一个 离体 用于研究甲状腺发育的培养系统

本实验的总体目标是解剖离体培养的小鼠胚胎甲状腺移植物或叶，以研究甲状腺发育过程中发生的形态发生和分化事件。该目标首先通过去除胚胎第12.5至14.5天（E 12.5至E 14.5）小鼠胚胎的上颌和下部躯体，分离出胚胎的颈部区域来实现。

第二步，去除神经管、侧部组织和舌，以暴露气管和食管的上部。接着，进一步清除甲状腺原基、区域或叶上的所有不需要的组织。最后一步，将甲状腺移植物接种于包被的微孔板或滤膜上进行培养。

最终，可进行活细胞成像、免疫染色或基因表达分析，以研究上皮形态发生过程中的三维结构组织、滤泡、移植体的血管化或甲状腺前体细胞的分化。该方法有助于回答有关甲状腺上皮细胞在三维环境中的组织方式、腔体形成、细胞分化、极性建立及生长等关键发育与分化问题。

演示该实验操作的是来自本实验室的研究生 Fidel Marcel 和博士后 Myla LaCorte。在超净台内的无菌条件下，于甲状腺组织分离前两小时，将无菌的一型胶原蛋白用 10 毫摩尔盐酸稀释至终浓度为每毫升 50 微克，并将胶原溶液置于冰上。

然后，向塑料培养板的每个孔中加入 200 微升稀释后的胶原蛋白溶液，于室温孵育 2 小时。孵育结束后，吸除胶原蛋白溶液，用 M199 培养基冲洗各孔，并向每孔中加入至少 200 微升的培养基。将包被好的培养板放入培养箱中，随后进行甲状腺解剖操作。

首先，将解剖得到的子宫放入含有 HBSS 的 10 厘米培养皿中。接着，用镊子夹住子宫的一端，用小剪刀剪开子宫壁，依次释放出每个胚胎。使用剪刀将胚胎与胎盘分离，然后将带有胚外膜的胚胎转移至另一含有新鲜 HBSS 的 10 厘米培养皿中。

接下来，在体视显微镜下对每个胚胎继续进行解剖。首先，去除卵黄囊和羊膜。然后使用装在玻璃毛细管中的钨针作为刀和叉进行操作。

去除头部的上半部分，包括上颌和耳部。将胚胎背部朝上固定。随后去除一段多余的神经管，接着在前肢下方、心脏上方处切除胚胎的下半部分。

为了确定组织的方向，将包含舌部及其颈部区域的胚胎切片转移至一个新的含有新鲜HBSS的10厘米培养皿中，并去除神经管以及食管和气管后方的组织。随后，沿舌的两侧轻轻切开组织切片。然后定位食管和气管，将舌部解剖分离，保留视黄酸肿胀区以及食管和气管两侧的组织。

取出舌部后，剥离食管并将气管腹侧朝上放置。随后去除不需要的组织，例如胸腺以及位于咽弓动脉侧方的所有组织。对于 E 13.5 或 E 14.5 胚胎，观察气管两侧的甲状腺叶，并进一步将甲状腺叶从气管上分离。

对于 E 12.5 胚胎，解剖操作可按前述方法进行，直至切除舌部和食管后。随后定位咽弓动脉，去除所有侧向组织，操作方式与 E 13.5 至 E 14.5 胚胎相同。最后，使用 P 200 微量移液器上预先润湿的滤芯吸头，将分离的组织转移至含有预热培养基的 35 毫米培养皿中。

在接种E13.5至E14.5甲状腺外植体之前，首先将组织依次转移至含有1毫升预温培养基的24孔板的三个孔中进行洗涤，以将甲状腺叶接种到预先包被的培养室中。首先吸除培养基，然后使用带滤芯吸头的微量移液器，小心地将一个甲状腺叶接种至每个培养室中。

吸除多余的培养基，然后将培养 chamber 置于组织培养孵箱中，使外植块贴附于基质。两小时后，轻轻向每个孔中加入 200 至 300 微升预温的培养基，并将 chamber 重新放回孵箱中，用于将 E12.5 期的气管区域或甲状腺叶接种到半透滤膜上。首先，用 130 微升预温的培养基填充 24 孔板的各个孔。

将培养基置于滤膜上，注意避免在培养滤膜下方滞留气泡。然后使用带滤芯吸头的微量移液器，小心地将甲状腺外植体或叶状组织连同极少量培养基转移至每张滤膜的中央，每张滤膜最多放置四个外植体。

当将X解释物转移到滤膜上时，重要的是用最少的培养基将其转移至滤膜中央，以避免培养基接触滤膜壁并形成弯月面。最后，去除多余的培养基，并使用钨针将它们分开。然后将它们置于组织培养孵育箱中，最多培养七天，在超净工作台中每隔一天更换一次培养基。

在滤膜上培养一天后，laa 的中线可见，表现为沿顶部长度延伸的细长组织，并在气管两侧各形成一个叶状结构。随着培养的进行，这些叶状结构逐渐扩展，并经历上皮细胞的形态发生重组，形成肉眼可见的滤泡样结构。如图中所示，通过 ezrin 免疫标记可以观察到上皮细胞的有序排列与极化，这些上皮细胞呈现一致且阳性信号。

随着时间推移，细胞内表达ezrin的结构与将发育为顶端的细胞极融合。在此过程中，表达4-PCAM的内皮细胞增殖并围绕发育中的滤泡排列，形成血管-滤泡单位。为了定量分析滤泡上皮细胞和C细胞的分化情况，可对培养的甲状腺叶中分离得到的RNA进行逆转录定量聚合酶链式反应（R-T-Q-P-C-R）检测基因表达水平。

尽管在培养过程中甲状腺转录因子 NK X 2.1 的表达未发生变化，但甲状腺特异性的甲状腺球蛋白以及滤泡旁细胞特异性的降钙素表达显著增加，表明发生了功能性分化。观看本视频后，您应充分了解如何分离和培养甲状腺组织。您现在已具备使用野生型或 NOCO 胚胎进行基因功能获得与缺失实验的能力。