Name: 的透的一种方法果蝇胚胎用于小分子活性的测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 学习一种使果蝇胚胎卵壳通透的方法，用于测试小分子药物或毒素的生物活性。该方法通过去除外层绒毛膜和蜡质层，提高化合物渗透性，便于研究药物对组织发育的影响。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由美国国立卫生研究院/国家环境健康科学研究所（NIH/NIEHS）R03ES021581（授予 M.D.R.）以及罗切斯特大学环境健康中心（NIH/NIEHS P30 ES001247）提供资助。

1. 果蝇培养物、溶液及胚胎操作装置的准备
<ol>
	<li>准备一个笼养培养 黑腹果蝇将500只以上目标品系的交配果蝇放入带有10 cm葡萄糖琼脂平板和少量酵母糊的群体培养笼中。在25 °C、湿度可控的培养箱中维持培养。注意：&#160;笼养培养需要经过一到两天的驯化，以获得稳定的胚胎产出模式。在驯化期间，每天早晨和晚上各更换一次含酵母糊的葡萄培养板。</li>
	<li>制备 EPS。在 37 °C 下预热表面活性剂（椰油酰胺 DEA 和乙氧基化醇）溶液。用移液器将 18 ml 的 d-柠檬烯加入一个带有小型搅拌子的玻璃闪烁瓶中。再分别加入 1 ml 的两种表面活性剂（每种终浓度为 5%），充分混合后取出搅拌子。注意：该 EPS 储存液在室温下可稳定保存约 2 个月。使用前需在 37 °C 下加热并轻轻涡旋，以充分溶解表面活性剂。EPS 和 d-柠檬烯应储存于玻璃容器中，因为它们会随时间推移溶解某些塑料材料。</li>
	<li>配制胚胎去壳液、孵育培养基、染料和药物溶液。将25 ml 次氯酸钠溶液与25 ml H2O，并放入浅盘中。根据之前的配方配制改良基础孵育培养基（MBIM）和 MBIM-T1,12. 按照生产商的说明书配制Shields和Sang M3细胞培养基及PBS（见材料列表）。用DMSO配制10 mM浓度的透化染料储备液。</li>
	<li>组装胚胎操作装置和所需用品：
	<ol>
		<li>制备去卵膜和EPS处理篮（参见 图1A）。用细齿锯切下一节3 cm长的一次性50 ml聚丙烯离心管/培养管。将管段在固定于实验台表面的砂纸上摩擦，使焊接面平整。将管段边缘在火焰上熔化后，压在玻璃板上的Nitex尼龙网上进行焊接。冷却后剪去多余的网膜。注意：管壁与底部垂直，便于在相应步骤中快速且彻底地冲洗掉残留的次氯酸钠和EPS。 焊接步骤应在通风橱内进行。</li>
		<li>制备一个发育篮。将一个50 ml离心管/培养管的顶部切下，使其与管盖边缘齐平。通过在盖子中央切出一个开口，并在边缘切出若干缺口，对盖子进行移除和改造，具体如图所示。 图1B将盖子拧到网格上，并旋紧在截断的管段螺纹上，修剪多余的网格。注意：盖子边缘带有缺口，当其置于60 mm储液皿中时，可允许物质向主体培养基扩散。图1B’).</li>
		<li>准备载片腔室的组件。裁剪一块比载片腔室开口更大的DO膜。在开口内侧边缘涂抹极薄的一层真空脂。将DO膜固定于开口处，并用固定环将其压紧在真空脂上以实现密封。通过沿固定环附近剪除多余部分来修整DO膜。注意：载片腔室的规格可参见Kiehart 等13该装置尚未商业化，需通过机械加工车间定制加工。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 胚胎的分期、去膜及EPS处理
<ol>
	<li>通过定时收集对胚胎进行分期。在上午将新鲜的葡萄/酵母培养板放入果蝇培养笼中，在25 °C条件下让果蝇产卵1小时。弃去该培养板，更换为新的葡萄/酵母培养板，继续在25 °C条件下产卵2小时。收集该培养板并转移至18 °C培养箱中，以进行进一步的发育分期。注意：在25 °C下发育1小时相当于在18 °C下发育2小时。18 °C与25 °C老化处理对维持晚期胚胎EPS通透性的影响可见于 图2.</li>
	<li>脱膜。用25 °C自来水和画笔轻轻将胚胎从葡萄糖培养皿冲洗至筛网篮中。在筛网篮中用轻柔的自来水流冲洗胚胎，去除多余的酵母。将筛网篮浸入50%次氯酸钠溶液中2分钟。用自来水流彻底清洗胚胎。注意：使用塑料移液管间歇性地轻轻将次氯酸钠溶液喷洒在胚胎上。虽然通常2分钟足以完成完全脱膜，但仍需通过直接观察检查孵育时间，并据此进行调整。将脱膜后的胚胎保留在浸于自来水中的筛网篮内，并立即进入EPS步骤。</li>
	<li>EPS 处理
	<ol>
		<li>准备六个60 mm培养皿，每皿中加入约10 ml PBS。在50 ml玻璃烧杯中，通过涡旋混合将75 µl EPS溶于2.925 ml MBIM中，制备1:40稀释度的EPS溶液。注意：A&#160;该混合物形成白色乳状液。</li>
		<li>用实验室擦拭纸擦去网篮底部多余的水分。将网篮浸入烧杯中的稀释EPS溶液中，并立即轻轻旋转，使胚胎分散到网篮底部的EPS溶液中。持续旋转30秒。注意：可通过调整EPS的稀释度和处理时间来控制胚胎通透性。建议根据所使用的果蝇品系，通过实验确定最佳的EPS稀释比例和处理时间。对于12期及更晚期的胚胎，将处理时间延长至60–90秒效果更佳。</li>
		<li>取出篮子，用实验室擦拭纸吸去多余的EPS。在60 mm培养皿中用10 ml PBS进行六次连续洗涤。每次洗涤时，使用塑料移液器轻轻将PBS喷洒于胚胎上。随后进行染色和药物处理步骤。注意： EPS 可倒入水槽处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通透化胚胎的染料与药物处理
<ol>
	<li>染料处理
	<ol>
		<li>在1.5 ml微量离心管中，向1 ml MBIM-T（终浓度为50 µM）加入5 µl 10 mM CY5羧酸染料*，涡旋混匀。注：*染料的选择取决于后续分析。CY5羧酸染料适用于后续需进行固定和免疫染色的分析；罗丹明B适用于活体胚胎的分析。罗丹明B发出红色荧光，其代谢产物发出绿色荧光1，可能对后续的荧光应用造成一定干扰。可在染色液中加入药物或毒素，以在此阶段启动处理，或仅在此阶段进行脉冲式药物/毒素处理。处理和处置药物与毒素时，应严格遵循材料安全数据表（MSDS）及环境安全标准。</li>
		<li>使用画笔将胚胎从网格篮转移至染料溶液中。盖紧管盖，反复倒置，确保胚胎在染料溶液中自由悬浮。将管子置于室温下振荡摇床中孵育15分钟。</li>
		<li>从摇床上取下离心管，静置使胚胎沉降。用细口移液器吸除染料溶液，加入1 ml MBIM-T洗涤液进行清洗。轻轻颠倒离心管，充分重悬胚胎。待胚胎沉降后，再用MBIM-T重复清洗三次。最后一次清洗后彻底吸除所有MBIM-T，随后进入孵育步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚胎发育培养
	<ol>
		<li>将胚胎转移至以下两个腔室之一：发育篮或载玻片腔室。注意：对于较长的发育阶段，优先使用发育篮；若需进行后续的固定和免疫染色步骤，则必须使用发育篮。载玻片腔室适用于高分辨率的延时成像，最适合短时间的发育观察。例如，早期胚胎事件）。可在培养基中加入不同浓度的药物或毒素，利用活体胚胎实时监测胚胎发育，或采用标准的固定和免疫染色方法在终点进行观察。</li>
		<li>篮中发育
		<ol>
			<li>用70%乙醇喷洒发育篮进行清洗，再用去离子水彻底冲洗，并用实验室擦拭纸吸干。配制6 ml含有所需浓度药物或毒素的孵育培养基。将发育篮放入盛有培养基的60 mm培养皿中，注意避免网格底部滞留气泡。注：常用两种培养基：单独使用MBIM，或按50:50比例混合MBIM/M3，后者在较长时间的发育培养中效果更佳。</li>
			<li>用画笔将透化的胚胎转移至篮子底部网格表面。用周围储液槽中的培养基轻轻冲洗胚胎。用画笔将胚胎分散，使其在网格上形成单层。注意： 进行显微成像，评估样品的通透性和活力特征（见步骤4）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>载玻片培养室中的发育
		<ol>
			<li>倒置载玻片腔室，并在开口边缘涂上少量真空脂。在开口内的DO膜表面加入150 µl含有所需浓度药物或毒素的培养基。 
注：常用的培养基有两种：单独使用MBIM，或按1:1比例混合的MBIM/M3，后者在较长时间的发育培养中效果更佳。</li>
			<li>用画笔将透化的胚胎转移至含有培养基的液滴中。分散胚胎，使其沉降在液滴内的膜上。</li>
			<li>小心地将一个25 mm的圆形盖玻片覆盖在开口上，从而压平培养基。轻轻按压盖玻片边缘，使其与凡士林形成密封。注意： 进行显微成像以评估样品的通透性和活力特征（见步骤4）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 透化活体胚胎的鉴定
<ol>
	<li>鉴定已透化的胚胎。使用配备数字相机的落射荧光显微镜观察胚胎。采用固定的显微镜和相机设置，在蓝光波长下获取多个视野的图像（用于确定卵黄自发荧光的分布轮廓）。</li>
	<li>根据相对荧光强度判断胚胎的透化程度。使用具有较大工作距离的体视显微镜，以便容纳篮状装置并允许对胚胎进行操作。显微镜应配备可编程的X-Y-Z载物台、落射荧光照明系统和数字相机。成像时需仔细记录每个胚胎图像的曝光参数和载物台位置，以便在后续时间点重新评估同一组胚胎（参见图3中的代表性结果）。注意： 染料摄取的模式会因所用染料种类、暴露时间长短以及胚胎发育阶段的不同而有所差异。单次处理的样本中出现广泛的染料摄取范围是典型现象，反映了透化程度的差异。</li>
	<li>鉴定可存活胚胎。在标记透化胚胎的位置后，将胚胎继续在室温或25 °C条件下培养。将篮状装置或载玻片培养室重新放回显微镜下，通过蓝光通道荧光观察，并对先前已识别的透化胚胎采集卵黄自发荧光图像。根据卵黄分布的正常进展来评估胚胎活力（参见Rand&#160;et al.1 及图3中的代表性结果）。注意： 也可利用明场显微镜观察胚胎的其他形态学特征来评估其活力。建议针对每种使用的染料和果蝇品系，通过实验经验确定与胚胎活力相容的透化程度。</li>
	<li>在透化且具活力的胚胎中评估药物或毒素的作用效应。</li>
	<li>经上述方案处理的胚胎，在药物或毒素暴露后可适用于多种常规分析。下文讨论部分将探讨若干类型的分析方法，包括对活体胚胎进行形态发生过程的直接观察，以及固定后的免疫荧光染色分析。这两种方法均可借助活体染料（例如，GFP）加以增强，以揭示基因表达模式、细胞谱系及细胞形态特征。</li>
</ol>

<ol><li>Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+Drosophila+embryos+for+introduction+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+biochemistry+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules.</a> Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).</li>
<li>Jaeger, J., Manu,, Reinitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+blastoderm+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Drosophila blastoderm patterning.</a> Curr Opin Genet Dev. 22, 533-541 (2012).</li>
<li>Kopczynski, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+throughput+screen+to+identify+secreted+and+transmembrane+proteins+involved+in+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 9973-9978 (1998).</li>
<li>Bejsovec, A., Chao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T.+crinkled+reveals+a+new+role+for+Wingless+signaling+in+Drosophila+denticle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">T. crinkled reveals a new role for Wingless signaling in Drosophila denticle formation.</a> Development. 139, 690-698 (2012).</li>
<li>Zappe, S., Fish, M., Scott, M. P., Solgaard, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+MEMS-based+Drosophila+embryo+injection+system+for+high-throughput+RNAi+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens.</a> Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).</li>
<li>Delubac, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+with+integrated+microinjector+for+automated+Drosophila+embryo+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection.</a> Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).</li>
<li>Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+problems+for+electron+microscopy+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila+Info+Serv%22%5BJournal%5D)">Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos.</a> Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).</li>
<li>Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eggshell+of+Drosophila+melanogaster.+I.+Fine+structure+of+the+layers+and+regions+of+the+wild-type+eggshell%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell.</a> Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).</li>
<li>Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+factors+affecting+the+permeabilization+of+Drosophila+embryos+by+alkanes%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes.</a> Cryobiology. 29, 210-239 (1992).</li>
<li>Arking, R., Parente, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+RNA+inhibitors+on+the+development+of+Drosophila+embryos+permeabilized+by+a+new+technique%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+zoology%22%5BJournal%5D)">Effects of RNA inhibitors on the development of Drosophila embryos permeabilized by a new technique.</a> The Journal of experimental zoology. 212, 183-194 (1980).</li>
<li>Li, J. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+chorion+proteins+and+their+crosslinking+during+chorion+hardening+in+Aedes+aegypti+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+biochemistry+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes.</a> Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).</li>
<li>Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+staining+and+culture+of+living+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos.</a> Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).</li>
<li>Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. H. High-resolution microscopic methods for the analysis of cellular movements in Drosophila embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKiehart%2C+DP+%22Methods+in+Cell+Biology.+Drosophila+melanogaster%3A+Practical+uses+in+cell+and+molecular+biology%22">Methods in Cell Biology. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology</a>. 44, Academic Press. San Diego. 518 (1994).</li>
<li>Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPatel%2C+N+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. 44, Academic Press. 445-487 (1994).</li>
<li>Engel, G. L., Delwig, A., Rand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+methylmercury+on+Notch+signaling+during+embryonic+neural+development+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster.</a> Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).</li>
<li>Limbourg, B., Zalokar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+Drosophila+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of Drosophila eggs.</a> Developmental biology. 35, 382-387 (1973).</li>
<li>Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+reversible+drug+delivery+to+internal+tissues+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos.</a> Fly (Austin). 7, (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

上述方法概述了一种获取具有活力的Drosophila胚胎的手段，这些胚胎在广泛的发育阶段内均可接受小分子处理。该方法提出了一项新颖且简便的发现：在18 °C下对胚胎进行老化处理，可使晚期胚胎的通透性达到此前仅在早期胚胎中观察到的水平。此外，使用远红染料CY5羧酸作为通透性指示剂，在固定后的应用中已被证明有效，且不会干扰可用于揭示发育表型的传统红色和绿色荧光标记物。这些发现显著提升了EPS方法的有效性和实用性。
该方法适用于对活体和固定胚胎样本的分析。利用明场显微镜和载玻片腔室装置，在胚胎发育前半阶段可观察的典型特征包括形态发生运动，例如囊胚的细胞化、头褶形成、原肠带伸长及原肠带回缩1。使用GFP或RFP报告基因可识别更特异的终点事件，e.g. 早期体节化模式以及发育后期神经结构的形成1。GFP和RFP报告系统还可实现对活体透化胚胎中发育事件的观察，适用于载玻片腔室和发育篮两种样本制备方式。一种简单评估施加药物或化学物质整体毒性的方法是：通过蓝色荧光通道监测卵黄蛋白自发荧光的模式，以判断发育是否出现延迟或...

该 果蝇 胚胎仍然是研究发育基本机制的首选模型2这一强大的模型得到了一系列分子遗传学工具的支持，这些工具能够在任何时间点及任何发育器官中对几乎所有基因进行操作。其个体小巧、发育迅速，且形态发生过程已被广泛表征 果蝇 胚胎使其成为遗传筛选的首选模型，许多此类筛选已揭示了基本的发育通路3,4. 多种表型在 果蝇 胚胎表型特征明确且易于解读，常可借此识别导致异常性状的潜在分子遗传学机制。
从历史上看，果蝇胚胎模型的一个不足之处在于难以将小分子引入胚胎组织。这一障碍导致了以下两方面的局限性：1）无法利用已知的生物活性小分子作为探针来研究发育机制；2）无法利用这一成熟的模型来评估未知小分子的致畸性或药理活性。因此，果蝇胚胎在小分子活性表征方面的筛选潜力尚未得到充分利用。
向果蝇胚胎递送小分子可通过两种方法实现：1）卵壳通透化处理；2）显微注射。本文介绍了一种在常规 Drosophila 实验室条件下易于操作的卵壳通透化方法的改进。值得注意的是，近年来基于微流控技术的显微注射方法也在不断发展，为向胚胎引入化合物提供了新的途径5,6。果蝇卵壳的蜡质层会阻碍分子进入胚胎7。Drosophila 卵壳由五层结构组成，从内到外依次为：卵黄膜、蜡质层、内绒毛膜层、内壳膜和外壳膜8。通过将胚胎短暂浸入稀释的漂白剂中，可去除最外层的三层绒毛膜结构，该步骤称为去壳（dechorionation）。随后，暴露出来的蜡质层可通过有机溶剂（如庚烷和辛烷）处理而被破坏7,9，从而使去壳后的胚胎具备通透性，同时仍保留其下方的卵黄膜包裹结构。然而，这些有机溶剂具有毒性，且其强烈的通透化作用难以精确控制，这两方面因素均会显著降低胚胎的存活率9,10。
先前已描述了一种使用称为胚胎通透化溶剂（embryo permeabilization solvent, EPS）的组分进行通透化的方法1。该溶剂由d-柠檬烯和植物来源的表面活性剂组成，使其能够与水相缓冲液混溶。由于d-柠檬烯的低毒性以及可将溶剂稀释至所需浓度的特性，该方法能够有效制备具有高存活率的通透性胚胎1。然而，两种内源性因素仍持续限制其应用。首先，即使在严格控制胚胎发育阶段的情况下，经EPS处理后的胚胎在通透性上仍表现出异质性。其次，孵化后约八小时以上的较老胚胎难以实现通透化，这与产卵后卵壳逐渐硬化的过程一致11。
本文介绍了一种EPS方法的改进，该改进：1）有助于识别和分析近乎相同通透程度的胚胎，即使在固定和免疫染色步骤完成后仍可进行；2）能够实现对发育后期阶段（&#62;8 小时，12期及以后）胚胎的通透处理。具体而言，本文描述了一种远红染料CY5羧酸的应用，该染料可作为通透性指示剂，在胚胎发育过程中以及甲醛固定后仍保留在胚胎内。此外，结果表明，在18 °C条件下培养胚胎可使卵壳保持对EPS敏感的状态，从而实现对晚期胚胎（12–16期）的通透处理。
这些进展克服了前述EPS方法的局限性。因此，该应用将为研究人员提供一种手段，可在胚胎发育的特定时间点引入感兴趣的小分子，同时保持胚胎的存活能力。

<table><tbody><tr><td>果蝇饲养笼</td><td>Flystuff.com</td><td>59-101</td><td>http://flystuff.com/general.php</td></tr><tr><td>椰油酰胺 DEA [Ninol 11-CM]&amp;nbsp;</td><td>Stepan Chemical</td><td>需电话订购</td><td>http://www.stepan.com/</td></tr><tr><td>乙氧基化醇 [Bio-soft 1-7]&amp;nbsp;</td><td>Stepan Chemical</td><td>需电话订购</td><td>http://www.stepan.com/</td></tr><tr><td>d-柠檬烯（超纯级）</td><td>Florida Chemical Co.&amp;nbsp;</td><td>需电话订购</td><td>http://www.floridachemical.com/</td></tr><tr><td>次氯酸钠&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>SS290-4</td><td>http://www.fishersci.com/</td></tr><tr><td>Tween-20&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP337</td><td>http://www.fishersci.com/</td></tr><tr><td>PBS 粉末</td><td>Sigma</td><td>56064C</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr><tr><td>罗丹明 B</td><td>Sigma</td><td>R6626</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr><tr><td>CY5 羧酸</td><td>Lumiprobe</td><td>#23090</td><td>http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>472310-100</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr><tr><td>Shields 和 Sang M3 培养基</td><td>Sigma</td><td>S8398</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr><tr><td>Nitex 尼龙筛网&amp;nbsp;</td><td>Flystuff.com</td><td>57-102</td><td>http://flystuff.com/misc.php</td></tr><tr><td>溶解氧（DO）膜&amp;nbsp;</td><td>YSI</td><td>#5793</td><td>http://www.ysireagents.com/search.php</td></tr><tr><td>25 mm 圆形一号盖玻片&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>48380-080</td><td>https://us.vwr.com/</td></tr><tr><td>葡萄糖-琼脂培养板混合物&amp;nbsp;</td><td>Flystuff.com</td><td>47-102</td><td>http://flystuff.com/media.php</td></tr><tr><td>旋转混合仪</td><td>VWR</td><td>82007-202</td><td>https://us.vwr.com/</td></tr></tbody></table>

一种透化方法 果蝇 用于小分子活性检测的胚胎

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

果蝇（Drosophila）胚胎长期以来一直是阐明控制发育的分子与遗传机制的强大实验室模型。该模型易于进行遗传操作，因而取代了在其他动物模型和基于细胞的检测中常见的药理学方法。本文描述了一种最新改进的实验方案，可用于将小分子应用于发育中的果蝇胚胎。该方法详细说明了在保持胚胎活力的同时克服卵壳不通透性的各个步骤。通过使用先前报道的d-柠檬烯胚胎通透性溶剂（EPS1），并在处理前将胚胎在较低温度（18 °C）下老化，可在广泛的发育阶段实现卵壳的通透化。此外，本文还介绍了一种远红染料（CY5）作为通透化指示剂的使用方法，该染料与后续实验中常用的红色和绿色荧光染料兼容，适用于活体或固定样品的分析。该实验方案可用于利用生物活性化合物研究发育机制，也适用于评估未知小分子的致畸性或药理活性的研究。

图 1 展示了用于胚胎操作的装置，以帮助理解上述方案中所使用的“自制”设备。图 2 所示结果表明，在胚胎发育后期，以 18 °C 培养对增强其经 EPS 处理后的通透性具有显著效果，该条件应用于方案步骤 2.1 中。图 3 显示了 CY5 羧酸染料在揭示 EPS 处理胚胎中通常出现的不同通透性水平方面的有效性。图 3 还展示了染料在卵黄中分布的发育动态，揭示了用于评估胚胎活力的一个标准，如方案步骤 4.2 所述。图 4 的结果说明了 CY5 染料在毒素处理、甲醛固定及免疫染色后，用于判断胚胎通透性的实用性。
<img alt="EPS处理与发育篮、载玻片室、用于样品分析的实验装置。" src="/files/ftp_upload/51634/51634fig1highres.jpg" data-altupdatedat="178763040...

向发育中的Drosophila胚胎引入小分子化合物在表征新型化合物、药物和毒素的生物活性，以及探究基本发育通路方面具有巨大潜力。本文所述方法概述了克服该方法天然屏障的步骤，从而拓展了Drosophila胚胎模型的应用价值。

果蝇胚胎长期以来一直是阐明控制发育的分子与遗传机制的强大实验室模型。其易于……

以下实验的总体目标是制备具有可渗透卵壳的活性果蝇胚胎，以检测引入的小分子药物或毒素的生物活性。该目标首先通过使用稀释的次氯酸钠处理处于特定发育阶段的胚胎，以去除其外部的绒毛膜卵壳层来实现。第二步是利用一种溶剂对胚胎进行通透处理，该溶剂可去除阻碍小分子溶质进入的薄蜡质卵壳层。第三步是用药物或毒素以及染料处理胚胎，以同时评估卵壳的通透性并引入感兴趣的化合物。经过进一步发育后，可直接对胚胎进行成像，或进行免疫组织化学处理。最终，通过荧光显微镜结合免疫试剂或活体染料检测，结果可显示药物或毒素对组织发育的影响。今天我将介绍我们用于果蝇胚胎透化以检测小分子活性的方法。与现有方法（例如使用庚烷等传统有机溶剂进行透化）相比，该技术的主要优势在于，我们的胚胎透化溶剂（EPS）可与水混溶，且相对无毒。这些特性有助于胚胎处理，其中溶剂暴露可以更精确地控制，并且可在生理相关的培养基中进行，这两点均能提高胚胎的存活率。我最初产生这一方法的想法，是在思考如何去除卵壳蜡质层时。作为一名滑雪者，我联想到人们常用柑橘类溶剂去除滑雪板底部残留的蜡。这促使我将该应用转移到果蝇胚胎卵壳上，经过多次尝试与错误，最终解析了EPS的组成。准备至少含有500只所需品系的性成熟果蝇的群体培养笼。培养笼中应加入10厘米高的葡萄汁，并用少量酵母糊进行通气。每天更换这些培养皿两次。几天后，果蝇将适应培养环境，产卵更加规律。EPS 由表面活性剂和限量溶剂溶液配制而成，可保存两个月。在室温保存时，配制新鲜EPS时需将表面活性剂加热至37摄氏度。用于EPS处理的胚胎需使用由3厘米、50毫升聚丙烯管和粗糙化尼龙网制成的篮子进行操作。在后续发育步骤中，塑料边缘更容易与尼龙网熔合。胚胎也可使用50毫升管盖制成的篮子进行操作。将盖子钻孔并切出缺口，通过盖子与管子之间的螺纹固定筛网。或者，使用自制的载片腔室，并用一片透氧膜覆盖开口，再用固定环将膜压紧，以收集胚胎。早上在培养物上放置一个带有酵母糊的新鲜葡萄培养皿。一小时后，更换培养皿，并丢弃第一次收集的培养皿。让第二个培养皿在25摄氏度下收集胚胎两小时。然后收集培养板并转移至18摄氏度环境中，让胚胎发育至所需阶段。当胚胎准备就绪后，在进行EPS处理前对其进行脱壳处理。用水和画笔将它们从培养皿冲洗到研磨篮中。第二步，用轻柔的流动水冲洗，以去除任何残渣。第三步，将其浸入50%的次氯酸钠溶液中两分钟，并定期搅动溶液以确保充分接触。然后立即用流动的水将它们冲洗干净。现在，将六个60毫米的培养皿中各加入10毫升PBS，作为浸泡液，并在MBIM中将EPS储备液按1:40稀释，涡旋混匀。将形成白色乳状液。用擦拭纸吸去网篮底部多余的水分，然后将胚胎浸入EPS稀释液中，持续轻轻涡旋。将胚胎在 EPS 中轻轻摇晃 30 秒后，取出胚胎并吸去多余的溶液。然后将篮子依次移入六个 PBS 洗涤液中，轻轻冲洗以完成洗涤，随后进行染色和药物处理。优化胚胎的通透性和活性是本实验方案中最关键且最具挑战性的步骤。通透性对胚胎发育阶段较为敏感。胚胎老化处理的温度以及不同果蝇品系间的条件可能存在较大差异。EPS的稀释比例和处理时间的最佳参数需通过实验经验确定。首先，在微量离心管中制备50微摩尔的科幻羧酸染料在M-B-I-M-T中的溶液，一毫升即可。此时可加入毒素或药物以进行急性处理，涡旋混匀。用画笔将已透化的胚胎从筛篮转移至微量离心管中。盖上管盖并倒置数次。然后将管子放入诱变仪中，孵育15分钟。待胚胎沉降后，用移液器吸除染料，并重新加入1毫升M-B-I-M-T进行洗涤。重悬。悬浮胚胎，待其沉降后更换 M-B-I-M-T。重复此步骤三次和四次。完成第四次洗涤后，移除全部 M-B-I-M-T，并将胚胎转移至发育篮中，以进行长期发育培养。首先准备用于发育的篮子，用70%乙醇冲洗，然后用去离子水冲洗，并用实验室擦拭纸吸干水分。完成后，将篮子转移至含有六毫升孵育培养基的60毫米培养皿中，培养基中需包含所需药物或毒素。用毛笔将胚胎转移到篮子中的网格上，轻轻滴加培养液使胚胎落下，并将胚胎分散成单层。注意避免在网格下 trapped 气泡。若使用载玻片培养 chamber，需先准备好 chamber，将 chamber 倒置，并在开口边缘涂上一圈薄薄的真空脂。接下来，在开口内的膜表面加入150微升所需的培养基。现在，使用毛笔将胚胎转移至培养基中，并在膜上分散均匀。最后，加盖25毫米的圆形盖玻片，使培养基展平。在边缘处施加轻微压力以确保密封。在18摄氏度条件下培养胚胎对其在发育后期被EPS通透并摄取染料的能力具有显著影响。这一点可通过在25摄氏度条件下培养的EPS处理胚胎中缺乏Rumine BD摄取来说明；此处以红色显示的羧酸染料摄取情况揭示了EPS处理胚胎中通常观察到的不同程度的通透性。远红荧光染料（sci-fi dye）在发育过程中的动态分布，以及其在发育完全的肠道内伴随蓝色自发荧光显现的卵黄区域中的聚集，揭示了一项用于评估胚胎存活能力的标准。该 sci-fi 染料还可用于确定胚胎在经甲醛固定和免疫染色后是否先前具有通透性。在经 sci-fi 染料和甲基汞毒素处理后，EPS 胚胎使用绿色显示的 Antifa two 标记运动神经元，以及红色显示的 anti E lab 标记神经元胞体。Sci-fi染料以蓝色进行伪彩着色。甲基汞对对照处理胚胎中由箭头标记的cortone神经元胞体的排列模式产生影响。这些神经元的排列更为有序，此处以白色显示的束状结构表明了对照处理中由箭头指示的节段性神经元的正常分支。相比之下，甲基汞处理会改变分支模式，如实心绿色箭头所示。空心绿色箭头标示了分支发生位移的位置。一旦熟练掌握，若操作得当，该技术中的胚胎渗透处理可在大约30至40分钟内完成。完成此操作后，可进一步对胚胎进行固定和免疫染色等其他方法，以回答更多问题，例如在发育过程中某种药物或毒素特异性作用于哪些组织。感谢您观看本操作视频，祝您在实验室中成功应用这些方法时一切顺利。

a-method-permeabilization-drosophila-embryos-for-assays-small

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

的透的一种方法<em&gt;果蝇</em&gt;胚胎用于小分子活性的测定

我们描述了一种简化的方法，用于制备特定基因型的黑腹果蝇（Drosophila）胚胎的“去膜”样本。该方法可高效地开展多种遗传筛选实验，同时能够清晰地观察晚期胚胎中的各种结构。...

活体解剖 黑腹果蝇 胚胎：通过抗体染色快速筛选突变体文库的优化方法

此处我们描述一种整体荧光标记方法 原位 杂交（FISH）方案，用于确定果蝇胚胎发育期间表达的RNA的表达与定位特性， 黑腹果蝇.

完整组织 RNA 荧光 原位 杂交检测 Drosophila 胚胎

晚期胚胎表皮 果蝇 胚胎提供了一种 体内...

显微注射损伤实验与 在体 表皮伤口应答报告基因的定位 果蝇 胚胎

本实验方案的目的是提供一种简单且低成本的方法，用于中等规模（0.5–1...

中等规模制备 果蝇 用于蛋白质组学实验的胚胎提取物

血脑屏障的完整性对神经系统功能至关重要。Drosophila melanogaster 的血脑屏障在胚胎发育晚期由胶质细胞形成。本方案描述了检测 D. melanogaster...

Drosophila melanogaster 中血脑屏障完整性的检测方法

本文介绍了一种利用基于平板的高内涵成像系统，对多个果蝇（Drosophila）胚胎在胚胎发育过程中进行显微注射并同时成像的实验方案。...

利用自动化高内涵分析仪进行活细胞显微成像的果蝇胚胎制备与显微注射

在早期 果蝇 胚胎中许多细胞器具有运动性。原则上，可对它们进行活体成像 通过 特异性荧光探针，但卵壳阻碍了其对胚胎的直接应用。本方案描述了如何将此类探针引入胚胎 通过 显微注射，然后分析细胞器的大规模运动 通过...

可视化细胞骨架依赖性脂质囊泡在 Drosophila 胚胎中的运输

本文介绍了一种在早期Drosophila胚胎中实施膨胀显微技术的实验方案，旨在利用常规激光扫描共聚焦显微镜实现超分辨率成像。...

使用扩展显微镜技术对整体安装的 Drosophila 胚胎进行物理放大以实现超分辨率成像

Drosophila 转基因的胚胎显微注射

这些实验方案阐述了如何在对照组和突变型果蝇胚胎上皮中表征折叠型隔膜连接的结构及其封闭功能。...

免疫染色与染料渗透实验用于确定核心皱褶型紧密连接蛋白 果蝇 胚胎上皮

学习一种使果蝇胚胎卵壳通透的方法，用于测试小分子药物或毒素的生物活性。该方法通过去除外层绒毛膜和蜡质层，提高化合物渗透性，便于研究药物对组织发育的影响。

一种透化方法果蝇用于小分子活性检测的胚胎

探索更多视频

一种透化方法 果蝇 用于小分子活性检测的胚胎

探索更多视频

一种透化方法果蝇用于小分子活性检测的胚胎