通过单分子FRET研究DNA成环

以下实验的总体目标是研究双链 DNA 的循环动力学如何在不使用 DNA 结合蛋白的情况下受 DNA 内在形状的影响。这是通过将染料分子掺入不同曲率的双链 DNA 片段中来实现的，这样就可以通过荧光共振、能量转移或 Fret 来监测 DNA 环。然后可以通过全内反射显微镜观察来自单个 DNA 分子的可逆环和非环事件。

然后可以从每个单分子荧光的时间轨迹推断出 DNA 的环速率。最终，可以测量 DNA 相对于片段内在形状的环概率。这种 DNA 环检测的主要优点是它不依赖于 A DNA 结合蛋白，这可能会影响 A DNA 的环动力学。

简单的实验方案是关于使用一种称为荧光共振能量转移和基于 PCR 的 DNA 合成的技术。测量 DNA 的观察概率 首先通过重复 10 MER 序列来设计全局弯曲的 DNA。例如，这个代表性序列是一个 186 个碱基对的弯曲 DNA，其中 X 是一个随机的额外碱基，重复的 10 个聚体序列两侧的序列是接头序列。

接下来，用引物 1 和 2 进行 PCR，在 5 个主要末端标记引物 2 的 SI 3。然后用引物 3 和 4 进行 PCR，通过骨架和引物 3 的 5 个主要末端的生物素接头进行 SCI 5 标记。使用 PCR 纯化试剂盒纯化 PCR 产物后，将 SCI 3 标记和 SCI 5 标记产物混合在缓冲液中，分别以 0.4 微摩尔和 0.1 微摩尔的终浓度进行链交换。

然后将链在 98.5 摄氏度下孵育 2 分钟，以每秒 0.1 摄氏度的斜坡速率逐渐冷却至 5 摄氏度，然后在 5 摄氏度下孵育 2 小时。要更换链以准备流通池，请使用钻床和金刚石钻头沿着 3 英寸 x 1 英寸载玻片的两个相对边缘创建六到七对孔。当所有孔都钻完后，在流水下摩擦载玻片以去除任何可见的玻璃粉末。

将载玻片直立放入玻璃罐中，并加入蒸馏水。对染色槽进行超声处理 15 分钟，然后将玻片转移到专用于丙酮清洁的玻璃槽中。用丙酮填充罐子，并在丙酮中对玻片再超声处理 15 分钟。

接下来，用乙醇喷洒载玻片，然后用水喷洒，然后将载玻片转移到聚丙烯罐中。用 5 摩尔氢氧化钾填充聚丙烯染色缸，然后在最后一次洗涤后对玻片进行超声处理 15 分钟，用蒸馏水冲洗玻片，然后再冲洗 15 分钟。超声处理，然后在清洁盖玻片后。

以同样的方式，将 80 微升新鲜制备的 PEG 溶液分配到每个载玻片上，然后轻轻地将盖玻片放到钉子上。45 分钟后，用镊子从载玻片上取下盖玻片，用大量蒸馏水冲洗载玻片和盖玻片。然后在盖玻片和幻灯片干燥时将它们干燥，在幻灯片上放置双面胶带薄条以形成通道，在条带上划一条盖玻片，并用力按压盖玻片以形成液密通道。

然后使用 5 分钟的环氧树脂密封通道的边缘，以固定分子以进行显微镜检查。首先，将 15 微升 neu tradin 溶液注入一个通道中。2 分钟后，用 100 μL T 50 缓冲液冲洗通道，然后将 50 μL DNA 样品注入通道。

5 分钟后，用 100 μL T 50 缓冲液冲洗掉未结合的 DNA，然后用含有氧气清除系统的成像缓冲液填充通道。现在将浸油放在显微镜物镜上，然后使用样品夹将流通池固定到显微镜载物台上。打开 532 纳米激光器。

使用显示器上荧光图像的实时取景进行微调。调整焦距。在 532 纳米激光器开启的情况下开始数据采集。

当大多数分子都经过光漂白处理以处理和分析图像时，停止数据采集，使用 MATLAB 脚本查看所有显示高品和低品信号之间多个跃迁的单分子时间轨迹。确定 looped 和 unloop 状态，然后通过确定两条拟合的高斯曲线之间的交集来找到分隔两个分布的阈值。接下来，通过将科幻强度除以 SCI 3 和科幻强度之和来计算 F 前效率。

为具有高品格值的 Loop 状态分配，为低品格值的 unloop 状态分配。然后使用 MATLAB 脚本，分析在不同时间间隔内循环达到高品态的分子或 NFT 的累积数量。自数据采集开始以来，可以通过用指数函数拟合 NFT 来提取循环率 K sub 循环。

如果 NFT 增加 bi，基本上它可以拟合一个双指数函数，如方程所示。在这种情况下，从该方程获得 K sub 回路以确定 J 因子流。将 20 微升 30 至 50 皮摩尔生物素 sci 5 寡核苷酸或引物 3 放入坚果 travain 包被通道之一中，如刚才所示。

接下来，用 100 μL T 50 冲洗通道以洗去未结合的寡核苷酸，然后将补充有 PS 3 寡核苷酸的新鲜制备的成像缓冲液流入腔室。保持 532 纳米激光器开启，然后短暂打开 640 纳米激光器，以识别任何表面结合的科幻寡核苷酸的位置。然后关闭 640 纳米激光器并开始监测 fret 信号。

使用 MATLAB 脚本分析以未结合状态开始的分子数。那是具有低 sci 5 强度，但后来变成 IL 状态。也就是说，作为时间的高 scifi 强度，从 scifi 强度轨迹中绘制出这个数量的 ane 分子与时间的关系，用单个指数函数拟合曲线以获得 ealing 速率。

K sub anil，在不同的 SI 三种寡核苷酸浓度下重复实验，以确认跪姿速率和反应物浓度之间的线性。从斜率中提取二阶跪下速率常数 K 素数 sub ail。最后，计算 J 因子，其中 K sub 环是在相同缓冲条件下测得的环速率，以测试双链 DNA 的内在曲率对环的影响。

在这个实验中，一个直的和一个弯曲的 186 碱基对。与直接 DNA 相比，每个双链 DNA 都是构建的。确定弯曲的 DNA 在同一时期产生更多的高品格事件。

在相同的采集时间内，弯曲 DNA 的环化频率也是直接 DNA 的四倍，这表明 DNA 的内在曲率可以显著影响环动力学。在最后的分析步骤中，通过将循环速率除以一阶（跪下速率常数）来计算 J 因子，并确定直线 DNA 为 61 加或减 3 纳摩尔，曲线 DNA 为 265 加或负 48 纳摩尔，与以前的发现一致。按照此程序，可以研究事故因素对循环迁移率（如温度、不应变和粘度）的影响。

该协议不仅可用于研究 DNA 的聚合物物理学，还可用于向初级研究学生或非专业观众展示单分子荧光的力量。