一种透化方法 果蝇 用于小分子活性检测的胚胎

以下实验的总体目标是制备具有可渗透卵壳的活性果蝇胚胎，以检测引入的小分子药物或毒素的生物活性。该目标首先通过使用稀释的次氯酸钠处理处于特定发育阶段的胚胎，以去除其外部的绒毛膜卵壳层来实现。第二步是用一种溶剂对胚胎进行通透处理，该溶剂可去除阻碍小分子溶质进入的薄蜡质卵壳层。

第三步是用药物或毒素以及染料处理胚胎，以同时评估卵壳的通透性并引入感兴趣的化合物。经过进一步发育后，可直接对胚胎进行成像，或进行免疫组织化学处理。最终，通过荧光显微镜结合免疫试剂或活体染料，结果可显示药物或毒素对组织发育的影响。

今天我将介绍我们用于果蝇胚胎透化的研究方法，以检测小分子活性。与现有方法（例如使用庚烷等传统有机溶剂进行透化处理）相比，本技术的主要优势在于，我们的胚胎透化溶剂（EPS）可与水混溶，且相对无毒。

这些特性有助于胚胎处理，其中溶剂暴露可以更精确地控制，并且可以在生理相关的培养基中进行，这两点均能提高胚胎的存活率。我最初产生这一方法的想法，是在思考如何去除卵壳蜡质层时。作为一名滑雪爱好者，我联想到人们常用柑橘类溶剂去除滑雪板底部残留的蜡。

这促使我将该应用转移到果蝇胚胎卵壳上，经过多次尝试与错误，最终解析了EPS的组成。准备至少含有500只所需品系的性成熟果蝇的群体培养笼。培养笼中应加入10厘米高的葡萄汁，并用少量酵母糊进行通气。

每天更换这些培养皿两次。几天后，果蝇将适应培养环境，产卵更加规律。EPS 由表面活性剂和限量溶剂溶液配制而成，可保存两个月。

在室温保存时，配制新鲜EPS时需将表面活性剂加热至37摄氏度。用于EPS处理的胚胎需使用由3厘米长、50毫升聚丙烯管和粗糙尼龙网制成的篮子进行操作。在后续发育步骤中，塑料边缘更容易与尼龙网熔合。也可使用50毫升离心管盖子制作的篮子来操作胚胎。

将盖子钻孔并切出缺口，通过盖子与管子之间的螺纹固定筛网。或者，使用自制的载片腔室，并用一片透氧膜覆盖开口，再用固定环将膜压紧，以收集胚胎。

早上在培养物上放置一个带有酵母糊的新鲜葡萄培养皿。一小时后，更换培养皿，并丢弃第一次收集的培养皿。让第二个培养皿在25摄氏度下收集胚胎两小时。

然后收集培养板并转移至18摄氏度环境中，让胚胎发育至所需阶段。当胚胎准备就绪后，在进行EPS处理前对其进行脱壳处理。

用水和画笔将它们从培养皿冲洗到研磨篮中。第二步，用轻柔的流动水冲洗，以去除任何残渣。第三步，将其浸入50%的次氯酸钠溶液中两分钟，并定期搅动溶液以确保充分接触。

然后立即用流动的水将它们冲洗干净。现在，将六个 60 毫米的培养皿中各加入 10 毫升 PBS，作为浸泡液，并在 MBIM 中将 EPS 原液做 1:40 稀释，涡旋混匀。将形成白色乳状液，用纸巾吸去网状篮底部多余的水分，然后将胚胎浸入 EPS 稀释液中，并持续涡旋震荡。

将胚胎在 EPS 中轻轻涡旋 30 秒后，取出胚胎并吸去多余的溶液。随后将篮子依次移入六个 PBS 洗涤液中，轻轻冲洗以完成洗涤，接着进行染料和药物处理。优化胚胎的通透性和活性是本实验方案中最关键且最具挑战性的步骤。

通透性对胚胎发育阶段较为敏感。胚胎老化处理的温度以及不同果蝇品系间的条件可能存在较大差异。EPS的稀释比例和处理时间的最佳参数需通过实验经验确定。

首先，在微量离心管中制备50微摩尔的科幻羧酸染料在M-B-I-M-T中的溶液，一毫升即可。此时可加入毒素或药物以进行急性处理，涡旋混匀。用画笔将已通透的胚胎从筛篮转移至微量离心管中。

盖上管盖并颠倒混匀数次。随后将管子放入诱变仪中，孵育15分钟。胚胎沉降后，用移液器吸除染料，并加入1毫升M-B-I-M-T进行洗涤。Resus。

将胚胎悬浮，静置使其沉淀，然后更换 M-B-I-M-T。重复此操作第三和第四次。完成第四次洗涤后，移除全部 M-B-I-M-T，并将胚胎转移至发育篮中，以进行长时间的发育培养。

首先准备用于发育的篮子，用70%乙醇冲洗，然后用去离子水冲洗，并用实验室擦拭纸吸干水分。完成后，将篮子转移至含有六毫升孵育培养基的60毫米培养皿中，培养基中需包含所需药物或毒素。

用毛笔将胚胎转移到篮子中的网格上，轻轻滴加培养液使胚胎落下，并将胚胎分散成单层。注意避免在网格下截留气泡。若使用载玻片腔室，需先准备好腔室，将腔室倒置，在开口边缘涂一圈薄薄的真空脂。

接下来，在开口内的膜表面加入150微升所需培养基。现在，使用画笔将胚胎转移至培养基中，并在膜上分散均匀。最后放置一个25毫米的圆形盖玻片，使培养基展平。

在边缘处施加轻微压力以确保密封。在18摄氏度条件下培养胚胎对其在发育后期被EPS通透并摄取染料的能力具有显著影响。这一点可通过在25摄氏度条件下培养的EPS处理胚胎中缺乏Rumine BD摄取来说明；此处以红色显示的sci-fi羧酸染料摄取情况，揭示了EPS处理胚胎中通常观察到的不同程度的通透性。

远红荧光染料（sci-fi dye）在发育过程中的动态分布，以及在已发育肠道内通过蓝色自发荧光观察到的卵黄区域染料聚集现象，揭示了一项用于评估胚胎存活能力的标准。该 sci-fi 染料还可用于确定胚胎在经甲醛固定和免疫染色后是否先前具有通透性。在经 EPS 处理的胚胎中，使用 sci-fi 染料与甲基汞毒素处理后，再用绿色显示的 Antifa two 标记运动神经元，以及用红色显示的 anti E lab 标记神经元胞体进行染色。

科幻染料呈假蓝色。甲基汞对对照处理胚胎中由箭头标记的神经元细胞体的排列模式产生影响。这些神经元具有更有序的束状结构，此处以白色显示的为对照处理中由箭头指示的节段性神经元的正常分支。

相比之下，甲基汞处理会改变分支模式，如实心绿色箭头所示。空心绿色箭头标示了分支发生位移的位置。一旦熟练掌握，若操作得当，该技术中的胚胎渗透处理可在大约30至40分钟内完成。

完成此操作后，可进一步对胚胎进行固定和免疫染色等其他方法，以回答更多问题，例如在发育过程中某种药物或毒素特异性作用于哪些组织。感谢您观看本操作视频，祝您在实验室中成功应用这些方法时一切顺利。