Name: 利用荧光蛋白监视非洲锥虫Glycosome动态 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 了解利用荧光蛋白标记和流式细胞术实时监测非洲锥虫糖体动态变化的方法。该技术可高通量分析活细胞中糖体组成对环境变化的响应，为研究寄生虫代谢机制提供有力工具。

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本工作由克莱姆森大学本科生研究创新探究项目和卡尔霍恩荣誉学院资助。

1. 锥虫的一般培养
<ol>
	<li>称取SDM79培养基配制所需的固体成分（表1）。</li>
	<li>将固体成分储存于50 ml锥形瓶或Ziploc&#160;袋中，4 °C保存。注意：试剂在至少6个月内保持稳定。</li>
	<li>将胎牛血清（FBS）在37 °C水浴中解冻，并定期颠倒混匀。注意：FBS由供应商提供时为无菌溶液。对FBS进行过滤除菌会降低其支持寄生虫生长的能力。</li>
	<li>待整瓶血清完全解冻后，在56 °C水浴中加热灭活30分钟，期间定期混匀，以尽量减少血清成分的沉淀。</li>
	<li>在室温下解冻青霉素/链霉素溶液（pen/strep）、血红素（2 mg/ml溶于50 mM NaOH）以及基础Eagle培养基维生素溶液。</li>
	<li>向1,000 ml量筒中加入20.2 g SDM79固体成分（表1）和液体组分（表2），并在搅拌器上充分混匀。</li>
	<li>调节pH至7.35，并加水定容至850 ml。</li>
	<li>通过将真空管连接至滤瓶底部进行过滤除菌。施加真空直至溶液完全过滤。</li>
	<li>在生物安全柜中取下滤器上部，加入150 ml加热灭活的FBS。取下无菌瓶盖的塑料保护膜，密封培养基瓶。</li>
	<li>SDM80培养基的配制方法与SDM79相同，但有以下例外：不添加葡萄糖和氨基葡萄糖，使用不含谷氨酰胺的MEM培养基。以135 ml透析并加热灭活的FBS和15 ml加热灭活的FBS替代150 ml加热灭活的FBS。</li>
	<li>在27 °C、5% CO2条件下，将PCF期寄生虫培养于含10 ml适当培养基的25 cm2培养瓶中。注意：应每天使用血细胞计数板或流式细胞仪（见第6节）进行细胞计数，培养密度应维持在1 × 105 至 5 × 106 个细胞/ml之间。</li>
</ol>
2. 使用荧光报告构建体转染PCF寄生虫
注意：为了追踪糖酵解体的动态变化，需在寄生虫中表达一种报告蛋白，该蛋白由醛缩酶的过氧化物酶体靶向序列（PTS2）与增强型黄色荧光蛋白融合而成。编码该融合蛋白的序列被克隆至pXS2bla12载体中，该载体包含前粘附素（procyclin）启动子和微管蛋白基因间区，可引导同源重组插入基因组，并携带杀稻瘟菌素抗性基因用于筛选。将靶向构建体pXS2:PTS2eYFP转化至表达T7 RNA聚合酶和四环素阻遏蛋白（PF29-13）的昆虫型细胞系中。
<ol>
	<li>按照表3列出的组分配制细胞电转缓冲液（cytomix），过滤除菌后室温保存。</li>
	<li>用移液器将10 μl质粒DNA（1 μg/μl）、5 μl限制性内切酶缓冲液、33 μl水和2 μl MluI酶加入微量离心管中，混匀以线性化质粒DNA。37 °C孵育1小时。</li>
	<li>向限制性内切酶消化产物中加入1体积的结合缓冲液，通过涡旋振荡充分混匀结合缓冲液与消化后的DNA。短暂离心，使液体聚集于管底。</li>
	<li>将DNA结合柱插入2 ml收集管中，然后将消化后的DNA与结合缓冲液混合液转移至结合柱中。</li>
	<li>10,000 × g离心1分钟。离心后弃去收集管中的滤液，将结合柱放回原收集管中。</li>
	<li>加入700 µl SPW洗涤缓冲液，10,000 × g离心1分钟。</li>
	<li>弃去收集管中的滤液，将结合柱放回收集管中，重复一次SPW洗涤步骤及离心操作。</li>
	<li>弃去滤液，将结合柱放回收集管中，空柱在10,000 × g下离心3分钟，以去除残留的乙醇。</li>
	<li>在生物安全柜中丢弃收集管，将结合柱置于一个新的无菌微量离心管中。</li>
	<li>为洗脱DNA，向结合柱中加入25 µl无菌水，室温孵育2分钟，然后在10,000 × g下离心1分钟。</li>
	<li>在生物安全柜中再向结合柱中加入25 µl无菌水，室温孵育2分钟。</li>
	<li>在10,000 × g下离心1分钟。</li>
	<li>在生物安全柜中，将结合柱中全部DNA溶液转移至新的无菌微量离心管中。注意：此步骤可避免离心过程中因管盖开启导致的污染。</li>
	<li>将10 µg无菌、纯化后的线性化DNA加入400 µl过滤除菌的cytomix缓冲液中。</li>
	<li>按第6节所述方法计数细胞，并在室温下以800 × g离心15分钟&#160;，收集5 × 107–108个细胞。</li>
	<li>弃去上清液，用1 ml移液管将细胞沉淀重悬于450 µl DNA与cytomix的混合液中。</li>
	<li>将含有细胞、DNA和cytomix的溶液转移至无菌的4 mm电转杯中，并将电转杯放入电穿孔仪电击室。</li>
	<li>选择“指数衰减”模式，并手动输入以下参数：电压：1.5 kV，电容：25 mF，电阻：Ω，电转杯：4 mm。按下电击按钮。电击完成后，从电穿孔仪中取出电转杯并放回生物安全柜中。</li>
	<li>在新的无菌培养瓶中加入10 ml SDM79培养基，然后将转化后的细胞转移至该含10 ml SDM79的培养瓶中。</li>
	<li>在27 °C、5% CO2条件下孵育24小时，期间不加药物筛选。24小时后，加入G418（15 µg/ml）、潮霉素（50 µg/ml）和杀稻瘟菌素（blasticidin，10 µg/ml）。将1 ml含药物的转化细胞接种至9 ml含药物的SDM79培养基中。</li>
	<li>按第6和第7节所述方法每日观察细胞。当细胞呈现荧光且细胞密度达到1 × 107/ml时，进行稳定细胞系的制备以用于长期保存（见3.1–3.3节）。</li>
</ol>
3. 制备稳定剂
<ol>
	<li>制备冻存液时，将等体积的100%甘油加入细胞溶解液（cytomix）中，并通过滤膜除菌。</li>
	<li>在冻存管中加入200 µl冻存液至800 µl细胞（1 × 107）中，轻轻颠倒混匀，置于两个聚苯乙烯泡沫架之间，于-80 °C冻存。</li>
	<li>待细胞完全冻结（约24小时）后，转移至液氮中保存。注意：细胞在-80 °C下不宜长期保存，超过24小时会导致细胞活力下降，因此必须在24小时内转移至LN2中。</li>
</ol>
4. 解冻冻存菌种
<ol>
	<li>从 -80 °C 取出冻存管，在室温下解冻约 10 分钟。</li>
	<li>用移液器将 9 ml 含药物的 SDM79 培养基加入一个新的无菌烧瓶中。将解冻的细胞加入该烧瓶中。通过将 1 ml 该培养物加入含 9 ml SDM79 的新烧瓶中，以 1:10 的比例传代细胞（最终浓度为 1 × 105/ml）。</li>
	<li>在细胞密度达到 107/ml 之前，开始进行流式细胞仪设置和稀释测定实验。</li>
</ol>
5. 细胞仪设置
<ol>
	<li>打开流式细胞仪并启动 CFlow Plus 程序。注意：在运行任何样本之前，应按照步骤 5.2–5.7 对流路系统进行反冲和冲洗。</li>
	<li>将盛放采样探针的纳米纯水管更换为一个空管。</li>
	<li>点击“反冲”按钮。</li>
	<li>反冲完成后，从采样探针上取下微量离心管并弃去。</li>
	<li>在采样探针上放置一个新的含有 1 ml 新鲜纳米纯水的微量离心管。</li>
	<li>在 CFlow 程序中选择一个新的孔位。在“运行限制”下设置时间为 2 分钟，在“流路”下选择“快速”模式，然后点击“运行”。</li>
	<li>当 2 分钟运行时间结束后，点击“删除样本数据”按钮。</li>
</ol>
6. 使用流式细胞仪进行细胞计数
<ol>
	<li>将水替换为待计数的样品。将“运行时限”设置为30秒，“流速”设置为“快速”，然后选择“运行”。</li>
	<li>30秒时限结束后，CFlow plus 将在“上次运行”中提供每微升的事件数（events/μl）。对每个培养物重复进行计数。注意：在细胞浓度达到1 × 107 个细胞/ml之前，应进行稀释实验。完成一次稀释实验后，应停止继续培养。长时间培养的细胞会丧失对环境条件的响应能力。</li>
</ol>
7. 使用流式细胞仪测量荧光
<ol>
	<li>为评估荧光，将“Run Limits”设置为10,000个事件，“Fluidics”设置为“slow”。选择“Set threshold”。在“Primary Threshold”下，选择“Permanently eliminate events on”，从下拉框中选择“FSC-H”，并输入小于30,000的值。点击“apply”，然后点击“close”。</li>
	<li>在其中一个新绘图窗口中选择“Histogram”按钮，从下拉列表中选择“FSC-A”，然后选择“FL1-A”。注意：FL1-A用于检测530 nm波长处的荧光。</li>
	<li>点击“Run”，并对所有培养物重复此操作。</li>
	<li>让清洗液通过流路系统运行2分钟，随后用水运行2分钟。</li>
</ol>
8. 稀释测定实验
<ol>
	<li>将细胞以每毫升3 ml SDM79培养基中1 × 105个细胞的密度接种于25 cm2培养瓶中，在传代后立即测定荧光，随后在3小时和24小时再次测定荧光。</li>
</ol>
9. 数据分析
<ol>
	<li>在 CFlow Plus 上选择“Analyze”选项卡。</li>
	<li>在“Make a new plot”下点击“Histogram”按钮。选择“FSC-A”，将出现一个下拉列表，从中选择通道“FL1-A”。</li>
	<li>高亮选择待分析的孔。点击“Gate”按钮，手动为感兴趣细胞群绘制门控区域。</li>
	<li>Flow Plus 将提供该门控区域内细胞的“Count”（数量）以及“% of This Plot”（占该图比例）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

糖酵体是必需的、动态的、寄生虫特有的细胞器。调控这些细胞器的生物发生、维持、增殖和重塑过程的机制可能包含可作为药物靶点的分子，有望被用于治疗目的。尽管此类药物靶点可能非常丰富，但糖酵体生物发生领域的研究进展却落后于其他生物中类似过程的研究，主要原因是缺乏一种可操作的高通量系统，用于在活细胞中监测快速而动态的细胞器响应。
荧光细胞器报告系统已被用于研究酵母、植物、真菌和哺乳动物等高等真核生物中的细胞器动态23-25。我们构建了一种表达PTS2eYFP的PCF寄生虫转基因株系，该蛋白靶向成熟的糖酵解体，从而使细胞器产生荧光。通过检测细胞荧光，可监测糖酵解体组分的变化。利用该系统，我们发现环境条件（尤其是葡萄糖）可调控糖酵解体的组成12。
与常用于研究动质体寄生虫细胞器动态的显微镜方法不同，该报告系统提供了一种快速筛选影响整体乙醛酸循环体动态的化合物和条件的方法。然而，荧光的变化反映的是整个细胞器组分的变化，要明确表现出不同荧光强度的细胞群体之间特定的分子差异，还需进一步开展生物化学和显微...

Trypanosoma brucei 会导致人类的非洲昏睡病以及牛的消耗性疾病——那加那病。目前用于治疗这些疾病的药物陈旧且毒性极高，尚无可用疫苗，且存在产生耐药性的风险，因此亟需寻找新的药物靶点1。
在生命周期中，T. brucei 在昆虫媒介和哺乳动物宿主之间交替；这两种宿主为寄生虫的生存提供了截然不同的环境。当寄生虫暴露于不同环境条件时，会发生一系列代谢和形态上的变化。其中最显著的变化之一发生在一种单层膜包被的、寄生虫特有的微体——糖酵解体中13。
血液中的葡萄糖水平相对较高（约 5 mM），而血液阶段的寄生虫（BSF）完全通过糖酵解生成 ATP，同时其线粒体代谢受到抑制14。与其他真核生物中糖酵解发生在细胞质中的情况不同，T. brucei 将大部分糖酵解酶区室化于糖酵解体中14,15。当采采蝇吸食血液时，这些寄生虫被摄入体内，并经历葡萄糖浓度的下降，在被采采蝇摄入后 15 分钟内葡萄糖水平即降至无法检测的程度。昆虫阶段（前循环型，PCF）寄生虫的代谢更具灵活性，可利用葡萄糖以及脯氨酸等氨基酸合成 ATP16-18。比较蛋白质组学研究表明，糖酵解体和线粒体蛋白在生活周期不同阶段发生依赖性变化，其中血液阶段寄生虫的糖酵解相关蛋白增加，而线粒体中参与三羧酸循环（TCA cycle）和呼吸链的蛋白则在其他阶段上调13,19。尽管已有大量研究聚焦于 BSF 与 PCF 糖酵解体之间的差异，但关于 PCF 糖酵解体如何响应环境变化而发生改变的研究仍十分有限。
果蝇后肠中的葡萄糖水平较低，在摄食期间出现短暂升高20. 在大多数情况下 体外 研究中，PCF期寄生虫通常在含有葡萄糖的培养基中培养。然而，近期研究表明，PCF期寄生虫的代谢会随着葡萄糖的可利用性发生显著变化。17在缺乏葡萄糖的情况下，脯氨酸的吸收及脯氨酸脱氢酶活性增加18线粒体代谢的这种改变可能伴随着糖酵体组成和形态的变化，然而这一推测尚未得到直接验证。
电子显微镜和荧光显微镜是研究T. brucei2,21-24中糖酵解体动态的常用技术。这些方法耗时耗力、成本高昂，且难以应用于实时研究和高通量实验方案。为克服这一局限，一种用于哺乳动物和酵母系统中细胞器研究的荧光细胞器报告系统已被改造并应用于T. brucei12。
荧光细胞器报告系统已广泛应用于酵母、植物和哺乳动物细胞等高等真核生物中25-27。在这些系统中，荧光蛋白与一段可将蛋白靶向特定细胞器的氨基酸序列融合。通过检测荧光信号，可测量靶向蛋白的降解或合成过程，而细胞器组分的变化则反映为细胞荧光的变化。
当增强型黄色荧光蛋白（eYFP）的开放阅读框与II型过氧化物酶体靶向序列（PTS2）12融合时，PTS2eYFP蛋白可被导入成熟且具有导入能力的糖酵体中，其荧光可通过流式细胞术进行检测。糖酵体组分的变化会反映为细胞荧光的改变。该系统有助于解析调控环境诱导的糖酵体组分变化的分子机制。
本文描述了在PCF寄生虫中构建一种糖酵解体报告系统，并结合流式细胞术用于实时监测活体寄生虫中糖酵解体的动态变化，同时举例说明该系统如何被用于追踪不同环境下糖酵解体组成的变化。总之，糖酵解体的组成受细胞外葡萄糖浓度的影响，将对数期培养物转入新鲜培养基会触发糖酵解体组成的变化。该系统可经改造后用于研究锥虫及其他寄生虫中其他细胞器的动态行为。

<table><tbody><tr><td>腺苷</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A10781</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>L-丙氨酸</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A15804</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>L-精氨酸</td><td>CalBiochem</td><td>1820</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>对氨基苯甲酸</td><td>ICN Biomedicals</td><td>102569</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>基础伊格尔培养基维生素溶液（100倍浓缩）</td><td>Sigma</td><td>B6891</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>生物素</td><td>Fisher</td><td>BP232-1</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>VWR</td><td>BDH0224</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-100</td><td>Cytomix 成分</td></tr><tr><td>EZNA 凝胶回收试剂盒</td><td>Omega Biotek</td><td>D2500-01</td><td>DNA 纯化</td></tr><tr><td>研究级血清</td><td>Fisher</td><td>03-600-511</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>叶酸</td><td>ICN Biomedicals</td><td>101725</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>盐酸氨基葡萄糖</td><td>ICN Biomedicals</td><td>194671</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>GIBCO</td><td>15023-021</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>CalBiochem</td><td>3520</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Acros Organics</td><td>Ac15892-0010</td><td>冻存液</td></tr><tr><td>Graces 昆虫细胞培养基粉末</td><td>GIBCO</td><td>11300-043</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>血红素</td><td>MP Biomedicals</td><td>194025</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>鸟苷</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A11328</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>MP Biomedicals</td><td>194025</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td>Cytomix 成分</td></tr><tr><td>L-甲硫氨酸</td><td>Fisher</td><td>BP388-100</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>MEM 氨基酸溶液（50倍浓缩）</td><td>Cellgro</td><td>25-030-CI</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>非必需氨基酸混合液（100倍浓缩）</td><td>Lonza</td><td>13-114E</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>最低必需培养基（1倍）含 L-谷氨酰胺</td><td>Cellgro</td><td>10-0010-CM</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher</td><td>BP308-500</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Fisher</td><td>S233-500</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>L-苯丙氨酸</td><td>ICN Biomedicals</td><td>102623</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>Cytomix 成分</td></tr><tr><td>无水磷酸氢二钾</td><td>Fisheer</td><td>P290-212</td><td>Cytomix 成分</td></tr><tr><td>L-脯氨酸</td><td>Fisher</td><td>BP392-100</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>L-丝氨酸</td><td>Acros Organics</td><td>56-45-1</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Acros Organics</td><td>113-24-6</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>L-牛磺酸</td><td>TCI America</td><td>A0295</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>L-苏氨酸</td><td>Acros Organics</td><td>72-19-5</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>L-酪氨酸</td><td>ICN Biomedicals</td><td>103183</td><td>SDM79 成分</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Cycle Pure 试剂盒</td><td>Omega Biotek</td><td>D6492-02</td><td>DNA 纯化</td></tr><tr><td>结合缓冲液</td><td>Omega Biotek</td><td>PDR041</td><td>DNA 纯化</td></tr><tr><td>SPW 洗涤缓冲液</td><td>Omega Biotek</td><td>PDR045</td><td>DNA 纯化</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell</td><td>Biorad</td><td>165-2660</td><td>锥虫转化</td></tr><tr><td>4 mm 电穿孔比色皿</td><td>VWR</td><td></td><td>锥虫转化</td></tr></tbody></table>

利用荧光蛋白监测非洲锥虫中糖酵体的动态变化

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei 是一种动质体科寄生虫，可引起人类非洲锥虫病（HAT），即昏睡病，以及牛的消耗性疾病——那加那病1。该寄生虫在哺乳动物宿主的血液和采采蝇传播媒介之间交替存在。许多细胞器的组成会随着这些不同的胞外环境条件而发生变化2-5。
糖酵体是一种高度特化的过氧化物酶体，其中区室化了参与糖酵解的多种酶。糖酵体的组成以发育依赖性和受环境调控的方式发生变化4-11。目前，研究糖酵体动态的最常用技术是电子显微镜和荧光显微镜；这些技术成本高、耗时且劳动强度大，难以适应高通量分析。
为了克服这些局限性，已建立一种荧光糖酵解体报告系统，该系统将增强型黄色荧光蛋白（eYFP）与过氧化物酶体靶向序列（PTS2）融合，从而引导融合蛋白进入糖酵解体12。当PTS2-eYFP融合蛋白被导入后，糖酵解体即呈现荧光。细胞器的降解与再循环会导致荧光信号减弱，该变化可通过流式细胞术进行定量检测。该方法可在无需固定、封片等复杂样品处理的前提下，实时分析大量细胞（每秒5,000个细胞）。此技术为快速检测细胞器组成在动态环境条件下的变化提供了有效手段。

在该系统中，观察到糖体组成随葡萄糖浓度变化而改变。当细胞在含葡萄糖的培养基中生长时，可观察到两种细胞群体：一种荧光强，一种荧光弱（图2A）。荧光弱的细胞含有未成熟的糖体，尚未导入PTS2eYFP；而荧光强的细胞则含有成熟与未成熟糖体的混合物12。当培养基中存在葡萄糖时，糖体蛋白的错误定位具有致死性15,28，且糖体蛋白的表达很可能与导入过程紧密偶联。这种严格的调控机制导致在细胞缺乏足够导入能力时，糖体蛋白的表达受到抑制，从而出现荧光弱的细胞。一旦糖体导入机制完全组装并具备功能，细胞便开始表达糖体蛋白，这些蛋白随后被导入糖体中，从而产生荧光细胞。在缺乏葡萄糖的培养基中，糖体蛋白的错误定位可被耐受15，双峰分布被单一的、荧光强度范围更广的峰所取代（图2B）。
该系统已被用于鉴定触发糖酵解体组成变化的条件。当含有约10%暗细胞的高密度培养物（图3A）转入新鲜培养基后，暗细胞比例会出现短暂上升（图3B</st...

利用电子显微镜和荧光显微镜等传统细胞生物学技术研究非洲锥虫中糖酵体的动态变化较为困难。为了观察细胞器的动态行为，已有研究结合使用荧光细胞器报告系统与流式细胞术，对活体寄生虫中糖酵体的实时动态进行监测。

布氏锥虫（Trypanosoma brucei）是一种动质体目寄生虫，可引起人类非洲锥虫病（HAT），即昏睡病，以及在家畜中导致消耗性疾病那加纳病（nagana）。

以下实验的总体目标是观察活细胞中糖体组分的实时变化。通过表达与过氧化物酶体靶向序列PTS2融合的荧光蛋白来实现这一目标。该融合蛋白被导入成熟的糖体中，使糖体成为具有荧光的细胞器。降解和再循环会导致荧光信号减弱，可通过流式细胞术进行监测。通过将细胞暴露于不同的环境条件下，可鉴定出触发糖链重塑的因素。结果显示，当细胞从营养贫乏培养基转移至营养丰富培养基时，细胞荧光发生变化，表明糖链组成会随环境变化而改变。因此，该技术相较于电子显微镜和荧光显微镜等现有方法的主要优势在于，能够对数千个细胞进行实时分析。本实验操作将由本实验室的研究生 Sarah Bauer 和本科生 Megan Conlan 演示。本实验所用的昆虫前循环型（procyclical form，PCF）寄生虫在 25 平方厘米的细胞培养瓶中培养，加入 10 毫升适宜培养基，在 27°C 及 5%CO₂ 条件下培养。本视频中不展示血浆 DNA 的制备过程，相关实验方案详见随附的手稿。开始此实验步骤时，将10微升无菌的纯化线性DNA加入400微升经滤膜除菌的细胞混合液中，使用流式细胞仪对细胞进行计数，并在800 ×g条件下离心15分钟，收集5千万至1亿个细胞。在室温下，用1毫升移液管吸弃上清液，将细胞沉淀重悬于450微升DNA与细胞混合液中。将含有细胞、DNA和细胞混合液的溶液转移至无菌的4毫升电转杯中。将qve放入电穿孔室中。选择指数衰减模式，并手动输入以下参数：电压1.5千伏，电容25毫法，电阻无限大，电极间距4毫米。脉冲结束后按一次脉冲按钮。将电穿孔杯从电穿孔仪中取出，并放回生物安全柜中。用移液器将10毫升SDM 79培养基加入一个新的无菌烧瓶中。将转化后的细胞转移至含有 SDM 79 的培养瓶中。在 27 摄氏度、5% CO2 条件下孵育细胞 24 小时，无需添加药物筛选。24小时后，加入G418、潮霉素和杀稻瘟菌素。将1毫升转染后的细胞加入含药物的9毫升SDM-79培养基中，然后将细胞放回培养箱。随后，每天通过流式细胞术对细胞进行分析，该步骤将在本视频的后续部分进行演示。当细胞呈现荧光且细胞密度达到每毫升1000万个细胞时，可制备用于长期保存的细胞冻存液。首先，通过向细胞混合液中加入等体积的100%甘油，并对溶液进行过滤除菌，制备冻存培养基。接着，将200微升冻存培养基加入含有800微升细胞的冻存管中，轻轻颠倒混匀。将冻存管置于两个泡沫塑料架之间，在零下80摄氏度条件下冷冻约24小时。待细胞完全冻结后，转移至液氮中。需注意，应在24小时后及时将细胞转入液氮，因为在零下80摄氏度条件下长期保存会导致细胞活力下降。解冻冻存细胞时，从零下80摄氏度冰箱中取出冻存管，在室温下解冻约10分钟。将9毫升含药物的SDM 79培养基移入一个新的无菌烧瓶中。将解冻的细胞加入该烧瓶中，通过将1毫升该培养物接种至含9毫升SDM 79培养基的新烧瓶中，传代细胞至1:10比例，以制备稀释分析用培养物，并将细胞密度调整为每毫升100,000个细胞，总体积为3毫升SDM 79培养基。在25毫升培养烧瓶中，细胞传代后立即测定荧光，随后在3小时和24小时再次测定。在开始稀释分析前仅传代一次细胞，对于观察糖体重塑至关重要。当细胞传代超过两代后，溶酶体的重塑将变得不可预测。在运行任何样本之前，应按照演示的方法对流路进行反向冲洗和清洗。此处，打开流式细胞仪并启动 C Flow plus 程序。将盛放SIP的纳米纯水管更换为一个空管。选择反向冲洗按钮。反向冲洗完成后。从移液器上取下微型离心管并丢弃。将含有1毫升新纳米纯水的新微型离心管放置到移液器上。在C Flow程序的运行限制下选择新的孔位。设置时间为两分钟。在流体选项中选择快速并运行。当两分钟的时间限制结束后，单击删除样本数据按钮。流式细胞仪设置完成后，即可进行细胞计数。将SIP上的水更换为待计数的样本。将运行时间限制设为30秒，流体速度设为快速，然后在第32次时间限制结束后选择运行。C Flow plus 将在上次运行中提供每微升的事件数。为测量荧光，将运行限制设置为 10,000 个事件和流体系统。为降低速度，请设置阈值。在初级阈值下，选择在 FSCH 上永久消除事件，并输入小于 30,000 的数值。单击应用，然后单击关闭；在其中一个新绘图窗口中选择直方图按钮，从下拉列表中选择 FSCA，然后选择 FL1A，该通道用于测量荧光。在 530 纳米波长处，选择运行。在完成所有培养物的荧光检测后，让清洗液流经流路系统两分钟，随后用水冲洗两分钟。开始数据分析时，在 C Flow plus 软件中选择“分析”选项卡，点击“直方图”按钮，创建一个新的图谱。选择 FSEA。将出现一个下拉列表。选择通道 FFL one a。选择一个孔进行分析，点击门控按钮，并为感兴趣的细胞群手动绘制门控。C Flow plus 将提供此门控内的细胞数量以及该图中流式细胞术分析结果的百分比，分析对象为在含葡萄糖培养基中培养的 PCF 细胞。SDM 79 显示出两个细胞群，一个荧光较强，另一个较弱。暗细胞含有未成熟的糖原区室，尚未导入荧光报告蛋白。而亮细胞则含有更成熟的糖原区室；当培养基中存在葡萄糖时，糖蛋白的错误定位具有致死性，因此糖蛋白的表达与导入必须受到严格调控。这一点体现在不存在荧光强度处于中间水平的细胞。在不含葡萄糖的 SDM 80 培养基中，糖蛋白的错误定位被容忍。双峰群体分布消失，出现具有中等荧光强度的细胞。该系统可用于鉴定触发糖基重塑的条件。当高密度培养物中含有约10%的暗细胞或传代至新鲜培养基时，左侧门内含有不成熟糖层的暗细胞比例会增加。24小时后，原始细胞群体的分布得以重新建立。此时，不成熟的糖层已含有将荧光蛋白导入过氧化物酶体所需的过氧化物酶体蛋白。进行此操作时，重要的是要避免长时间培养。经过两次传代后，应弃去培养物，并使用新的稳定八联管。本方案可用于鉴定能够触发糖基重塑的试剂和条件。完成此操作后，可进行其他检测，如Western印迹分析、荧光显微镜和电子显微镜观察，以更精确地回答糖蛋白表达、定位及形态学方面的变化。

using-fluorescent-proteins-to-monitor-glycosome-dynamics-african

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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