在实时的间皮细胞卵巢癌球体附件和入侵评估
May 20th, 2014
卵巢癌细胞侵入的腹膜间皮衬里是一个动态过程，随着时间的推移。利用实时分析器，卵巢癌细胞中的球状体，间皮细胞共培养模型的侵袭能力可以量化在延长的时间段，提供见解因子调控的转移过程。
该程序的总体目标是快速实时量化小行星间皮细胞共培养模型中卵巢癌细胞的侵袭转移。这是通过首先通过在甲基纤维素中的非贴壁条件下培养细胞，从细胞系中产生卵巢癌来实现的。第二步是准备实时细胞分析仪，CIM 板，通过用基质胶编码两个腔室的上腔来模拟位于腹膜腔间皮和间皮衬里本身下方的基底膜。
接下来，收获卵巢癌类固醇并添加到实时分析仪板孔的上腔室中。最后一步是编程并启动实时细胞分析仪，该分析仪将在较长的分析时间内以预定义的时间间隔定期获取读数。最终，获得的结果描述了连续侵袭过程，用于确定在卵巢癌细胞侵入细胞和基质屏障时调节卵巢癌细胞的关键因素。
与现有方法（如癌细胞侵袭的标准 transworld 测定法）相比，该技术的主要优点是这种方法允许在较长时间内连续测量癌细胞侵袭。与不能完全捕捉卵巢癌转移的动态性质的单终点检测不同，尽管这种方法用于提供对卵巢癌的见解，但也可用于研究不同类型的转移过程，例如乳腺癌或癌细胞通过内皮层的形成。同样，它可用于研究正常细胞侵袭，例如胚胎植入过程中滋养层侵袭，以制备用于荧光细胞标记的卵巢癌细胞。
首先以 75% 的 co fluness 收获细胞，然后以每毫升 100 万个细胞的最终浓度复苏，将细胞悬浮在每 0.1%BSA 的 1 毫升预热 PBS 中每孔添加最佳数量的类固醇并小心处理类固醇对于该程序的成功至关重要。接下来，向细胞中加入 2 微升 5 毫摩尔的细胞痕量 CSFE 溶液原液，终浓度为 10 微摩尔，并在 37 摄氏度下孵育 10 至 15 分钟在水浴中，用 1 毫升含有 10% FBS 的冰冷培养基淬灭反应，并通过离心重新沉淀。雷乌斯。在 10 毫升适当的预热生长培养基中，将细胞接种到 75 平方厘米的过滤瓶中，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳下培养，直到荧光标记水平足以检测。
通过测量适合每种细胞系的培养基体积来开始此过程，该体积为 15 毫升减去生成 sphe 所需的细胞体积。向培养基中加入 3 毫升甲基纤维素储备液，使最终甲基纤维素浓度达到 20%，然后轻轻倒置充分混合。将 300， 000 个细胞添加到含甲基纤维素的培养基中，并通过轻轻倒置移液管将 150 微升细胞甲基纤维素培养基混合物彻底混合到 96 孔凹底培养板的每个孔中。
这将导致每孔总共有 3000 个细胞在 37 摄氏度、5% 二氧化碳下培养 1 到 4 天或直到形成均匀的 PHE。通常每孔观察到一种类固醇，实时细胞分析仪或 RTCA 细胞侵袭测定使用 16 孔 RTCA 双腔 CIM 板。一次以四个孔为一组工作，向板上腔的每个孔中加入 50 微升基质，以确保覆盖总表面积。
立即但缓慢地去除 30 μL 基质，以去除多余的液体。将板在 37 摄氏度下孵育 4 小时，然后在组织培养箱中使用。4 小时后，向上腔室添加 30 μL 适合每种癌细胞系的无血清培养基，以及 160 μL 含或不含血清的培养基。
根据下腔室的实验设计，通过将下腔室卡入上腔室来组装 CIM 板，并在 37 摄氏度的培养箱中平衡。在组织培养箱中放置 1 小时，打开 RTCA 程序并选择布局选项卡。突出显示所有实验孔，右键单击孔，然后选择 Turn on wells（打开孔）。
然后填写实验条件并根据需要出售名称。要向程序添加步骤或子步骤，请选择 schedule 选项卡，然后右键单击 add a step。第一步是预编程的背景扫描，它会自动合并到程序中。
选择添加步骤后，为 RTCA 程序的第 2 步输入所需的程序详细信息，该程序将记录 LP 9 人间皮细胞单层建立期间的读数。通过选择 interval 选项卡并输入 15 分钟来添加阻抗读数之间的时间间隔。通过选择 duration 选项卡并输入介于 12 到 24 小时之间的时间，以添加实验持续时间。
后续步骤的添加方式相同。RTCA 程序的第 3 步将指示仪器在 frid 侵袭期间获取读数。在 interval 选项卡下输入 5 分钟，在 duration 选项卡下输入 48 小时。
在菜单栏上选择 plate 并保存。要开始此过程，请将 CIM 板放入 RTCA 仪器中，然后打开之前保存的程序。在菜单栏中选择 execute（执行），然后开始自动执行背景扫描。
背景扫描后，从仪器中取出 CIM 板，并将其放入组织培养罩板中。50， 000 LP 9 个细胞悬浮在 160 μL 无血清培养基中，进入每个 CIM 板的上腔室。将板放入 RTCA 仪器中，每 15 分钟读取一次读数，而 LP 9 单层在第二天过夜建立，在无菌条件下从 1 毫升移液器吸头的顶部切下一毫米，并用它轻轻地取回每个细胞系的每个孔的内容物。
在无菌管式离心机中混合 10 个类固醇。类固醇在 120 GS 下放置 8 分钟，然后通过轻轻抽吸去除含甲基纤维素的培养基。用 PBS 离心机再洗涤两次，在 120 GS 下使用 8 分钟，每次洗涤后使类固醇沉淀。
对于每个实验井，Resus 在 160 微升不含 PBS 的培养基中总共花费 10 种类固醇。通过从菜单栏中选择 execute 并选中 pause 来暂停 RTCA 实验。从仪器中取出 CIM 板，并将其放入组织培养罩中。
从每个孔中吸出培养基，并用含有类固醇的培养基替换。将板放回 RTCA 仪器。从菜单栏中选择 execute 并选中 abort step。
程序将自动进入下一步。要恢复实验，请从菜单栏中选择 execute 并选中 start continue。RTCA 计划的第三步将在本实验中启动两种上皮性卵巢癌细胞系 OVCA 4 33 和 OVCA 4 29 以及一种卵巢颗粒细胞肿瘤系。
KGN 用于在过夜培养后生成类固醇，U 型底驻留在含甲基纤维素的培养基中。所有三种细胞系都形成了直径约为 400 至 500 微米的致密类固醇结构。底部面板显示了在单层规模下生长的匹配细胞系。
条形一旦形成，代表 100 微米。收获类固醇并接种在 R-T-C-A-C-I-M 板中的 LP 九间皮细胞单层顶部。定期在相差显微镜下或荧光显微镜下拍摄平行培养物的图像，以帮助解释 RTCA 数据。
评估癌细胞系侵袭的基底层以及化疗吸引的诱导侵袭都是有益的。在这个例子中，通过向上和下腔室添加无血清培养基或 SFM 来测量基础侵袭性。含有 10% FBS 的完全培养基，其中含有许多潜在的化疗引诱剂，用于检查化疗引诱剂诱导的侵袭。
此处显示的是 kgn 细胞和 LP 九间皮细胞之间细胞侵袭比较的代表性结果。在 A CIM 板的底室中进行有和没有 FBS 的 RTCA 侵袭测定。结果显示为在 24 小时时间点和整个两天测定期间来自一式三份孔的平均阳性减去 SD 细胞指数。
这些结果证实，在基础或化学引诱剂诱导的条件下，LP 9 细胞在两天内是微创的，因此是与卵巢癌细胞共培养测定的良好细胞类型。相比之下，KG 和卵巢癌类固醇表现出侵入化疗引诱剂的能力。该图显示了在为期两天的测定中 24 小时内描绘的 K-G-N-O-V-C-A 4 29 和 OVCA 4 33 细胞系的侵袭能力比较结果。
所有三种细胞系都表现出侵入化疗引诱剂的能力，如细胞指数增加所示。细胞系表现出相似的侵袭率，如曲线的平行线斜率所示。然而，OVCA 4 29 曲线表现出更高的上 asim tote，这表明与其他细胞系相比，最大侵袭水平更高。
相比之下，所有细胞系的基础侵袭水平都很低。此外，细胞系在侵袭开始的时间上表现出差异，这通过对 2.5 小时时间段内的侵袭数据进行更详细的分析所显示。KGN 细胞快速侵入细胞和基质屏障，而 OVC 4 33 和 OVC 4 29 细胞侵入的时间分别长 3 倍和 5 倍。
重要的是，它们在入侵开始时的行为并不能预测它们的整体入侵能力。这表明癌细胞系的内在能力不同，但也可能表明不同的因素调节类固醇的早期和晚期侵袭行为。一旦掌握，这项技术就很容易适应研究腹膜微环境中影响转移行为的各种信号分子和细胞通路。
这可以通过向孔的底部或顶部腔室添加外源性生长因子、细胞因子或抑制剂来实现。或者，您可以对癌细胞本身或腹膜靶细胞进行基因作。
概述
本研究重点在于利用实时分析仪量化卵巢癌细胞侵入腹膜间皮层。该方法允许持续测量癌细胞的侵入，提供关于转移过程随时间变化的见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 卵巢癌研究
- 细胞侵入动力学
- 转移模型
背景
- 卵巢癌转移涉及与腹膜内层的复杂相互作用。
- 传统的检测方法往往无法捕捉癌细胞侵入的动态特性。
- 实时分析提供了侵入过程的更准确表示。
- 该方法也可以适用于研究其他转移过程。
研究目的
- 开发一种实时量化卵巢癌细胞侵入的方法。
- 识别调控卵巢癌细胞转移行为的关键因素。
- 加深对癌细胞与间皮层相互作用的理解。
所用方法
- 在非黏附条件下从细胞系中生成卵巢癌细胞。
- 使用CIM板准备实时细胞分析仪。
- 持续监测细胞在延长时间内的侵入。
- 应用荧光标记用于细胞追踪。
主要结果
- 成功实时量化卵巢癌细胞的侵入。
- 识别影响侵入动力学的关键因素。
- 证明该方法适用于其他癌症类型。
- 加深对卵巢癌转移过程的理解。
结论
- 实时分析方法提供了关于癌细胞侵入的宝贵见解。
- 这种方法可以改善各种转移过程的研究。
- 未来应用可能扩展到其他类型的癌症和正常细胞侵入研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables real-time, quantitative assessment of ovarian cancer spheroid invasion through mesothelial and matrix barriers, addressing a critical gap in modeling peritoneal metastasis. By capturing dynamic invasion kinetics over extended periods, it provides predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for therapeutic candidates. The approach supports early discovery decisions by identifying factors regulating metastatic behavior, thereby informing portfolio prioritization and reducing late-stage biological risk in ovarian cancer drug development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying spheroid attachment and invasion dynamics in a disease-relevant microenvironment.
- Operational Value: Enables functional validation of targets involved in peritoneal metastasis through continuous, real-time readouts.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by distinguishing early versus late invasive behaviors across cell lines.
- Operational Value: Facilitates target confidence by correlating molecular perturbations with changes in invasion kinetics over time.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated spheroid-mesothelial co-culture systems for reliable compound screening against invasion phenotypes.
- Operational Value: Standardizes assay conditions using real-time cell analyzer platforms to ensure reproducibility across screening campaigns.
- Scientific Value: Generates quantitative, time-resolved dependent variable measurements (cell index) that enable dose-response and temporal profiling.
- Operational Value: Enhances screening readiness and scalability by automating data collection over 12–48 hour periods without manual imaging.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by modeling the peritoneal microenvironment encountered by ovarian cancer cells in vivo.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation by using human mesothelial cells and clinically relevant cell lines.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by identifying compounds that inhibit invasion toward chemoattractants.
- Operational Value: Enables mechanistic focus on predictive de-risking when studying pathway-specific regulators of spheroid behavior.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, specifically supporting ovarian cancer metastasis modeling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring how genetic or pharmacological interventions affect spheroid invasion over time.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via real-time cell index readouts that reflect dynamic invasion processes.
- Analytics: Provides statistical outputs (e.g., slope, maximal cell index, time-to-onset) that enable comparison of invasive capacity across conditions and cell lines.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through use of human mesothelial monolayers and extracellular matrix barriers mimicking the peritoneal cavity.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for studying metastatic mechanisms across cancer types beyond ovarian cancer, such as breast or trophoblast invasion.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in metastasis models.
- Operational Value: Improves standardization and reproducibility through automated, label-free impedance-based measurements.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decisions by quantifying invasion kinetics, enabling capital-efficient prioritization of anti-metastatic candidates.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement by identifying compounds that block invasion toward peritoneal chemoattractants.
Implementation Considerations
- Requires expertise in spheroid culture, real-time cell analyzer operation, and co-culture setup.
- Dependent on access to RTCA instrumentation, CIM plates, and extracellular matrix components like Matrigel.
- Necessitates cross-team standardization of spheroid size, plating density, and assay duration for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying the model to different cancer types or normal cell invasion systems.
- Limited by the need to optimize steroid harvest and labeling procedures to avoid aggregation artifacts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:05
Optional Fluorescent Cell Labeling Method
3:24
Generation of Spheroids in Methylcellulose
4:28
Real Time Cell Analyzer (RTCA) Cell Invasion Assay
5:46
Programming the RTCA Instrument
7:25
Generation of LP9 Monolayer and Measurement of Spheroid Invasion
9:49
Results: Real Time Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Invasion
13:42
Conclusion
