Name: 化疗引起的血管毒性 - 实时在体内船舶减值成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 48 s
Description: 学习使用纤维共聚焦荧光显微镜实时成像活体血管结构，通过尾静脉注射Fitz Dextrin示踪剂观察化疗药物诱导的血管收缩与通透性变化，该技术为评估化疗药物血管毒性提供了重要的在体分子成像平台。

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伦理声明：所有实验均经机构动物护理和使用委员会批准。动物护理遵循机构指南。ICR雌性小鼠（7 - 8周龄；&#160;25 - 30 g）饲养于特拉维夫大学萨克勒医学院的空调化、光照可控的动物设施中。实验结束时，动物通过麻醉过量实施安乐死。
1. 纤维共聚焦荧光显微镜（FCFM）校准
<ol>
	<li>打开设备电源。</li>
	<li>连接微探针（mini0/30）。</li>
	<li>根据制造商的说明对设备进行校准。</li>
</ol>
2. 成像用小鼠的制备&#160;
<ol>
	<li>麻醉&#160;通过皮下注射 Ketaset（100 mg/kg）和&#160;XYL-M2（6 mg/kg）。通过脚趾夹捏无反应确认麻醉效果。</li>
	<li>切开皮肤&#160;以下&#160;的&#160;腹股沟&#160;为了&#160;揭示&#160;股动脉血管。切开后，用生理盐水保持切口部位湿润。</li>
	<li>用装有温水（温度不烫手）的袋子（或手套）加热尾部约 30 秒。通过将针头（30 G，1/2 英寸）插入静脉，制备用于注射荧光素异硫氰酸酯标记的葡聚糖（FITC dextran，一种对比剂）以及生理盐水或化疗药物的静脉（IV）分流装置。&#160;的&#160;尾静脉，并连接1 ml注射器。通过注射生理盐水确保静脉通畅。 
	注：静脉注射 FITC 葡聚糖（高分子量；100 µl；10 mg/ml；2,000 kDa）&#160;通过FCFM促进股骨微血管系统的可视化。&#160;阿霉素（100 µl；8 mg/kg，Adriamycin）或生理盐水&#160;稍后也将进行&#160;通过预热的尾静脉进行静脉注射。</li>
	<li>将小鼠仰卧位固定于聚苯乙烯板上，使用外科胶带将小鼠固定在垫面上以维持其体位。</li>
</ol>
3. 多柔比星给药期间及给药后通过 FCFM 对股动脉血管进行成像&#160;或生理盐水
注意：本研究中使用的光纤共聚焦显微镜由两个单元组成：（1）微探头（mini0/30）；（2）激光扫描单元（LSU-488；波长488 nm）。
<ol>
	<li>使用 LSU 488 nm 波长激光进行所有延时分析。&#160; 
	注意：主单元检测器检测经过滤光（500 - 650 nm）的发射荧光。所获取的图像&#160;是&#160;之后重建并展示于&#160;a&#160;每秒12帧的速率。</li>
	<li>小心将注射器与针头分离，换上含有FITC葡聚糖的新注射器。静脉注射100 µl FITC葡聚糖。</li>
	<li>移位&#160;将微探针（mini0/30）移至合适的视野，并在调整z轴后固定，以获取相应图像。等待初始信号衰减，直至出现清晰且聚焦的信号。</li>
	<li>记录基础血流，进行短暂稳定期（约30秒）。随后将另一支含有阿霉素或生理盐水的注射器连接至针头，静脉注射100 µl阿霉素或生理盐水。</li>
	<li>持续监测注入的FITC-葡聚糖流动20分钟。在FCFM配套软件中，使用上方标尺上的直径按钮测量血管直径。&#160;和&#160;将它们分类为小型（&#60;15 µm）或大（&#62;15 µm</li>
	<li>以麻醉过量处死动物。</li>
</ol>

<ol><li>Chow, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthracyclines+cause+endothelial+injury+in+pediatric+cancer+patients%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Anthracyclines cause endothelial injury in pediatric cancer patients: a pilot study.</a> J Clin Oncol. 24 (6), 925-928 (2006).</li>
<li>Nuver, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+chemotherapy-induced+cardiovascular+changes+in+patients+with+testicular+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Acute chemotherapy-induced cardiovascular changes in patients with testicular cancer.</a> J Clin Oncol. 23 (36), 9130-9137 (2005).</li>
<li>Vos, F. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+effects+of+cytotoxics%3A+balance+between+desired+and+unwanted+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat+Rev%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell effects of cytotoxics: balance between desired and unwanted effects.</a> Cancer Treat Rev. 30 (6), 495-513 (2004).</li>
<li>Kerbel, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Accidental%27+anti-angiogenic+drugs.+anti-oncogene+directed+signal+transduction+inhibitors+and+conventional+chemotherapeutic+agents+as+examples.Eur%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer%22%5BJournal%5D)">'Accidental' anti-angiogenic drugs. anti-oncogene directed signal transduction inhibitors and conventional chemotherapeutic agents as examples.Eur.</a> J Cancer. 36 (10), 1248-1257 (2000).</li>
<li>Soultati, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+vascular+toxicity+from+chemotherapeutic+agents%3A+preclinical+evidence+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat+Rev%22%5BJournal%5D)">Endothelial vascular toxicity from chemotherapeutic agents: preclinical evidence and clinical implications.</a> Cancer Treat Rev. 38 (5), 473-483 (2012).</li>
<li>Tempelhoff, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+coagulation+during+adjuvant+epirubicin%2Fcyclophosphamide+chemotherapy+in+patients+with+primary+operable+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Blood coagulation during adjuvant epirubicin/cyclophosphamide chemotherapy in patients with primary operable breast cancer.</a> J Clin Oncol. 14 (9), 2560-2568 (1996).</li>
<li>Ben Aharon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxorubicin-induced+vascular+toxicity--targeting+potential+pathways+may+reduce+procoagulant+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Doxorubicin-induced vascular toxicity--targeting potential pathways may reduce procoagulant activity.</a> PLoS One. 8 (9), e7515(2013).</li>
<li>Laemmel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibered+confocal+fluorescence+microscopy+%28Cell-viZio%29+facilitates+extended+imaging+in+the+field+of+microcirculation.+A+comparison+with+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Res%22%5BJournal%5D)">Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy.</a> J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).</li>
<li>Al-Gubory, K. H., Houdebine, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+green+fluorescent+protein-expressing+cells+in+transgenic+animals+using+fibred+confocal+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of green fluorescent protein-expressing cells in transgenic animals using fibred confocal fluorescence microscopy.</a> Eur J Cell Biol. 85 (8), 837-845 (2006).</li>
<li>Bar-Joseph, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioimaging+as+a+novel+strategy+to+detect+doxorubicin-induced+damage+to+gonadal+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo bioimaging as a novel strategy to detect doxorubicin-induced damage to gonadal blood vessels.</a> PLoS One. 6 (9), e23492(2011).</li>
<li>Kaushal, V., Kaushal, G. P., Mehta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+toxicity+of+anthracyclines+on+cultured+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endothelium%22%5BJournal%5D)">Differential toxicity of anthracyclines on cultured endothelial cells.</a> Endothelium. 11 (5-6), 253-258 (2004).</li>
<li>Kim, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxorubicin-induced+platelet+cytotoxicity%3A+a+new+contributory+factor+for+doxorubicin-mediated+thrombocytopenia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Doxorubicin-induced platelet cytotoxicity: a new contributory factor for doxorubicin-mediated thrombocytopenia.</a> J Thromb Haemost. 7 (7), 1172-1183 (2009).</li>
<li>Walsh, J., Wheeler, H. R., Geczy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+tissue+factor+on+human+monocytes+by+cisplatin+and+adriamycin%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Modulation of tissue factor on human monocytes by cisplatin and adriamycin.</a> Br J Haematol. 81 (4), 480-488 (1992).</li>
<li>Kotamraju, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxorubicin-induced+apoptosis+in+endothelial+cells+and+cardiomyocytes+is+ameliorated+by+nitrone+spin+traps+and+ebselen.+Role+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Doxorubicin-induced apoptosis in endothelial cells and cardiomyocytes is ameliorated by nitrone spin traps and ebselen. Role of reactive oxygen and nitrogen species.</a> J Biol Chem. 275 (43), 33585-33592 (2000).</li>
<li>Vasquez-Vivar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+nitric+oxide+synthase-dependent+superoxide+generation+from+adriamycin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Endothelial nitric oxide synthase-dependent superoxide generation from adriamycin.</a> Biochemistry. 36 (38), 11293-11297 (1997).</li>
</ol>

评估化疗诱导的血管毒性具有挑战性，原因在于难以实时观察血管系统对刺激的动态反应。大量临床研究指出，多种化疗药物可直接造成血管损伤，但这种毒性的机制和特征仍有待阐明。我们已建立一种实时、 体内 用于评估化疗药物在小鼠中潜在血管毒性的分子成像平台，包含本文所述的光纤共聚焦荧光显微镜技术8-10这种高分辨率的小鼠分子成像技术适用于可视化动脉血流及血管结构，能够在同一动物体内长期实时监测治疗引发的并发症。我们评估了两类化疗药物：阿霉素（doxorubicin），已知其对内皮细胞具有毒性 体外 以及从用阿霉素处理的动物获得的组织中10-15以及紫杉醇作为对照化疗药物，后者在血管效应方面的既往证据非常有限。
FCFM 的激光扫描共聚焦技术有助于实时追踪荧光染料标记的深层组织，并生成活体血管的延时视频图像in vivo9。在本研究中，FCFM 被用于观察阿霉素（作为典型的血管毒性药物）对血管的急性效应。该效应在给予阿霉素后不久即开始出现，且与血管直径大小相关：血管直径越小，损伤...

临床证据表明，多种类型的化疗药物可引发一系列血管病理改变，表现为雷诺现象、高血压、心肌梗死、脑血管意外以及肝静脉闭塞病1,2。“‘偶然性’抗血管生成药物”是一个相对较新的术语，用于描述那些虽非为此目的而研发，但具有潜在抗血管生成作用的传统化疗药物3-5，这些药物最初的设计目标是尽可能减少对正常细胞的“连带损伤”，以清除肿瘤细胞3。已有临床研究通过血清生物标志物观察到，多种化疗药物具有血管毒性作用。其中包括烷化剂（如环磷酰胺）、铂类化合物（如顺铂）和蒽环类药物1,2,5-7。
急性心血管并发症可能由化疗诱导的血管毒性引起，可进展为动脉粥样硬化等慢性疾病，并导致远期血管相关发病率升高。然而，尽管临床证据不断积累，目前仍缺乏专门针对血管毒性机制的研究，因此有必要进一步阐明其确切的发病机制。
揭示化疗诱导的血管毒性的机制面临的主要挑战源于在活体（in vivo）条件下研究血管功能的复杂性。本文描述了一种在小鼠中实现高分辨率活体（in vivo）分子成像的技术平台，可用于捕捉血流动力学及血管特征。该平台有助于在相同个体中实时检测治疗直接引起的血管效应，并可在一段时间内对其进行动态追踪。

<table><tbody><tr><td>全身麻醉</td><td>Fort Dodge Animal Health, IA, USA 和 Biove Laboratories, 法国</td><td></td><td>100 mg/kg ketaset 和 6 mg/kg XYL-M2</td></tr><tr><td>脱毛膏（Veet）</td><td>ReckittBenckiser, 布里斯托尔, 英国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 G，1/2 英寸针头连接 1 ml 注射器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC 葡聚糖（10 mg/ml；分子量 2,000 kDa）</td><td>Sigma</td><td>FD2000S</td><td>100 &amp;mu;l 体积</td></tr><tr><td>多柔比星</td><td>Teva, 以色列</td><td></td><td>8 mg/kg，Adriamycin</td></tr><tr><td>紫杉醇</td><td>Taro, 以色列</td><td></td><td>1.2 mg/kg，Medexel</td></tr><tr><td>生理盐水</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

化疗诱导的血管毒性 - 实时监测 体内 血管损伤成像

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

某些类型的化疗药物可能会引起急性血管变化，这些变化可能逐渐发展为长期状况，从而增加患者发生血管相关并发症的风险。&#160;然而，尽管&#160;尽管临床证据日益增多，但关于血管毒性的明确研究仍然匮乏，因此一组异质性血管/心血管疾病的病因仍有待阐明。此外，潜在的血管毒性机制可能与化疗诱导的心脏毒性机制完全不同，后者主要与心肌细胞的直接损伤相关。我们已建立了一种实时的 体内 分子成像平台&#160;用于评估&#160;潜在的&#160;急性&#160;抗癌治疗的血管毒性
我们已建立一个平台 体内，高分辨率分子成像&#160;在小鼠中，&#160;适用于在有限空间器官内可视化血管系统，并在同一受试个体中观察参考血管，从而实现个体自身作为对照。给予多柔比星后，血管壁结构受损，提示一种独特的血管毒性机制，可能为靶器官损伤的早期事件。本文描述了基于光纤共聚焦荧光显微（FCFM）的成像方法，该技术为在活体动物中从细胞及亚细胞水平理解生理现象提供了创新手段。

体内 实时连续成像
本实验所使用的成像装置为一台高清光纤共聚焦显微镜，配备有探头，可用于观察血管系统及其对化疗等不同刺激的反应。该方法属于微创技术，尽管能够实现对深层血管或器官的成像，但仍需通过小切口插入探头。探头组件包含数万根光纤、显微镜光学元件以及一种专有的精密连接器。其示意图如图1所示。
股骨微血管成像
我们根据血管直径（小血管 &lt; 15 µm；大血管 &gt; 15 µm）对注射了FITC-葡聚糖的小鼠股动脉血管网络进行了分类。多柔比星可诱导小血管迅速发生血管收缩（2 - 5 分钟）。在给予多柔比星处理后8分钟，FITC-葡聚糖荧光信号完全消失（图2A e-g，箭头；视频1）。在若干小鼠中，多柔比星给药后数秒内，血管内的荧光信号减弱，同时血管周围区域的信号增强（图2B g，箭头）。这些结果表明血管通透性增加，导致高分子...

本文介绍了基于光纤共聚焦荧光显微技术（FCFM）的成像方法，该方法为在动物体内从细胞及亚细胞水平理解生理现象提供了一种创新模式。

某些类型的化疗药物可能会引起急性血管变化，这些变化可能逐渐发展为长期状况，从而增加患者发生……的风险

本实验的总体目标是利用高分辨率光纤共聚焦显微镜观察血管系统及其对各种刺激的反应。该目标通过以下步骤实现：首先校准显微镜，然后经静脉向动物注射荧光标记的葡聚糖（fitzy dextrin），以增强血管的可视化效果；随后，在实验处理期间及处理后，使用光纤共聚焦荧光显微镜实时成像血管。最终，这种活体分子成像平台可用于在动物模型中评估化疗药物等试剂潜在的血管毒性。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为系统的搭建和获取稳定的图像可能具有挑战性。本次操作将由来自实验室的博士后 Dr.Sef 进行演示。在准备小鼠进行成像之前，先打开光纤共聚焦荧光显微镜，并连接 mini zero 30 微探头。根据制造商的说明校准设备。当显微镜准备就绪后，将一只7至8周龄的雌性ICR小鼠仰卧固定在聚苯乙烯平台上，然后用手术胶带将小鼠固定在垫子上。接着，在腹股沟下方切开皮肤，暴露股动脉血管，并用生理盐水保持切口部位湿润。当尾静脉扩张后，使用红色灯照射尾部加热约10秒，将连接一毫升生理盐水注射器的27号半英寸针头插入其中一条静脉。注射生理盐水以确认静脉通畅。然后小心地将生理盐水注射器更换为含有10毫克/毫升Fitz Dextrin的注射器。接下来，向尾静脉注射 100 微升 Fitz Dextrin，然后将含有 8 毫克/千克多柔比星的注射器连接至针头。随后，在调整 Z 轴后，将 mini zero 30 微探头移至合适的视野位置，并将其固定在切口部位上方。该操作中最困难的部分是找到一个合适的视野，并确保探针固定到位，以保证在注射过程中动物和探针均不移动，或因动物呼吸导致探针松动。我们使用大量胶带固定探针。现在等待初始信号逐渐消失，直至出现清晰且聚焦的信号。在记录基线血流约32秒的稳定期后，通过尾静脉分流管注入100 µL处理剂。使用激光扫描单元在488 nm波长下连续监测注入的FITC标记葡聚糖血流10分钟。最后，在纤维瘤共聚焦荧光显微镜配套软件中，利用上方标尺的直径按钮测量血管直径。阿霉素在给药后两到五分钟内可迅速引起直径小于15微米的小血管发生血管收缩，并在八分钟时完全消失Fitz Dextrin的荧光信号。在此项代表性实验中，部分动物表现出血管内荧光信号减弱，同时血管周围区域即血管外周区域的信号增强。在这些小鼠给予阿霉素数秒后，再给予高分子量葡聚糖可导致血管通透性增加，从而引起信号从血管内渗漏至周围组织中。一旦掌握，该技术若操作得当，可在数分钟内完成。

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