T淋巴细胞整合素活化研究的静态黏附实验

本实验的总体目标是定量分析细胞黏附。首先，在第二步中用黏附分子包被96孔微孔板以实现该目标。从血液中分离原代人T细胞，并用CFSE进行标记。

接下来，用不同处理刺激T细胞以影响其黏附性。最后一步，将处理后的细胞加入微孔板，使其发生黏附。最终可通过测定每孔的荧光强度，确定每种处理条件下黏附细胞的百分比。

与现有的T细胞添加至模型和血管内皮细胞的方法相比，该技术的主要优势在于无需进行T细胞与内皮细胞的共培养。该方法有助于回答免疫学领域的关键问题，例如特定药物如何影响淋巴细胞的黏附？尽管该方法可为淋巴细胞足部生物学提供深入见解，也可应用于其他髓系细胞，如中性粒细胞。

该方法的可视化演示至关重要，因为这些步骤难以掌握，需要精确性和技巧。开始对微孔板进行黏附分子包被时，先用50 µL洗涤液洗涤96孔板中的24个孔，然后除未包被的对照孔外，每个孔加入50 µL包被液，在37°C下孵育1小时。接下来，轻柔地吸去包被液，注意移液枪头不要接触孔底。随后，用额外50 µL洗涤液洗涤各孔，再向微孔板每孔加入50 µL黏附溶液进行孵育。

再次置于37摄氏度环境下。一小时后，轻柔地吸除黏附溶液，并用50微升洗涤液再次洗涤各孔。为分离T细胞，首先将每毫升全血与50微升人T细胞富集混合液充分混匀，然后将处理后的血液在室温下孵育20分钟。接着，将6毫升处理后的血液与等体积的含1%葡萄糖、不含钙和镁的PBS加入到一个50毫升的锥形管中，在室温下轻轻混匀。

然后将15毫升淋巴细胞分离液加入一个新的50毫升锥形管中，并小心地将稀释后的血液样本叠加在淋巴细胞分离液上。以400 × g、20 °C离心20分钟，关闭刹车。然后用新的巴斯德吸管小心吸去上层液体，保留位于界面处的淋巴细胞层不受扰动。

用新的移液管将淋巴细胞层转移至一个新的锥形管中。向淋巴细胞中加入9毫升磷酸盐缓冲液（PBS），然后轻轻吹打使细胞均匀悬浮。离心细胞，随后将沉淀重悬于培养基中。

然后将细胞接种至T75培养瓶中。在适当的培养周期后，加入20毫升培养基以刺激细胞。首先，向2.4×10⁶个T细胞中加入无血清培养基，然后将细胞置于37°C培养箱中进行无血清饥饿处理。

两小时后，离心沉淀细胞，并将沉淀重悬于1毫升PBS中，在室温下避光标记荧光标记物8分钟，然后加入10毫升37摄氏度的PBS终止反应。随后离心细胞，将沉淀重悬于1.2毫升预热的黏附溶液中。

将包被的微孔板预热至 37 摄氏度，然后将细胞分装到八个 1.5 毫升离心管中，每管 150 微升。其中一管加入佛波酯（PMA）至终浓度为 10 纳克/毫升，作为阳性对照。保留三管不作处理，分别用作刺激对照、未洗涤加样对照以及 ICAM-1 包被对照。其余四管用不同浓度的抗 CD3 抗体进行刺激。

然后立即将刺激后的细胞混合物每50微升（含1×10⁵个细胞）分装至微孔板中相应的孔内，于37°C孵育15分钟。为确定贴壁细胞百分比，首先用150微升预热的贴壁溶液洗涤各孔。轻轻振荡微孔板数秒，然后小心吸除各孔中的培养基，注意移液枪头勿接触孔底。

用移液器每次吸取时改变角度，重复洗涤三次。然后打开酶标仪，在任务菜单下启动酶标仪读板软件。单击“新建”以设置新方案。

然后在操作菜单下选择读取选项。点击荧光强度，然后点击确定。将激发波长设置为 485，发射波长设置为 528。

然后在光学选项菜单中，选择底部并点击确定。接着返回操作菜单，将温度设置为37摄氏度，然后点击确定。最后加载微孔板并点击运行。

将结果导出至电子表格后，使用公式计算这些图像中黏附细胞的百分比。图中展示了一个使用原代T细胞并以不同浓度抗CD3抗体刺激的黏附实验示例。未刺激的细胞作为阴性对照。

PMA 处理的细胞作为抗 CD3 抗体的阳性对照。该表格显示了 CFSE 标记的原代 T 细胞在不同浓度可溶性抗 CD3 抗体刺激下，并接种于 IAM1 包被孔中培养后，相对荧光强度的结果。针对每种实验条件，可计算三个复孔的平均强度，并将其转换为相对于接种总细胞数的相对百分比。

在典型的实验中，经PMA处理的贴壁细胞比例为40%至50%，而未刺激细胞的贴壁比例为5%至10%。请注意，随着用于刺激的抗CD3抗体浓度增加，贴壁细胞的比例也随之升高。一旦掌握该技术，若操作得当，整个实验可在三小时以内完成。在进行该操作时，务必记得测量未洗涤孔的荧光强度，以确定荧光输入值。

数据分析中的一个关键值。观看本视频后，您应该能够很好地理解如何量化静态细胞黏附。请注意，处理人血样本可能具有极高的危险性，在进行本实验操作时，务必采取佩戴实验服和手套等防护措施。