静电粘附实验对整合素激活的T细胞研究
June 13th, 2014
静态粘合试验是一种可以用于建模的T淋巴细胞和其他细胞类型之间的相互作用的有力工具。通过标记的T细胞注入到井中涂有粘附分子，而读板器是用于以下串行洗涤量化贴壁细胞的数量所产生的相互作用。
该程序的总体目标是量化细胞粘附。这是通过在第二步中首先用粘附分子包被 96 孔微孔板来实现的。从血液中分离出原代人 T 细胞，并用 CFSE 标记。
接下来，通过治疗刺激 T 细胞以影响其粘附性。在最后一步中，将处理过的细胞添加到微孔板中，并允许发生粘附。最终，可以测量每孔的荧光量以确定每种处理条件下贴壁细胞的百分比。
与现有方法（如将 T 细胞添加到模型和前申）相比，该技术的主要优点是不需要 T 细胞和 erl 细胞的共培养。这种方法可以帮助回答免疫学领域的关键问题，例如特定药物如何影响淋巴细胞粘附？虽然这种方法可以提供对线足生物学的见解，但它也可以应用于其他 maie 细胞，例如中性粒细胞。
这种方法的视觉演示至关重要，因为这些步骤难以掌握并且需要精确度和技巧 要用粘附分子对微孔板进行编码，首先用 50 微升洗涤液洗涤 96 孔板的 24 个孔，然后将除未涂层对照孔外的每个孔与 50 微升涂层溶液在 37 摄氏度下孵育 1 小时。接下来，轻轻吸出涂层溶液，不要让移液器吸头接触孔的底部。然后，在用 50 μL 的洗涤液洗涤孔后，用每孔 50 μL 的粘附溶液孵育微孔板。
同样，在 37 摄氏度。1 小时后，轻轻吸出粘附溶液，并用 50 μL 洗涤液再次清洗孔 要分离 T 细胞，首先在每毫升全血中充分混合 50 μL 人 T 细胞富集混合物，然后在室温下孵育处理过的血液 20 分钟。接下来，在室温下将 6 毫升处理过的血液和等体积的富含 1%D 葡萄糖的不含钙和镁的 PBS 加入 50 毫升锥形管中，然后轻轻混合溶液。
然后将 15 mL 淋巴制剂加入新鲜的 50 mL 锥形管中，并小心地将稀释的血液样品分层到淋巴细胞分离培养基上。将细胞层在 400 倍 G 和 20 摄氏度下分离 20 分钟，并断开。然后使用新鲜的粘贴移液器去除上层，使界面处的淋巴细胞层不受干扰。
用新的 pester 移液器将淋巴细胞层转移到新的锥形管中。向淋巴细胞中加入 9 毫升 PBS，然后轻轻吸入和吸出细胞，将细胞均匀分布在整个悬浮液中。离心细胞，然后将沉淀重悬于培养基中。
然后将细胞分配到 T 75 培养瓶中。20 毫升培养基，以在适当的培养期后刺激细胞。首先，向 6 个 T 细胞中加入 2.4 倍 10 的无血清培养基，然后在 37 摄氏度的培养箱中对细胞进行血清饥饿。
两小时后，离心细胞并重悬沉淀。在 1 毫升 PBS 中，用荧光标记物在室温下在黑暗中标记细胞 8 分钟，然后加入 10 毫升 37 摄氏度 PBS 终止反应。然后，在旋转细胞后，将沉淀重悬于 1.2 mL 预热粘附溶液中。
将包被的微孔板加热至 37 摄氏度，然后将细胞分成 8 个 150 微升的等分试样，分 1.5 个。毫升试管以 10 ng/mL 的 PMA 刺激一根试管作为阳性对照。让三支试管未经处理，以用于刺激控制、未清洗的负荷控制和 ICAM 一涂层控制，并用不同浓度的抗 CD 三抗体刺激四支试管。
然后立即将 50 微升 10 倍至第 5 个细胞分装到微孔板中的适当孔中，并在 37 摄氏度下孵育板 15 分钟。为了首先确定贴壁细胞的百分比，用 150 μL 温热粘附溶液洗涤每个孔。轻轻摇动板几秒钟，然后小心地从每个孔中吸出培养基，不要用移液器吸头接触孔底部。
重复洗涤 3 次，每次吸液时改变移液器的角度。然后打开读板器并打开任务菜单下的读板软件。单击 New （新建） 以设置新协议。
然后在作菜单下，选择读取选项。单击 fluorescent intensity（荧光强度），然后单击 ok（确定）。输入激发波长 485 和发射波长 528。
然后在光学选项菜单下，选择 bottom 并单击 Ok.然后返回作菜单并将温度设置为 37 摄氏度，然后单击确定。最后加载微孔板并单击运行。
将结果导出到电子表格后，使用公式计算这些图像中粘附单元格的百分比。显示了使用原代 T 细胞的粘附测定的实例，用不同浓度的抗 CD 三种抗体刺激。未刺激的细胞用作阴性对照。
PMA 处理的细胞用作抗 CD 三种抗体的阳性对照，该表显示了 CFSE 的相对荧光强度。标记的原代 T 细胞用不同剂量的可溶性抗 CD 三种抗体刺激，并接种在 IAM one 包被的孔上。对于每种条件，可以计算一式三份孔的平均强度，并将其转换为总细胞加载的相对百分比。
在典型实验中，贴壁 PMA 处理的细胞的百分比在 40% 到 50% 之间，而未刺激细胞的百分比在 5% 到 10% 之间注意，贴壁细胞的百分比随着用于刺激的抗 CD 三种抗体浓度的增加而增加。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在不到三个小时的时间内完成。在尝试此过程时，请务必记住测量未洗涤孔的荧光以确定荧光输入。
数据分析中的关键值。观看此视频后，您应该对如何量化静态细胞粘附有很好的了解。不要忘记，处理人类血液样本可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如穿着实验室外套和手套。
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概览
静态粘附测定是一种用于研究T淋巴细胞与其他细胞类型之间相互作用的方法。这涉及用粘附分子涂覆微板，并使用荧光测量定量粘附的T细胞。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞粘附
- 免疫学
- 细胞生物学
背景
- 理解T细胞相互作用对免疫学研究至关重要。
- 粘附分子在细胞间相互作用中起着重要作用。
- 定量粘附可以提供对T细胞行为的洞察。
- 这种测定可以适应各种实验条件。
研究目的
- 量化T淋巴细胞的细胞粘附。
- 评估不同处理对T细胞粘附性的影响。
- 提供一种研究T细胞相互作用的可靠方法。
使用的方法
- 用粘附分子涂覆96孔微板。
- 从血液中分离原代人T细胞。
- 用CFSE标记T细胞以进行荧光测量。
- 用处理刺激T细胞以修改其粘附性。
主要结果
- 荧光测量显示粘附细胞的百分比。
- 不同处理影响T细胞的粘附水平。
- 该测定提供了有关T细胞相互作用的定量数据。
- 结果可以为进一步研究免疫反应提供信息。
结论
- 静态粘附测定对于研究T细胞相互作用是有效的。
- 粘附的定量分析可以揭示重要的生物学洞察。
- 这种方法可以在各种免疫学研究背景中应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantifying integrin-mediated adhesion in T lymphocytes provides a mechanistic readout for evaluating immunomodulatory compounds that influence immune cell trafficking and synapse formation. This static adhesion assay enables target validation by linking intracellular signaling events to functional adhesive outputs, supporting de-risking of immunomodulator candidates in early discovery. The assay’s adaptability to other integrin-ligand pairs (e.g., VLA-4/fibronectin) extends its utility across inflammatory and autoimmune disease areas.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates inside-out signaling pathways that regulate integrin affinity states, enabling mechanistic de-risking of targets involved in T cell activation.
- Operational Value: Provides a quantitative, fluorescence-based readout to compare adhesion levels across treatment conditions, supporting hypothesis testing in immunomodulator screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates dose-response data for compounds affecting lymphocyte adhesion, such as anti-CD3 antibodies or PMA, enabling lead identification based on functional immunomodulation.
- Operational Value: Uses a standardized 96-well format with CFSE labeling and plate reader compatibility, supporting assay reproducibility and scalability for medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects molecular mechanisms of integrin activation to cellular phenotypes relevant to immune cell migration and immunological synapse formation.
- Operational Value: Enables evaluation of adhesion-modulating substances in a disease-relevant system using primary human T cells, supporting translational biomarker alignment.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, where quantitative adhesion measurements help prioritize immunomodulators based on functional impact on T cell behavior.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of inside-out signaling pathways by measuring changes in integrin-mediated adhesion under controlled stimulation.
- Screening: Delivers standardized, quantitative fluorescence outputs that allow comparison of compound effects on T cell adhesiveness across replicates.
- Analytics: Enables calculation of percent adherent cells relative to controls, providing a normalized metric for structure-activity relationship analysis.
- Translational Research: Uses primary human T cells coated with physiological ligands (e.g., ICAM-1), enhancing relevance to human immune responses.
- Enterprise Reuse: Adaptable to alternative integrin-ligand pairs, allowing reuse across multiple immunology projects without redeveloping core methodology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking receptor stimulation to functional adhesion outcomes, increasing predictive confidence in immunomodulator mechanisms.
- Operational Value: Eliminates need for co-culture systems, simplifying workflow and reducing variability compared to cell-based adhesion assays requiring APCs.
- Strategic Value: Enables earlier go/no-go decisions by identifying compounds that fail to modulate T cell adhesion, reducing investment in mechanistically inactive candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunomodulators based on quantitative adhesion profiles, improving capital efficiency in preclinical development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human T cell isolation and fluorescence-based assay techniques.
- Dependent on access to a fluorescence plate reader capable of CFSE excitation (485 nm) and emission (528 nm) detection.
- Necessitates standardization of coating, stimulation, and washing steps to ensure reproducible adhesion measurements across wells and experiments.
- Adaptation to other integrin-ligand pairs (e.g., VLA-4/fibronectin) requires validation of coating efficiency and ligand specificity.
- Limitations include static conditions that may not fully replicate shear-dependent adhesion observed in vivo.
