测量球形细胞的渗透水渗透系数（P_f）：以分离的植物原生质体为例

以下实验的总体目标是通过测定植物原生质体的渗透水通透系数（即PF值），来了解水通道蛋白的功能。剪取一片不含轴向表皮的叶片组织，将其置于等渗溶液中。将组织片转移至酶解溶液中，在28摄氏度下孵育20分钟，随后转移至新鲜的等渗溶液中。

接下来，用剪去尖端的吸头收集含有原生质体的溶液。第二步，准备一个实验用样品室。使用硅脂将盖玻片固定在载玻片底部。

然后用带正电荷的胶水涂覆腔室底部，并向腔室内加入等渗溶液。将分离得到的原生质体加入腔室中，再将腔室轻柔地放置在显微镜载物台上。随后，将原生质体暴露于低渗溶液中，同时记录视频以捕捉其膨胀的时间过程。

接下来，通过包含曲线拟合程序的软件对膨胀的时间过程进行数值分析，以根据数值分析结果确定每个原生质体的渗透系数（PF），从而揭示例如不同水通道蛋白基因表达所引起的PF差异。该方法有助于回答细胞膜生理学领域中的关键问题，例如水通道蛋白功能的调控机制。尽管该方法可提供有关天然或经遗传修饰植物中水通透性的深入见解。

它还可应用于其他系统，例如暴露的感兴趣起始位点。在开始此操作之前，需准备好所需的等渗和高渗溶液，并验证其渗透压。使用渗透压计时，每种溶液的渗透压必须在目标值的3%范围内。

用约六滴等渗溶液填充一个10厘米的培养皿。剥离ABBA密封膜或取兔眼叶表皮，并将剥离的叶片切成约4毫米×4毫米的正方形小片。将小片放置在等渗溶液液滴上，使暴露的轴向侧面朝下并与溶液接触。

接下来，将5.7毫克酶混合物溶解于1.5毫升离心管中的165微升等渗溶液中，用移液器轻轻吹打约1分钟，直至完全溶解。在同一个培养皿中加入数滴类似的酶解溶液。将叶片小块转移至酶解溶液液滴中。

盖上培养皿，并用一圈封口膜密封盖子。将培养皿置于28摄氏度的水浴中漂浮孵育20分钟。20分钟后，用镊子向培养皿中再加入数滴等渗溶液。

用镊子夹住每片叶片的边缘，将其转移至新的等渗溶液液滴中，然后依次转移到第二个液滴中。用剪去尖端的100微升移液器吸头在第二个液滴中轻轻晃动叶片组织，以释放原生质体。将含有原生质体的液滴收集至1.5毫升离心管中。

通过将等渗溶液加入一根柱中，低渗溶液加入另一根柱中，以准备灌流系统。打开阀门，使部分低渗溶液流过管道，直至充满至入口歧管。确认无残留气泡后，关闭阀门。

对等渗溶液重复上述步骤。使用硅脂密封盖玻片，以在亚克力载玻片内形成一个腔室的底部，使腔室底部具有黏性以便原生质体附着；可用带正电荷的鱼精蛋白硫酸盐或聚-L-赖氨酸对盖玻片进行包被。用移液器吸头将这种黏附剂均匀涂布于盖玻片表面。

等待一到两分钟。用等渗溶液冲洗三到四次，并将残留的溶液甩去。用等渗溶液注满腔室。

然后用剪去尖端的移液枪头吸取一滴含有原生质体的溶液，加入到小室中。静置三到四分钟，使原生质体沉降。用透明盖片覆盖小室，盖片应接触溶液表面。

避免在下方滞留气泡。将载玻片轻轻放置在倒置显微镜的载物台上，并连接至灌流系统和泵，注意防止管道中产生气泡。开启等渗溶液流动，以每分钟1毫升的速度进行持续灌流。

为记录体积变化，应选择一个包含尽可能多的球形细胞且细胞轮廓在其最大周长处清晰对焦的视野。以每秒一帧或1赫兹的速率，对选定的静止原生质体录制第62段视频。录制开始时，先用等渗溶液冲洗15秒，随后切换至高渗溶液持续45秒。

将视频以 Tiff 格式保存。为分析细胞膨胀的一系列图像，请使用 ImageJ 软件中的 Image Explorer 和 protoplasts analyzer 插件。启动 ImageJ 后，要打开视频，请在 ImageJ 面板上单击“文件”，然后依次在下拉菜单中选择“导入”，再选择“Image Explorer”。

高亮选中的视频。右键点击，然后左键点击。点击原生质体分析器。

在第一张图像上，使用鼠标在选定的原生质体周围绘制圆形，然后单击“确定”。在随后出现的检测参数表格中，启动原生质体检测算法，单击原生质体图像顶部面板中的“局部”。

然后进行处理。在下拉菜单中，观察整个视频中所选原生质体周围的绿色圆圈。使用底部的滑块，将结果保存到 Excel 文件中。

分析以逐帧方式进行。因此，当存在多个细胞时，需要进行排序，以区分属于每个细胞的曲线。此处展示了三个时间过程在排序前后的 Excel 表格，其中面积值已从像素转换为平方微米。

每次的时间过程随后导出为单独的文本文件。开始此操作时，将腔室连接至灌流系统和泵，并开启示踪染料流动，以维持每分钟一毫升的恒定灌流速率，以每秒一帧的速率记录62秒的视频。先用示踪染料记录15秒，然后切换至高渗溶液持续45秒，随后停止记录。

用指示剂冲洗。至少再灌注30秒。在开始新的录像记录之前，保存5到6个录像用于分析。

为了获得指示剂染料透射率变化的平均时间过程，启动 Image J 并点击文件。然后打开并浏览至视频文件。对于每个视频，在视频第一帧图像的任意位置绘制一个 10 像素宽的垂直矩形，然后点击 Image J 主面板上的图像。

然后在下拉菜单中点击裁剪。为将60帧图像排列成一行，点击图像，随后依次在下拉菜单中展开堆栈并创建拼接图。在整行图像的任意位置绘制一个像素高的水平矩形，然后点击Image J主面板中的分析。

接下来，点击“绘制轮廓”。在下拉菜单中，将透射率数据列表复制到 Excel 文件中。对来自指示剂染料冲洗 Sero 视频的透射率时间过程进行平均。

通过将图像序列号乘以 0.1 来生成实时基线。将平均时间过程保存到文本文件中，以计算渗透压时间过程的各个参数。使用可获取的 MATLAB 拟合程序 PF fit。

免费使用。下载和使用本程序的详细信息请参见方案文本。在指示符拟合面板中。

导入指示剂染料透射率的平均时间过程数据。手动输入当前实验参数，以及用于描述指示剂染料浓度时间过程的参数的初始估计值。也可修改这些参数。点击“运行”以查看指示剂DAI浓度及模拟浴液渗透压的时间过程曲线图。

准确拟合数据对于确定水渗透系数至关重要。切换到体积拟合面板，选择导入该区域的数据文件。

选择最后一个合适的指示器作为参数来源。选择模型类别，从二类开始。

需要初始化PF参数中的慢速PF和延迟，例如如图所示，但也可使用其他数值。勾选所有三个待拟合参数的复选框。点击运行。

然后目测中间结果，并根据需要调整延迟参数和记录长度。检查结果图以评估拟合效果、质量，并记录拟合误差。将初始参数逐个改变数倍，然后重新运行。

重复此步骤数次，每次使用不同的初始化参数组合，以获得最低的拟合误差值，从而确定水渗透系数（pf），并比较不同水通道蛋白的活性。分别从中国台湾兔眼草叶片中分离出原生质体，并分别转化含有来自兔眼草、opsys 和玉米水通道蛋白基因的三种基因构建体。通过共转染编码增强型绿色荧光蛋白的载体对原生质体进行标记。记录每个细胞在低渗刺激下细胞体积变化的时间过程，以及低渗刺激期间浴液渗透浓度变化的时间过程，由此计算出每个细胞的 pf 值。

通过使用 PF FIT 程序，观察到转染了三种水通道蛋白中任意一种的原生质体，其 PF 值均显著高于仅转染 GFP 的对照细胞。一旦掌握该技术，若操作得当，可在数个实验日内完成对数十个细胞的分析。观看本视频后，您应能够充分理解如何在分离的原生质体或其他经低渗实验处理的特定细胞中测定 SMO 水通透性。

如有其他疑问，请随时与我们联系。