体。此外，还提供了如何将该方法应用于其他感兴趣离子通道的指导，以机械敏感性通道PIEZO1为例进行了说明。该方法可提供有关通道电导特性及其激活机制中开-闭构象变化的时间序列数据，从而有助于理解这些通道在健康与疾病状态下的功能。

重组NMDA受体
NMDA受体结合并响应两种共激动剂的协同作用：谷氨酸和甘氨酸。它们由两个结合甘氨酸的GluN1亚基和两个结合谷氨酸的GluN2亚基组装成异源四聚体。GluN2亚基由四个基因（A-D）编码，其中在脑组织中转录最广泛的亚型为成年动物中的GluN2A和幼年动物中的GluN2B。由于天然样本中NMDA受体亚型具有多样性，在HEK293细胞中表达受体（图1A）可实现对亚基组成的控制，同时也能够使用精细抛光的玻璃移液管记录通道电流（图1C）。
当移液管接触到细胞时，测试脉冲波形的幅度会明显降低（图2B），表明已具备形成封接的能力。一个包含单个通道的良好封接会产生清晰的通道活动，表现为基线向下的偏转，在施加正电压时具有良好的信噪比（图2C）。当两种激动剂均以高浓度存在，且无抑制剂和通道阻断剂时，可实现野生型重组NMDA受体的最大通道活性。这种条件较为理想，...

本文介绍了一种利用细胞贴附式膜片钳技术，从单个离子通道获得长时间电流记录的操作步骤。该方法能够实时观察离子通道开闭构象变化的模式，从而揭示生物信号产生的基础。这些数据可提供关于未受干扰的生物膜中离子通道特性的信息。

离子通道蛋白是生物膜间快速通讯的通用装置。它们所产生的离子流具有特定的时间特征……

本实验的总体目标是测量单个离子通道中的电流传导。首先，将目标离子通道在易于操作且适合实验目的的细胞中进行异源表达。第二步，使用火焰抛光的玻璃微电极在细胞膜上形成稳定的封接。接下来，实验人员应确定膜片中存在的通道数量，若为单通道记录电流，则最后一步是对数据进行处理和分析。最终，通过记录单个离子通道的电流，可用于研究这些膜蛋白发挥作用的生物物理特性，这是神经元及其他可兴奋细胞间通信机制的基础。与能够测量多个活性离子通道电流的方法相比，该方法的优势在于，通过单个离子通道的电流测量，可直观地区分并观察特定通道所固有的多种响应模式。该方法可用于解答神经科学领域中的关键问题，例如生理性和治疗性调节剂如何影响神经元之间的通讯。通常，初次接触该技术的研究人员会遇到困难，因为很难获得仅包含单一离子通道且噪声较低的记录。初次尝试该方法时，观察他人实际操作非常有帮助，因为要形成真正稳定的封接（这是该方法中最重要的步骤），必须以特定角度轻柔地接近细胞，而最重要的是，操作者必须具备足够的耐心。在进行转染前需做好充分准备。提前一天将HEK 293细胞接种于35毫米培养皿中，使其在无菌条件下达到50%至60%的融合度。配制转染混合液：加入1微克目标cDNA、315微升双蒸水和350微升42毫摩尔的HEPES。最后，逐滴加入35微升氯化钙以形成沉淀。涡旋混匀试管5秒，然后向四个培养皿中每个加入175微升转染悬浮液。前一天已接种。将细胞在37摄氏度下孵育两小时。孵育结束后，移除培养基，并用PBS洗涤。接着加入2毫升生长培养基，其中添加2毫摩尔的氯化镁，以防止MDA受体介导的兴奋性毒性。首先，使用垂直拉制仪从硼硅酸盐玻璃管中拉制两根对称的记录电极。接着，需进行火焰抛光，以获得合适的直径和阻抗。然后，打开 QUB 数据采集软件并选择采集窗口，完成记录前的设置。在布局界面下，通过点击“新建数据”打开一个新的 QUB 数据文件，并输入将要使用的实验参数。通过右键点击数据文件，选择“属性”，然后点击“数据”选项卡，将幅度缩放调整为每皮安 0.1 伏特。用含有钙和镁的两毫升 PBS 替换培养基后，将细胞培养皿安装到显微镜载物台上。使用相差显微镜观察细胞区域，以评估细胞状态是否健康，并确认细胞以单层形式良好贴附于培养皿表面。随后切换至荧光检测模式，以验证转染是否成功。接下来，设置单通道记录的参数。将模式设为电压钳制，并通过电压钳制指令将施加电压设为正100毫伏。在关闭位置，根据荧光和整体外观选择封接测试按钮。选择一个细胞进行膜片钳记录，在相差显微镜下确认该细胞已牢固贴附于培养皿表面，具有较大面积的细胞膜暴露，适合进行膜片钳操作，且整体形态健康。用适合NMDA受体和细胞贴附式记录实验的溶液填充一支新抛光的玻璃微电极，并轻轻弹动以排除任何气泡。将记录电极固定在放大器的电极架上，并确保银丝电极浸入微电极溶液中，以防止浴液进入电极内部。接近过程中，使用连接至移液管固定器的小型塑料注射器轻轻施加正压。接着，利用显微操作器将移液管导入浴液中。闭合电路后，将移液管定位在选定进行膜片钳记录的细胞正上方。进入浴液时请注意示波器上的信号。在显微镜下目视观察移液管位置的同时，通过示波器监测其电阻值，确保移液管电阻处于最佳范围内。以微小步进继续推进，直至移液管轻轻接触细胞。测试信号会略微下降，表明电阻增加。为了形成封接，拿起注射器，通过侧管轻轻施加轻微的负压。通过拉动注射器活塞，当示波器上的测试信号波形完全变平时，表明封接已形成。在放大器上，将外部指令开关从封接测试切换至关闭。将电压钳制指令从关闭切换至正向，并将增益从10倍提高至100倍。在示波器上观察通道活性，如果存在活性，将显示为从先前平坦基线向下的方形偏转。若示波器上显示出通道活性，开始采集数据：在 QUB 中按下播放按钮，随后按下记录按钮，将数据存入先前打开的数字文件中。要停止数据采集，请在 QUB 中按下停止按钮，并保存 QDF 文件。信号未能完全变平，或基线变得嘈杂且不稳定，可能提示封接较弱。在此情况下，移除并丢弃移液管，使用新的移液管重复上述步骤，直至获得足够的封接。要开始数据分析过程，请在 QUB 中打开记录的数据文件，并在预界面下的布局中检查电流轨迹。取消勾选标有 fc 的复选框，移除数字滤波器，以全带宽显示记录的轨迹。目视扫描轨迹，查找不规则现象和伪迹。可通过选中相同电导类别中相邻的干净区域来校正电流尖峰。右键单击并选择“设置擦除缓冲区”，然后放大峰直至可观察到单个采样点。通过仅高亮显示待替换区域来选中该区域。右键单击并选择“擦除”，以校正整个记录的基线。通过选择记录中基线稳定的早期部分来定义零电流基线。选中后右键单击，选择“设置基线”。当基准线出现时，通过目视检查确认其准确反映了基线水平。在记录中找出原始数据基线明显偏离设定基线的位置。通过选择偏离区域内的一小段基线进行校正，右键单击并选择“添加基线节点”命令。当记录中偶尔出现无法轻易校正的噪声或伪迹时，应删除这些部分，但需先将其分割为连续的片段。在要删除的区域之前立即进行选中，右键单击并选择“分割片段”。随后，选中要丢弃的区段，右键单击，选择“删除”，然后按 Enter 键以优化记录。在布局中切换到 MOD 界面。在数据展示面板中，选择一段包含封闭事件和开放事件的小片段记录。将光标移至下方高分辨率面板中，并在选定的轨迹内高亮显示一段代表基线的干净片段。将光标移至下方模型面板，右键单击代表关闭状态的黑色方块，然后选择“抓取”。通过高亮显示代表开放电导的部分轨迹，重复上述操作以获取通道开放状态。在模型面板中右键单击红色方块，然后选择抓取。通过在数据源下方选择 SEL 按钮，对记录中选定的部分执行理想化处理。然后在弹出面板的建模部分下方的理想化标签上单击右键。确认分析所需的参数设置正确，然后点击运行。理想化结果及所选区段的幅度直方图将叠加在原始数据上，以便直观检查理想化效果。如有必要，调整理想化参数以获得最佳结果并重复操作；如需对整个文件进行理想化处理，请在数据源下方选择文件按钮。然后右键单击理想化标签页并点击运行。将显示整个文件的结果。将理想化轨迹与记录的数据叠加，仔细检查两者之间的匹配情况。偶尔会出现被错误识别的事件，这些事件可从理想化的轨迹中排除。选择错误的事件，右键单击并选择“Join IDL”。图中显示的是通过中国台湾HEK 293细胞中单个NMDA受体的钙离子电流。采用细胞贴附式膜片钳技术，数据理想化后可生成幅度直方图，该直方图在该细胞中可很好地拟合为两个不同的电导类别。在持续施加电压条件下，对HEK 293细胞进行贴附记录，负20毫毫米汞柱压力通过膜片移液管激活了一种对汞敏感的通道。红色虚线表示零电流水平。这些来自天然通道的记录显示了从大鼠胚胎前额叶皮层分离并培养5天或27天的神经元胞体上记录到的持续性NMDA受体活性。一旦熟练掌握，该操作可在30分钟至1小时之间完成，具体时间取决于记录的持续时长。通过该实验步骤，还可以进一步开展动力学分析和状态建模等方法，以确定通道的门控机制并估算反应速率。观看本视频后，您应对如何记录单个离子通道蛋白的电流以及如何开始分析这些电流具有较为清晰的理解。

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科研

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生物学

单通道细胞贴附膜片钳记录

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在非洲爪蟾卵母细胞中表达的离子通道的膜片钳记录

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记录人T淋巴细胞中钙释放激活钙（CRAC）电流的全细胞电生理技术

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脑片中的全细胞膜片钳记录

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全细胞膜片钳记录法用于光敏通道蛋白离子选择性的电生理测定

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巨囊突触膜电容记录的膜片钳方法

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