利用基因编码传感器进行谷氨酰胺通量成像

本实验的总体目标是利用荧光共振能量转移（FRET）传感器，在活细胞中对异源表达的转运蛋白介导的谷氨酰胺转运过程进行成像。该目标通过首先将表达谷氨酰胺传感器和转运蛋白的质粒转染入HEK293细胞来实现。该传感器由插入到细菌谷氨酰胺结合蛋白内部的FRET供体以及位于谷氨酰胺结合蛋白C末端的FRET受体组成。

第二步是建立灌流系统，并使用倒置荧光显微镜对细胞进行实时成像。最后一步是分析图像并可视化谷氨酰胺的动态变化。最终，利用这些FRET传感器可检测单个细胞中转运蛋白的活性。

与基于色谱法的现有测量方法相比，该技术的主要优势在于能够获得更高的空间-时间分辨率。该技术包括三个部分：用传感器蛋白转染细胞、实时成像以及实验后的分析成本。本实验选用七种细胞，因其内源性谷氨酰胺转运活性较低。

将细胞以约70%至80%的汇合度接种于含10%胎牛血清（cosmic calf serum, CCS）及100单位/毫升青霉素-链霉素的DMEM培养基中，置于八孔玻璃底培养皿中。在37°C、5% CO₂、100%湿度条件下培养24小时。

24 小时后，将培养基更换为含 10% CCS 但不含抗生素的 DMEM，于转染当天在 37 摄氏度、5% CO2、100% 湿度条件下过夜培养。在 50 微升无血清培养基中加入各 0.4 微克编码谷氨酰胺传感器的质粒 DNA 和编码标签化必需氨基酸转运蛋白 mCherry-SCT2 的质粒 DNA。

向50微升无血清培养基中加入一微升转染试剂，轻轻混匀，并在室温下孵育五分钟。接着，将含有DNA的溶液与稀释后的转染试剂混合，室温孵育20分钟。20分钟后，将转染试剂混合物轻轻加至cost seven细胞表面，并通过轻轻摇动培养腔使其均匀混合。

37℃、5% CO2、100%湿度条件下培养24小时。24小时后，更换为含10% CCS和100单位青霉素-链霉素的DMEM培养基。更换培养基后，将细胞放回培养箱，待开始灌流前使用。

按照随附文稿中的配方制备灌注缓冲液 A 至 F。将止流阀连接至 50 毫升注射器上。关闭止流阀，并用灌注液填充注射器。

短暂打开旋塞，使旋塞内的顶部空间充满缓冲液。然后启动八通道重力灌注系统，使用灌注笔向灌注系统供液，并选择手动模式。

在选择功能选项下。将废液容器放置在灌流笔下方。为了确保本实验的成功，设置灌流系统时应尽量减少漂移和溶液残留。

通过按相应的数字手动激活端口，并用水填充管路。使用10毫升注射器，关闭端口，将装有缓冲液A至F的注射器分别置于灌流系统的1至6号端口上，然后打开旋塞。之后。

重新打开端口，以缓冲液替换管路中的水。流速应约为 0.8 毫升每分钟。在灌流控制器上按一次取消键，返回至功能选择菜单。

切换至编辑程序选项，然后输入本表中所示的灌注程序。保存灌注程序。转染后48至72小时对细胞进行成像。

用灌流缓冲液 A 轻轻冲洗玻璃底培养皿的孔两次，注意不要将细胞冲走。将玻璃底培养皿放置在荧光显微镜的载物台上。将灌流系统连接到培养室。

若使用开放式腔室，需设置另一台泵以从腔室中移除灌流液。打开载片成像软件，利用聚焦功能新建一个载片，使用适当的滤光片组找到共表达传感器和A SCT two M cherry的细胞。

通过点击相机选项卡并调节增益下方的滑动条来调整增益。同时，从中性密度滤光片下拉菜单中调整中性密度滤光片的设置。点击图像采集，然后在采集窗口中指定要使用的滤光片。

将在三个通道中采集图像。包括供体激发、供体发射，供体激发、受体发射，以及受体激发、受体发射。单击测试按钮，在滤光片设置旁边的输入框中键入所需的曝光时间，以调整曝光时间。所有三个通道的曝光时间必须相同。

使用区域工具绘制感兴趣区域。在捕获类型框中选择延时成像，然后为实验指定时间间隔和时间点。

接下来，在无荧光细胞的区域绘制一个用于背景扣除的区域。右键单击所绘制的区域，然后将其设置为背景。理想情况下，应选择未表达传感器的细胞作为背景区域，以校正相机检测到的自发荧光和背景荧光。

在“选择功能运行程序”选项下选择所需的程序，切换到已保存的程序，然后在灌注控制器上按回车键。程序现已加载，按下任意键将启动灌注，以确保灌注与成像实验同时开始。在按下灌注控制器上的按键的同时，点击采集窗口中的“开始”按钮。

此处展示的是使用共表达 a s CT 两种转运蛋白和具有 8 毫摩尔与 100 微摩尔亲和力的 fret 谷氨酰胺传感器的细胞进行的典型时间过程实验。谷氨酰胺的流入通过供体 mtfp1 与受体 Venus 之间的荧光强度比值变化来检测。同时展示了在丙氨酸存在下谷氨酰胺的底物流入情况。

也可以利用传感器检测转运蛋白的特异性。在此实验中，细胞预先加载谷氨酰胺，然后将不同的氨基酸添加到细胞外灌流液中。正如预期的那样，其中两种底物氨基酸诱导了谷氨酰胺的转运，而其他非底物氨基酸则未引起谷氨酰胺转运。

在加入底物后未观察到FRET效率的变化可能由多种原因导致，例如被测试底物的摄取能力较低，如表达八毫摩尔传感器或100微摩尔传感器的细胞所示。但这些细胞未表达ASCT2转运蛋白，以确认FRET效率的变化确实源于底物浓度的真实变化，而非其他参数的改变。采用相同的灌流方案，对表达一种在实验条件下预期已达到饱和的传感器的细胞进行相同操作。

在此示例中，该传感器的亲和力为 1.5 微摩尔。观看本视频后，您应能充分理解如何利用 FRET 传感器对代谢物动态进行成像。请务必注意，细胞培养必须按照标准操作规程进行处理，以最大限度地降低暴露风险。