Name: 在实时的间皮细胞卵巢癌球体附件和入侵评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-20T19:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: 了解如何使用实时细胞分析仪定量评估卵巢癌细胞对间皮细胞的侵袭能力。该方法通过CIM板连续监测细胞侵袭动态，为研究卵巢癌转移机制提供精确数据。

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本工作获得了CASS基金会科学与医学资助（MB）；国家卫生 &amp;澳大利亚医学研究理事会项目资助（KLS，338516）；以及维多利亚州政府运营基础设施支持计划（澳大利亚）。

1. 细胞、培养基和试剂的准备
<ol>
	<li>含甲基纤维素培养基的制备
	<ol>
		<li>在250 ml锥形瓶中，将1.5 g甲基纤维素溶解于100 ml无菌杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）（无添加剂）中。</li>
		<li>将溶液置于微波炉中低温加热5分钟；注意避免沸腾溢出。</li>
		<li>当甲基纤维素粉末部分溶解后，加入一个洁净的磁力搅拌子，并添加培养基使总体积达到125 ml。</li>
		<li>混合、倒置并在室温下搅拌1.5小时，随后在4 °C下继续搅拌过夜。</li>
		<li>将溶液等量分装至四个50 ml离心管中，在2,300 × g条件下离心1.5小时。</li>
		<li>收集澄清且高度黏稠的上清液（约为原体积的90–95%），分装至无菌50 ml离心管中，于4 °C保存，可保存长达3个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞的培养与标记
	<ol>
		<li>将卵巢癌细胞系在适当的生长培养基中以单层形式培养，置于37 °C、5% CO2的组织培养孵箱中（KGN细胞使用DMEM17，OVCA429和OVCA433细胞系使用MCBD110:M19918），并补充10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素。</li>
		<li>将LP9人源间皮细胞在含15% FBS、10 ng/ml表皮生长因子（EGF）和400 ng/ml氢化可的松的M199:Hams F12培养基中，于37 °C、5% CO2的孵箱中培养。</li>
		<li>将细胞接种于所需规格的培养瓶中，培养至约75%汇合度。使用0.05%胰蛋白酶/EDTA进行消化收获细胞，于186 × g离心5分钟，并用PBS洗涤细胞沉淀两次。</li>
		<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可选的荧光细胞标记方法
	<ol>
		<li>将癌细胞重悬于1 ml预温的PBS/0.1% BSA中，终浓度为1 × 106 个细胞/ml。</li>
		<li>向细胞中加入2 μl&#160;5 mM储备液的Cell Trace CSFE溶液（或其他适合长期保留的细胞标记物），使终浓度为10 μM，在37 °C水浴中孵育10–15分钟。</li>
		<li>加入含10% FBS的1 ml冰浴培养基以终止反应，并通过离心重新收集细胞沉淀。将细胞重悬于10 ml相应的预温生长培养基中（见步骤1.2.1）。</li>
		<li>将细胞接种至75 cm2滤帽培养瓶中，在37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
		<li>在荧光显微镜下观察细胞，确认荧光标记水平足以被检测。当细胞达到约75%汇合度时，按照上述步骤1.2.3和1.2.4的方法进行收获和计数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 在甲基纤维素中生成球状体
<ol>
	<li>根据第1部分提供的卵巢癌细胞，计算生成球状体所需的细胞体积（每个完整的96孔板实验共需300,000个细胞）。注意：若使用与本文不同的细胞系，则可能需要针对各细胞系优化生成均一球状体所需的细胞密度。</li>
	<li>为计算甲基纤维素培养基中细胞的稀释度，首先从15 ml中减去所需细胞体积（步骤2.1）。</li>
	<li>将3 ml甲基纤维素储存液（终浓度为20%甲基纤维素）加入适量的培养基中，培养基体积等于15 ml减去细胞体积，并通过轻柔颠倒充分混匀。</li>
	<li>将300,000个细胞加入含甲基纤维素的培养基中，并通过轻柔颠倒充分混匀。</li>
	<li>取150 μl细胞/甲基纤维素/培养基混合液（每孔共含3,000个细胞）加入96孔圆底培养板的每个孔中，在37 °C、5% CO2条件下培养1至4天，直至形成均一的球状体（通常每孔可见1&#160;个球状体）。</li>
</ol>
3. RTCA 细胞侵袭实验
注意：阻抗读数以细胞指数（Cell Index, CI）表示，CI 是一个无量纲参数，代表所测细胞阻抗的相对变化，反映细胞状态。进行分析时，将数据导入电子表格（如 Microsoft Excel）中。
<ol>
	<li>培养板准备
	<ol>
		<li>以每次处理4孔为一组，向16孔RTCA CIM板的上室每孔加入50 μl基质（用无血清培养基按1:10稀释），确保完全覆盖整个表面区域。立即但缓慢地移除30 μl基质，以去除多余液体。</li>
		<li>将板置于37 °C组织培养孵育箱中孵育4小时，备用。</li>
		<li>向上室每孔加入30 μl适用于各癌细胞系的无血清培养基（SFM），向下室每孔加入160 μl含或不含血清的培养基（根据实验设计确定）。</li>
		<li>将下室与上室卡合组装成完整的CIM板，并在37 °C组织培养孵育箱中平衡1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RTCA仪器程序设置
	<ol>
		<li>打开RTCA程序，选择“Layout”标签页，选中所有实验孔。</li>
		<li>右键点击孔位，选择“Turn on wells”；然后根据需要填写实验条件和细胞名称。</li>
		<li>如需添加步骤或子步骤，请选择“Schedule”标签页，右键点击“Add a step”。第一步为预设的背景扫描，一旦选择“Add a step”后将自动纳入程序中。</li>
		<li>输入RTCA程序第二步所需的程序参数，该步骤用于记录LP9单层细胞形成过程中的读数。通过选择“Interval”标签并输入“15 min”来设定阻抗读数的时间间隔；通过选择“Duration”标签并输入12–24小时之间的时间值来设定实验持续时间。</li>
		<li>如需添加后续步骤，请选择“Schedule”标签页，右键点击“Add a step”，并按上述方式输入新增步骤的详细信息。RTCA程序的第三步将指导仪器在类球体侵袭过程中进行读数，请在“Interval”标签下输入“5 min”，在“Duration”标签下输入“48 hr”。</li>
		<li>在菜单栏中选择“Plate”，并保存设置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LP9单层细胞的建立及类球体侵袭的测量
	<ol>
		<li>将CIM板放入RTCA仪器中，打开上述第3.2步的程序。在加细胞前，从菜单栏选择“Execute”，然后点击“Start”。系统将自动执行一次背景扫描（即RTCA软件指令中的第一步）。</li>
		<li>背景扫描完成后，将CIM板从仪器中取出，置于组织培养超净台内。</li>
		<li>将50,000个LP9细胞悬浮于160 μl SFM中，接种至每个CIM板上室孔中。</li>
		<li>将板放回RTCA仪器中，在LP9单层细胞过夜形成期间，每15分钟采集一次读数（对应RTCA程序的第二步）。</li>
		<li>收集上述第2步“在甲基纤维素中生成类球体”中制备的癌细胞类球体。
		<ol>
			<li>无菌操作下，剪去1 ml移液枪头顶部约1 mm，用于轻柔吸取每孔内容物，转移至无菌离心管中.</li>
			<li>以120 × g离心8分钟收集类球体，并用移液枪小心吸除含甲基纤维素的培养基。</li>
			<li>用PBS洗涤类球体两次，每次洗涤后均以120 × g离心8分钟，使类球体沉淀。</li>
			<li>对每个实验孔，将总共10个类球体重悬于160 μl不含FBS的培养基中。</li>
			<li>在菜单栏中选择“Execute”，勾选“Pause”，暂停RTCA实验。将CIM板从仪器中取出，置于组织培养超净台内。吸去各孔中的培养基，替换为含类球体的培养基（每孔160 μl，含10个类球体），或为仅含LP9细胞的对照孔更换新鲜培养基。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将板放回RTCA仪器中。从菜单栏选择“Execute”，勾选“Abort step”，程序将自动进入下一步。要恢复实验，请从菜单栏选择“Execute”，勾选“Start/Continue”，RTCA程序的第三步将开始运行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析
	<ol>
		<li>为评估类球体细胞的侵袭能力，将各时间点卵巢癌细胞系的读数减去仅含LP9单层细胞的对应读数。</li>
		<li>绘制“类球体侵袭”曲线时，将所有数值归一化至类球体加入板时的时间点，即将该时间点设为“0”。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

开放获取费用由 ACEA Biosciences, Inc. 和 MIMR-PHI 医学研究所支付。

侵袭性卵巢癌细胞在腹膜表面与多种细胞类型相互作用，包括成纤维细胞、脂肪细胞和间皮细胞，癌细胞与腹膜细胞之间的双向通讯被认为在推动转移过程中发挥关键作用2一旦掌握，本文所述方案可轻松适用于腹膜微环境中这些相互作用的研究， 例如通过向CIM板孔的上室或下室添加外源性细胞因子、生长因子或特异性抑制剂，或对癌细胞或腹膜细胞系进行遗传学操作来实现。此外，该方法还可联合恶性腹水中新鲜分离的原代卵巢肿瘤细胞和/或原代腹膜细胞使用，以直接揭示调控腹膜腔内转移病灶形成的调节信号及细胞间相互作用2.
使用RTCA仪器测量单个细胞或球状体的侵袭能力，相较于传统的单终点检测和延时成像分析具有多项优势。RTCA仪器可在数小时至数天的实验过程中，按预设时间间隔连续、动态地监测细胞侵袭情况，从而能够确定侵袭速率随时间的变化，克服了单终点检测的局限性。例如，在单一时间点分析不同癌细胞系的侵袭数据时（图2), 例如，3小时，可能导致错误地得出KGN和OVCA433细胞比OVCA429细胞更具侵袭性的结论。该技术的另一优势在于RTCA仪器可检测电阻抗的变化，这意味着实验无需使用外源性标记物对细胞进行标记，从而避免对标记物可能对细胞表型或功能产生的非预期影响。这一点在研究来源于恶性腹水的原代卵巢癌细胞时尤为重要，因为必须尽可能减少对这些细胞的操作，以避免引入不能真实反映其原有分子和表型特征的变化 体内 自然2此外，使用RTCA仪器能够实时收集定量数据，不仅避免了与延时显微镜相关的时间消耗型分析，还可快速确定实验优化的关键时间窗口。这在比较多种因素对类球体侵袭的影响时尤为有用，因为不同因素可能在不同时间点发挥最大效应，或随时间呈现出显著差异的作用模式。
尽管本方案可进行修改（例如，使用不同的细胞外基质（ECM）、不同的癌细胞系或不同的靶细胞时，若进行此类实验，需注意各种实验条件必须首先经过优化。例如，在开展类球体侵袭研究之前，应通过单层培养中的细胞数量滴定实验，确定每孔细胞侵袭小室（CIM板）中的最佳癌细胞数量。&#160;每孔最佳类球体数量的确定基于此分析。例如，在本方法中，生成的类球体每个约包含 3,000 个细胞。如果初始细胞数量滴定结果显示，单层培养中 30,000 个细胞在侵袭分析中检测效果最佳，则每孔 CIM 板加入 10 个类球体。此外，在进行共培养实验时，重要的是需单独研究“靶”细胞单层的行为，以确定这些细胞本身是否具有侵袭性，因为这可能干扰实验结果。在本示例中，将癌类球体接种于 LP9 细胞单层之上，下层孔中分别添加或不添加 FBS 作为趋化因子；同时，在每种处理条件下平行单独培养 LP9 细胞。
同样，在研究细胞和类球体的侵袭能力时，还应检测其迁移能力，以区分这两种行为（即，侵袭需要对细胞外基质（ECM）屏障进行蛋白水解消化，而迁移则不需要）。为此，可省略ECM屏障（步骤3.1.1 - 3.1.3），并在有ECM屏障的情况下平行开展实验。如有需要，可将后者的“侵袭”测量值减去前者的“迁移”测量值进行校正。最后，需要注意的是，通过电阻抗测量所获得的信息具有局限性：一旦细胞侵入下室，其在膜下表面的黏附、铺展和增殖状态的变化可能会影响电阻抗读数的变化。因此，该方法在与其他检测手段（如类球体细胞活力、黏附、迁移和形态学检测）联合使用时，才能更全面地评估类球体细胞的行为。例如，理想情况下，为了充分理解类球体与间皮细胞之间的相互作用，还应定期在标准相差显微镜下对独立的共培养体系进行成像，以便在进行定量的RTCA侵袭检测的同时，对类球体的形态和健康状况进行定性评估。如果进行了可选的标记步骤，则可在荧光显微镜下观察单个癌细胞从类球体中解离并与其未标记的间皮细胞相互作用的行为。在与第二种细胞类型共培养时，对癌细胞进行荧光标记的一个额外优势在于，可以确认只有癌细胞穿过了&#160;细胞和ECM屏障。
总之，该方法代表了一种高通量定量分析卵巢癌类球体侵袭间皮和细胞外基质屏障的技术。通过向CIM板孔的上室或下室中添加外源性细胞因子、生长因子或特异性抑制剂，该方法能够快速确定在时间过程中调控卵巢癌类球体细胞穿过间皮和基质屏障相互作用的因素。

卵巢癌在所有妇科癌症中的死亡率最高1。全球每年约有 23 万例病例，因该疾病导致的死亡人数超过 10 万1。大多数患者（&#62;75%）在癌症已经发生转移后才被确诊，此时治疗因化疗耐药性增加而更加复杂，预后较差2。III-IV期转移性疾病的患者五年生存率仅为 30–40%3。因此，迫切需要更深入地了解卵巢癌转移背后的细胞行为，以有效治疗晚期疾病。
目前关于卵巢癌转移的模型提出了转移过程中的多个步骤，每个步骤均发生在不同的微环境中，这些微环境会影响肿瘤的行为。转移性卵巢癌细胞最初从原发肿瘤部位脱落，以单细胞或三维多细胞结构的形式在腹腔液中以非黏附状态存活，这些多细胞结构被称为多细胞聚集体或球状体2,4,5。在悬浮状态下未能形成球状体的细胞更容易发生失巢凋亡2,4,5。球状体还表现出对化疗药物更强的耐药性，从而导致残留病灶以及癌症的后续复发2,4,5。卵巢癌转移的第二个关键步骤是聚集体从游离的细胞簇转变为在腹膜壁和大网膜中形成的稳定继发性肿瘤5,6。细胞间以及细胞与基质间的相互作用被认为参与了聚集体的形成、存活及其对腹膜间皮层所产生的细胞外基质（ECM）的黏附过程4-11。然而，这些过程目前仍了解甚少。
为阐明卵巢癌扩散的机制，可采用非黏附培养法，通过在培养基中添加甲基纤维素使细胞保持悬浮状态，从而从已建立的癌细胞系生成球状体。12,13 或通过在低吸附培养板上培养细胞2,14以这种方式培养时，卵巢癌细胞会聚集成多细胞团块或球状体，其细胞、分子及生物化学特性与肿瘤组织中发现的细胞团块相似 体内2,14类球体形成后，可从非黏附培养基中收集，并重新接种到多种固体表面，以进行后续功能研究。该方法较单层培养检测具有优势，因单层培养无法准确模拟卵巢癌细胞在非黏附环境（如腹腔积液）中的转移行为。
传统终点检测法（如Boyden小室法）2可用于评估癌细胞球的侵袭能力，但这种方法可能存在误导性，因为卵巢癌细胞的侵袭是一个随时间动态变化的过程。近期已开发出一种实时方法，通过延时视频显微镜观察侵袭性卵巢癌细胞球清除间皮细胞的过程来评估侵袭能力15,16；然而，延时数据的分析耗时较长且可能具有主观性。本文介绍了一种快速、定量的实时评估卵巢癌细胞球侵袭行为的方法。首先，建立了一种细胞球-间皮细胞共培养模型，该模型模拟了卵巢癌转移过程中的一个阶段，即多细胞球附着并侵入腹膜层形成继发性肿瘤的过程。随后，将实时细胞分析仪（RTCA；公司信息见材料表&#160;）的方法进行优化，用于在此模型中对以细胞球形式培养的不同卵巢癌细胞系的侵袭能力进行定量实时检测。
在RTCA仪器中，通过测量电学阻抗的变化，可在整个实验过程中连续监测细胞反应，无需使用外源性标记物。特殊设计的培养板在双室小孔（“CIM”板）上下室之间的微孔膜下方设有镀金微电极。电极位于下室，使得当细胞侵袭穿过细胞外基质（ECM）或ECM/细胞屏障时，可检测到电学阻抗的变化。每个CIM板小孔的两个腔室之间的膜界面首先包被感兴趣的ECM组分。在类球体-间皮细胞模型系统中，该界面先包被一层Matrigel（公司信息见材料表），以模拟腹膜间皮层下方复杂的细胞外基质，随后覆盖一层融合的人间皮“靶”细胞单层。最后，加入预先形成的卵巢癌类球体。卵巢癌类球体细胞必须主动侵袭穿过靶细胞层和基质，到达下室，从而改变电学阻抗读数。同时单独评估靶细胞，以确保其自身不会侵袭穿过基质层，适合用于本实验。

<table><tbody><tr><td>xCELLigence RTCA DP 分析仪</td><td>ACEA生物科学</td><td>RTCA DP</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence CIM 板&amp;nbsp;</td><td>ACEA生物科学</td><td>5665817001</td><td></td></tr><tr><td>Cell Trace™ CFSE&amp;nbsp;</td><td>分子探针</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>甲基纤维素（4,000 厘泊）</td><td>Sigma</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11150067</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 营养混合物</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11765062</td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子（EGF）</td><td>PeproTech&amp;nbsp;</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶 EDTA</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>96孔凹面培养板&amp;nbsp;</td><td>Grenier Bio-One</td><td>650185</td><td></td></tr><tr><td>LP9 人源间皮细胞系</td><td>柯里尔医学研究所&amp;nbsp;</td><td>AG07086</td><td></td></tr><tr><td>生长因子减少型Matrigel基质</td><td>BD 生物科学&amp;nbsp;</td><td>354230</td><td></td></tr></tbody></table>

实时评估卵巢癌球体对间皮细胞的黏附与侵袭

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

卵巢癌通过脱落进入腹腔液，并在腹膜内扩散至远端部位而发生转移。单层培养无法准确模拟癌细胞在非黏附环境中的行为，因为癌细胞会自发聚集成多细胞结构，这些结构通过附着并侵入腹膜衬层形成继发性肿瘤，从而促进转移过程。为了模拟卵巢癌转移的这一关键阶段，可在非黏附条件下培养已建立的卵巢癌细胞系，以生成多细胞聚集体（即球状体）。为模拟肿瘤细胞所遇到的腹膜微环境 体内建立了一种球体-间皮细胞共培养模型，将预先形成的球体接种于人源间皮细胞单层上，该单层细胞生长于细胞外基质屏障之上。随后采用实时细胞分析仪开发了方法，用于定量测定以球体形式生长的不同卵巢癌细胞系的侵袭能力。该方法可实现对侵袭过程的长期连续监测，相较于传统终点检测法以及更为繁琐的实时显微镜成像分析，具有多项优势。简而言之，该方法能够快速、动态地确定调控卵巢癌球体细胞随时间推移穿过间皮层和基质屏障相互作用的相关因素。

可通过将多种细胞系悬浮培养或从恶性腹水中分离原代肿瘤细胞来生成卵巢癌类球体2,14。本实验中使用了两种上皮性卵巢癌细胞系 OVCA433 和 OVCA429，以及一种卵巢颗粒细胞瘤细胞系 KGN 来生成类球体（图 1A）。在该方法中，将细胞悬浮于添加了甲基纤维素以增加黏度的培养基中，并在U型底孔板中进行培养。在此条件下，许多卵巢癌细胞表现出固有的聚集能力，形成类球体13。在甲基纤维素/培养基中悬浮培养过夜后，三种细胞系均形成了直径约为 400–500 μm 的致密类球体结构（图 1A）。与此同时，准备 RTCA CIM 板，首先在多孔膜界面涂覆基质，然后接种人腹膜间皮细胞形成融合单层（图 1B）。类球体形成后，将其转移至已准备好的 CIM 板中。收获的癌类球体接种于 LP9 单层细胞上方，并按以下所述进行评估。对平行培养物定期进行标准相差显微镜观察（若进行了可选的细胞标记步骤，则进行荧光显微镜观察），以辅助解释 RTCA 数据（图 1C）。
评估癌细胞系的基础侵袭水平以及趋化因子诱导的侵袭能力具有重要意义。通常，基础侵袭性通过在上室和下室均加入无血清培养基（SFM）来测定。在本示例中，使用含有多种潜在趋化因子的完全培养基（10% FBS）来检测“趋化因子诱导”的侵袭行为（图2）。单独对LP9间皮细胞进行的平行研究表明，在基础条件或“趋化因子”诱导条件下，这些细胞在2天内的侵袭性极低，因此是与卵巢癌细胞共培养实验中理想的对照细胞类型（图2A 和 图2B）。相比之下，利用三种细胞系生成的卵巢癌细胞球均表现出向趋化因子（FBS）方向侵袭的能力（图2A-2C）。与传统终点法检测相比，RTCA实时检测仪器的主要优势在于能够随时间定量分析细胞/细胞球行为的变化。在为期2天的实验中，KGN、OVCA429和OVCA433细胞系均表现出向趋化因子侵袭的能力（表现为细胞指数上升），但基础侵袭水平较低（图2C）。这些细胞系的侵袭速率相似，表现为曲线斜率平行（图2C）；然而，OVCA429的曲线具有更高的上渐近线，表明其最大侵袭程度高于其他细胞系。此外，各细胞系在侵袭起始时间上存在差异：KGN细胞迅速穿透细胞层和基质屏障，而OVCA433和OVCA429细胞的侵袭起始时间则分别延迟了3至5倍（图2D）。重要的是，细胞在侵袭起始阶段的行为并不能预测其整体侵袭能力（图2C 和 图2D）。这提示不同癌细胞系具有不同的内在侵袭潜能，同时也可能表明调控细胞球早期与晚期侵袭行为的因素有所不同。
<img alt="用于细胞培养分析的细胞球体、单层细胞和腔室示意图。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 球体生成及实验装置模型。A： 相差显微镜下观察到的在甲基纤维素/培养基中形成的球体图像（上方），以及相应细胞系以单层形式培养的图像（下方）。B： RTCA 2腔室CIM板孔装置的示意图，其中预先形成的卵巢癌球体被接种在上腔的LP9间皮细胞层/基质屏障的单层之上，下腔中加入含或不含FBS的培养基作为趋化因子。位于两个腔室界面下方的电极会随着更多细胞侵袭穿过屏障进入下腔而检测到逐渐增加的电学阻抗。C： KGN球体位于LP9单层细胞上方的相差显微镜图像（左）和荧光显微镜图像（右）。比例尺 = 100 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用显示卵巢癌类球体的图表比较细胞增殖；随时间变化的细胞指数分析。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51655/51655fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 实时卵巢癌类球体侵袭数据。 A - B：在 CIM 板孔的下室中分别有或无 FBS 条件下进行的 RTCA 侵袭实验的代表性结果。比较了 KGN 细胞与 LP9 间皮细胞的侵袭能力。结果以三复孔在 24 小时时间点（A）以及整个两天实验期间（B）的平均值 ± 标准差细胞指数表示。C - D： 在 24 小时（C）和更详细的 2.5 小时时间范围内（D），对 KGN、OVCA429 和 OVCA433 细胞系侵袭能力的比较。

卵巢癌细胞侵袭腹膜间皮衬层是一个随时间动态变化的过程。利用实时分析仪，可在延长的时间段内定量评估卵巢癌细胞在球状体-间皮细胞共培养模型中的侵袭能力，从而深入了解调控转移过程的相关因素。

卵巢癌通过脱落进入腹腔液，并在腹膜内的远端部位扩散而发生转移。单层培养无法……

本实验的总体目标是利用星形体间皮细胞共培养转移模型，实时快速定量分析卵巢癌细胞的侵袭能力。首先，在甲基纤维素中以非贴壁条件培养细胞系，从而生成卵巢癌细胞；其次，通过在双室小孔板的上室中包被基质胶（matrigel），构建实时细胞分析仪CIM板，以模拟腹膜腔间皮层及其下方间皮衬里的基底膜结构。接下来，收集卵巢癌类固醇并将其加入实时分析仪板孔的上层 chamber 中。最后一步是编程并启动实时细胞分析仪，该仪器将在较长时间内按预设的时间间隔定期采集读数。最终获得的结果可描绘出持续的侵袭过程，用于确定调控卵巢癌细胞侵袭细胞及基质屏障的关键因素。与现有的标准跨膜侵袭实验等癌症细胞侵袭检测方法相比，该技术的主要优势在于能够对癌症细胞的侵袭行为进行长时间的连续动态监测。不同于仅在单一终点进行检测的方法（此类方法无法充分反映卵巢癌转移的动态特性），该方法不仅可用于研究卵巢癌，还可应用于其他类型的转移过程研究，例如乳腺癌，或癌细胞穿过内皮层的过程。同样，该方法也可用于研究正常细胞的侵袭行为，例如胚胎着床过程中的滋养层细胞侵袭。在进行卵巢癌细胞的荧光标记前，需对其进行相应的预处理。首先，在细胞汇合度达到75%时进行收获，并将细胞重悬于预热的PBS（每0.1% BSA 1毫升）中，调整终浓度为每毫升100万个细胞。每孔加入最适浓度的类固醇，并小心操作类固醇，这对本实验的成功至关重要。接着，向细胞中加入2微升5毫摩尔的Cell Trace CSFE储备液，使终浓度为10微摩尔，在37摄氏度孵育10至15分钟。在水浴中，用含有10% FBS的1毫升冰浴培养基终止反应，并通过离心重新收集细胞。将细胞重悬于10毫升适当的预热生长培养基中，接种至75平方厘米带滤盖的培养瓶中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养，直至荧光标记水平足以被检测。开始此操作时，量取适用于每种细胞系的培养基体积，即 15 毫升减去生成细胞球所需的细胞体积。向培养基中加入 3 毫升甲基纤维素储备液，使甲基纤维素终浓度为 20%，并通过轻轻翻转充分混匀。将 300,000 个细胞加入含甲基纤维素的培养基中，轻轻翻转混匀。用移液器将 150 微升细胞与甲基纤维素培养基的混合液加入 96 孔圆底培养板的每个孔中。这将使每孔细胞培养密度达到3000个细胞，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养一至四天，或直至形成均一的PHE。通常每孔加入一种类固醇，实时细胞分析（realtime cell analyzer，RTCA）细胞侵袭实验采用16孔RTCA双室CIM板。每次操作以四个孔为一组，在板的上室每个孔中加入50 µL基质，确保完全覆盖整个表面区域。立即但缓慢地移除30微升基质，以去除任何过量液体。将培养板置于组织培养孵育箱中，在37摄氏度下孵育4小时后使用。4小时后，向顶层室中加入30微升无血清、适合每种癌细胞系的培养基，以及160微升含血清或无血清的培养基。根据实验设计，在下室中组装CIM板，方法是将下室卡入上室，并在37摄氏度培养箱中平衡。在组织培养孵育箱中孵育一小时期间，打开RTCA程序并选择布局选项卡。选中所有实验孔，右键单击孔位，然后选择开启孔位。然后根据需要填写实验条件和销售名称。如需向程序中添加步骤或子步骤，请选择“时间表”选项卡，右键单击并添加步骤。第一步为预设的背景扫描，将自动纳入程序中。选择添加步骤后，输入RTCA程序第二步所需的程序参数，该步骤将记录LP9人源间皮细胞单层形成过程中的阻抗读数。通过选择间隔选项卡并输入15分钟，设置阻抗读数的时间间隔。通过选择持续时间选项卡并输入12至24小时之间的时间，设定实验持续时间。后续步骤以相同方式添加。RTCA 程序的第三步将指示仪器在弗里德入侵期间进行读数。在“间隔”选项卡下输入五分钟，在“持续时间”选项卡下输入 48 小时。在菜单栏中选择“板”，然后保存。开始此操作时，将CIM板放入RTCA仪器中，并打开之前保存的程序。在菜单栏中选择“执行”，随后将自动开始背景扫描。背景扫描完成后，将CIM板从仪器中取出并放入组织培养罩内的平板中。将50,000个LP九细胞悬浮于160微升无血清培养基中，加入每块CIM板的上室。将板放入RTCA仪器中，每15分钟读取一次数据，同时LP九单层细胞在过夜培养中形成。次日，无菌条件下将1毫升移液器吸头顶端剪去1毫米，用其轻轻吸取每个细胞系各孔中的内容物。将10个类固醇样品置于无菌离心管中离心。在120 ×g条件下离心8分钟，然后轻轻吸除含有甲基纤维素的培养基。每次洗涤后，在120 ×g条件下离心8分钟以沉淀类固醇，再用PBS洗涤类固醇两次。每个实验孔中，在 160 微升不含 PBS 的培养基中加入共计 10 种类固醇。通过从菜单栏选择执行并勾选暂停，来暂停 RTCA 实验。将 CIM 板从仪器中取出，并置于组织培养罩内。吸出每孔中的培养基，更换为含类固醇的培养基。将培养板放回RTCA仪器中。从菜单栏选择执行，并勾选中止步骤。程序将自动进入下一步。要继续实验，请从菜单栏中选择执行，并勾选“开始继续”。RTCA 程序中的第三步将在本实验中启动两种上皮性卵巢癌细胞系 OVCA 433 和 OVCA 429，以及一种卵巢颗粒细胞肿瘤细胞系。KGN细胞经过过夜培养后，在含有甲基纤维素的培养基中悬浮于U型孔板中，用于生成类固醇。三种细胞系均形成了致密的类固醇结构，直径约为400至500微米。底部图示为在单层培养条件下生长的对应细胞系。柱状标尺代表形成的100微米。类固醇被收获后接种于R-T-C-A-C-I-M板中覆盖有LP9人胸膜间皮细胞单层的表面。通过相差显微镜或荧光显微镜对平行培养物进行定期成像，以辅助解读RTCA数据。同时评估癌细胞系的基础侵袭能力以及趋化因子诱导的侵袭能力具有重要意义。在本示例中，通过在上室和下室均加入无血清培养基（SFM）来测定基础侵袭性。而含有10%胎牛血清（FBS）的完全培养基因包含多种潜在的趋化因子，被用于检测趋化因子诱导的侵袭能力。此处展示的是KGN细胞与LP9间皮细胞之间细胞侵袭能力比较的代表性结果。RTCA侵袭实验在A CIM板的下室中分别在有无FBS的条件下进行。结果显示了24小时时间点以及整个两天实验期间，三个复孔的细胞指数平均值减去标准差（SD）的结果。这些结果证实，在基础条件或趋化因子诱导条件下，LP9细胞在两天内的侵袭能力均极低，因此是与卵巢癌细胞进行共培养实验的理想细胞类型。相比之下，KG细胞和卵巢癌细胞系则表现出向趋化因子迁移的侵袭能力。该图表展示了KG1NOVCA429和OVCA433细胞系在两天实验期间、24小时时间点上的侵袭能力比较结果。三种细胞系均表现出向化学趋化剂侵袭的能力，表现为细胞指数逐渐升高。这些细胞系的侵袭速率相似，由曲线的平行斜率可知。然而，OVCA 4 29 的曲线表现出更高的上限渐近值，表明其最大侵袭水平高于其他细胞系。相比之下，所有细胞系的基础侵袭水平均较低。此外，通过在2.5小时时间范围内对侵袭数据进行更详细的分析，发现各细胞系在侵袭起始时间上存在差异。KGN细胞快速侵袭细胞和基质屏障，而OVC 4 33和OVC 4 29细胞的侵袭时间则分别需要长出三倍和五倍。重要的是，这些细胞在侵袭初期的行为并不能预测其整体侵袭能力。这表明不同癌细胞系具有内在的差异性，但也可能说明类固醇对早期和晚期侵袭行为的调控涉及不同的因素。一旦掌握，该技术可便捷地用于研究腹膜微环境中影响转移行为的各种信号分子和细胞通路。这可以通过向孔板的下室或上室添加外源性生长因子、细胞因子或抑制剂来实现。或者，也可以对癌细胞本身或腹膜靶细胞进行基因操作。

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