Name: 研究DNA环接了单分子荧光共振能量转移 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: 学习利用单分子荧光共振能量转移技术研究双链DNA的环接动态，通过全内反射显微镜观察可逆环接事件，测量不同曲率DNA片段的环接概率，无需DNA结合蛋白干扰即可揭示DNA内在形状对环接动力学的影响。

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感谢 James Waters、Gable Wadsworth 和 Bo Broadwater 对稿件的审阅。我们还要感谢四位匿名审稿人提供的有益意见。本研究得到了佐治亚理工学院、伯克利韦尔科姆基金会科学交叉领域职业奖以及美国国家科学基金会生命系统物理学学生研究网络项目资助。

1. 双链DNA样品制备
<ol>
	<li>通过重复一个10碱基序列设计全局弯曲的DNA。例如，5’-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCCX)7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3’ 是一条186 bp的弯曲DNA，其中X为随机插入的额外碱基，重复的10碱基序列两侧为接头序列。 
	注意：在此示例中，选择了两个基于Kaplan 等15 的大规模核小体占位研究中对核小体形成具有相反倾向性的10碱基序列。由于双链DNA的螺旋重复接近10 bp，该10碱基序列对螺旋轴的任何净偏转都将累积，形成类似圆弧的形状（图3A）。由于螺旋周期更接近10.5 bp，因此每两个重复后插入一个额外碱基，以尽可能保持弯曲结构的平面性。这些长度短于200 bp的序列可由提供基因合成服务的公司合成。在这些序列两端添加常用的接头序列，便于后续操作。该流程示意图见图3B。</li>
	<li>使用引物1（GTGCCAGCAACAGATAGC）和引物2（/5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG）进行PCR。注意：引物2在5'端标记有FRET供体Cy3。典型的PCR反应体系和循环程序见表1和表2。</li>
	<li>使用引物3（/5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC）和引物4（CAACAACGAGCTCGAATG）进行PCR。注意：引物3在5'端通过骨架标记有FRET受体Cy5，并连接生物素-linker。PCR反应体系和循环程序同上。</li>
	<li>使用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。</li>
	<li>在链交换缓冲液（100 mM NaCl，10 mM Tris-HCl pH 7.0，1 mM EDTA）中混合Cy3标记产物和Cy5标记产物，终浓度分别为0.4 µM和0.1 µM。注意：过量的Cy3-DNA可提高通过链交换形成的、同时携带Cy3和Cy5的双链DNA的浓度。</li>
	<li>在98.5 °C孵育2分钟以实现链交换，随后以0.1 °C/秒的降温速率逐渐冷却至5 °C，并在5 °C孵育2小时。</li>
</ol>
2. 检测双链DNA弯曲的凝胶电泳
<ol>
	<li>通过将丙烯酰胺和双丙烯酰胺溶液以29.2:0.8的比例混合，配制成在pH 8.0的1X Tris/Borate/EDTA（TBE）缓冲液中浓度为5%（w/v）的聚丙烯酰胺凝胶16,17。注意：10 ml凝胶溶液包含：1.217 ml 40%丙烯酰胺溶液、0.667 ml 2%双丙烯酰胺溶液、1 ml 10X TBE缓冲液、100 µL 10%过硫酸铵（APS）溶液、10 µL TEMED，其余用dH2O补足。凝胶完全凝固约需30分钟。</li>
	<li>将DNA样品和DNA分子量标记物与1X上样缓冲液（含5%甘油、0.03%（w/v）溴酚蓝）混合后上样至聚丙烯酰胺凝胶中，在4 °C条件下以5–8 V/cm的电压电泳45分钟，或直至染料前沿接近凝胶末端。</li>
	<li>使用含有0.5 µg/ml溴化乙锭的1X TBE缓冲液对凝胶染色30分钟。在紫外光照射下观察DNA条带。通过与大小标记物（100 bp DNA ladder）比较条带位置，计算DNA分子的表观大小。注意：弯曲的DNA通常比直链DNA迁移更慢。</li>
</ol>
3. 流通池制备
<ol>
	<li>使用台式钻床和金刚石钻头在载玻片（3英寸 × 1英寸）相对的两条边缘上钻6-7对孔。钻孔后，在流动水中冲洗载玻片以去除可见的玻璃粉末。注意：这些孔用作灌流入口和出口。钻孔过程中需用水冷却载玻片，以防止破裂。</li>
	<li>将载玻片垂直放入玻璃瓶中，并加水浸没。超声处理15分钟，然后转移至另一个专用于丙酮清洗的玻璃瓶中。加入丙酮并超声处理15分钟。使用喷瓶依次用乙醇和水冲洗载玻片。将载玻片放入聚丙烯瓶中，加入5 M氢氧化钾溶液，并超声处理15分钟。最后，将载玻片在水中超声处理15分钟。使用相同方案清洗盖玻片（1号，24 × 40 mm）。注意：清洗后的载玻片和盖玻片可长期保存于dH2O中备用。</li>
	<li>将1 mg生物素-聚乙二醇-硅烷（分子量3400）与80 mg甲氧基聚乙二醇-硅烷（分子量2000）溶于340 µL的0.1 M碳酸氢钠溶液中。充分混合后短暂离心，以去除气泡。注意：通过聚乙二醇（PEG）对表面进行功能化修饰有助于减少DNA在表面的非特异性结合。</li>
	<li>在每张载玻片上加入80 µL PEG溶液，并在其上方轻轻覆盖一张盖玻片。静置45分钟。用镊子将盖玻片与载玻片分离，用大量dH2O冲洗，并在空气中自然干燥。</li>
	<li>在载玻片上横向粘贴双面胶条以形成通道。将盖玻片对齐覆盖其上，并用力按压使其与载玻片紧密结合，形成液体密封的通道。使用5分钟环氧树脂密封通道边缘。</li>
</ol>
4. Trolox 溶液的配制
<ol>
	<li>将约 30 mg Trolox 和 10 ml dH2O 加入烧瓶中，使用磁力搅拌子在敞口条件下搅拌溶液 18 小时。</li>
	<li>使用 0.2 µm 滤膜过滤溶液，并通过加入约 6 µl 1 M Tris 碱液（pH 11）将 pH 调至 7。注意：Trolox 是一种抗荧光闪烁试剂，常用于单分子研究18。Trolox 的抗荧光衰减作用来源于其氧化产物，该产物存在于部分降解的 Trolox 溶液中19。应避免将 Trolox 快速溶解于甲醇或高 pH 的 Tris 溶液中，因为这会导致氧化效率低下。</li>
</ol>
5. 单分子成像
<ol>
	<li>向通道中注入 15 µl NeutrAvidin 溶液（0.5 mg/ml），孵育 2 分钟后用 100 µl T50 缓冲液（10 mM Tris-HCl，50 mM NaCl，pH 7.0）冲洗。</li>
	<li>向通道中注入 50 µl DNA 样品（50–100 pM），孵育 5 分钟后用 100 µl T50 缓冲液冲洗未结合的 DNA。注意：DNA 分子将通过 NeutrAvidin-生物素相互作用特异性结合于表面。</li>
	<li>用含有氧清除系统的成像缓冲液20（100 mM PCD，5 mM PCA，1 mM Trolox 和 500 mM NaCl）充满通道。</li>
	<li>将 EMCCD 设置为帧转移模式，以每秒 25 帧的速度将 2 × 2 二乘二分之二的图像（256 × 256）流式传输至计算机。</li>
	<li>在显微镜物镜上滴加浸油，使用样品夹将流动池固定在显微镜载物台上。通过观察墙上激光反射图案进行粗调焦，再利用显示器上的荧光图像实时视图进行精细调焦。</li>
	<li>开启 532 nm 激光开始数据采集。检查实时图像，必要时调整焦距。当大多数分子发生光漂白后停止数据采集。 
	注意：本实验平台使用实验室自行编写的 C 程序来控制显微镜，并在数据保存至硬盘的同时于显示器上实时显示图像。</li>
</ol>
6. 图像处理与数据分析
注意：使用 MATLAB 代码处理 256 × 256 的图像时间序列，以生成 Cy3 和 Cy5 强度的单分子时间轨迹。为了在分视图图像的供体通道和受体通道之间配对像素，需手动选取 6 至 7 对 Cy3 和 Cy5 斑点，每对斑点来自同一分子且均匀分布在视场中，并利用这些斑点的坐标作为锚定点计算仿射变换。
<ol>
	<li>使用 MATLAB 脚本，检查所有在低 FRET 信号与高 FRET 信号之间发生多次转换的单分子时间轨迹。识别出成环状态和未成环状态。 
	注意：FRET 信号定义为 Cy5 荧光强度（ Ia）除以 Cy3 与 Cy5 荧光强度之和（Ia + Id）。成环状态具有较高的 FRET 值，而未成环状态具有较低的 FRET 值。由于可逆的成环与解环过程，单个分子的 FRET 信号直方图呈双峰分布。</li>
	<li>通过确定两个拟合高斯曲线之间的交点，找到区分这两种分布的阈值。</li>
	<li>根据公式 <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq7.jpg" alt="能量转移效率公式 \( E = \frac{I_a}{I_a + I_d} \)，科学方程。" data-altupdatedat="1762173717000"> 计算 FRET 效率，并将高 FRET 值分配给成环状态，低 FRET 值分配给未成环状态。</li>
	<li>使用 MATLAB 脚本，分析自数据采集开始后不同时间点已成环（或达到高 FRET 状态）的分子累积数量（N(t)）。注意：由于 dsDNA 分子在数据采集开始时可能处于未成环状态的任意构象，因此成环分子群体的增长速率反映了对初始构象平均后的平均成环速率。通过将 N(t) 拟合为指数函数来提取成环速率 kloop：<img fo:content-width="1.8in" src="/files/ftp_upload/51667/eq1.jpg" alt="指数衰减公式，N(t)=N₀(1-exp(-k_loop t))，数学方程。" data-altupdatedat="1762173717000"> 若其增长呈双相特征，则可使用双指数函数拟合：<img fo:content-width="2.2in" src="/files/ftp_upload/51667/eq2.jpg" alt="双指数衰减方程 N(t)=Nf(1-exp(-kft))+Ns(1-exp(-kst))，用于动力学分析。" data-altupdatedat="1762173717000"> 在此情况下，kloop 由下式获得：<img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51667/eq3.jpg" alt="动力学成环方程公式，以教育图示中的数学方程形式展示。" data-altupdatedat="1762173717000"> 注意：理论上，聚合物在时间 t 时尚未成环的存活概率并非单一或双指数函数12。指数拟合仅作为一种实用手段，用于提取平均成环时间。</li>
</ol>
7. 确定J因子
注意：J 因子表示双链 DNA 的一端在另一端周围的局部浓度。可通过插值法确定产生与实测成环速率相同反应速率时，DNA 一端片段相对于另一端片段的浓度，从而得到 J 因子。实验中，将 DNA 的一端片段固定在表面，另一端片段以特定浓度 c 引入。如果测得两端之间的退火速率为 kanneal，则 J 因子21 由以下公式给出：<img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq4.jpg" alt="公式；环状与伸展状态比率的动力学速率常数；科学分析背景。" data-altupdatedat="1762173717000">。退火速率常数（kanneal = kanneal / C）与探针浓度无关。
<ol>
	<li>将 20 µl 的 30–50 pM 生物素-Cy5 寡核苷酸（引物 3）注入链霉亲和素（NeutrAvidin）包被的通道中。用 100 µl T50 缓冲液冲洗通道，以洗去未结合的寡核苷酸。</li>
	<li>按照第 5 部分所述配制成像缓冲液，并加入终浓度为 50 nM 的 Cy3 寡核苷酸（引物 2）。将该成像缓冲液注入通道中。</li>
	<li>保持 532 nm 激光开启，短暂开启 640 nm 激光以识别表面结合的 Cy5 寡核苷酸的位置。关闭 640 nm 激光，并开始监测 FRET 信号。 
	注意：当 Cy3 寡核苷酸与表面结合的 Cy5 寡核苷酸发生杂交时，Cy5 荧光将通过 FRET 产生。</li>
	<li>使用 MATLAB 脚本，根据 Cy5 荧光强度随时间变化的曲线，分析从非结合状态（Cy5 荧光强度低）转变为退火状态（Cy5 荧光强度高）的分子数量随时间的变化。</li>
	<li>绘制退火分子数量随时间变化的曲线。用单指数函数（<img fo:content-width="1.8in" src="/files/ftp_upload/51667/eq5.jpg" alt="指数增长公式 N(t)=N∞(1-exp(-k*t))，用于分析的数学方程" data-altupdatedat="1762173717000">）拟合该曲线，以获得退火速率（kanneal ）。</li>
	<li>在不同 Cy3 寡核苷酸浓度（60、100 和 180 nM）下重复该实验，以验证退火速率与反应物浓度之间的线性关系。从拟合曲线的斜率中提取二级退火速率常数（kanneal ）。</li>
	<li>根据公式 <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq6.jpg" alt="静态平衡表示为公式 J=k_loop/k_anneal；用于过程分析的方程" data-altupdatedat="1762173717000"> 计算 J 因子，其中 kloop 是在相同缓冲条件下测得的成环速率。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

基于FRET的一种简单单分子检测方法被用于研究不同内在构型DNA的成环动力学。通过将一个10个碱基的序列以与DNA螺旋周期（10.5 bp）同相的方式重复，可制备具有弯曲结构的DNA，并可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）估算其弯曲程度。这些双链DNA设计有黏性末端，以实现瞬时成环的稳定。我们通过随时间呈指数增长的成环分子数量提取出成环速率。通过未连接黏性末端片段之间的退火速率常数，可确定成环概率密度的浓度当量，即所谓的J因子。
在基于连接酶的DNA环化实验中，DNA闭合概率的测量对连接酶浓度敏感，若连接酶过量，则可能导致J因子被高估9。DNA连接酶与DNA的非特异性结合也可能影响成环过程10。此外，连接酶活性依赖于盐浓度且会随时间衰减。因此，在不利于连接酶活性的条件下研究DNA成环具有较大困难。相比之下，基于FRET的成环实验则不受上述任何因素的干扰。
我们的实验方案与Vafabakhsh和Ha13的方案相似，但在两个重要方面存在差异，值得讨论。Vafabak...

理解双链DNA的力学性质在基础科学和工程应用中具有重要意义。双链DNA的结构比简单的螺旋梯形更为复杂，因为相邻碱基对之间的滚动角、倾斜角和扭转角会随序列而变化。热涨落可导致双链DNA发生多种构象波动模式，如弯曲、扭转和拉伸。在极端条件下，还可能发生熔解和弯曲等转变过程。
在这些运动中，双链DNA（dsDNA）弯曲具有最显著的生物学影响1。双链DNA的弯曲可通过将两个远距离位点拉近，参与基因的抑制或激活过程。它还在细胞核内或病毒衣壳中的DNA包装过程中发挥重要作用。双链DNA的弯曲形变可通过高分辨率显微镜技术（如原子力显微镜AFM2和透射电子显微镜TEM3）在实验上进行观察，其热力学和动力学特性则可通过环化实验进行研究，该方法通过化学连接双链DNA上相邻的位点来实现。
其中一种检测方法是依赖连接酶的环化反应4。在该实验中，具有“黏性”（互补）末端的双链DNA分子通过DNA连接酶作用发生环化或二聚化。通过比较环状化与二聚体形成的速率，可以获得DNA一端在另一端附近的有效摩尔浓度，这一参数称为J因子。J因子在量纲上等同于在短距离内找到DNA一端相对于另一端的概率密度，因此能够反映DNA的柔韧性。通过测量J因子随DNA长度的变化，可以揭示DNA力学特性的诸多特征，包括持续长度4,5。
蠕虫状链（WLC）模型因其成功解释了DNA拉伸实验中获得的力-伸长曲线6，并准确预测了长度超过200 bp的双链DNA（dsDNA）的J因子7，而被广泛视为描述dsDNA力学性质的标准聚合物模型。然而，Cloutier和Widom在短至100 bp的dsDNA分子上使用环化实验测得的J因子，比WLC模型的预测值高出数个数量级8。一年后，Du et al. 通过使用较低浓度的连接酶进行环化实验，获得了与WLC模型一致的J因子，并将Widom课题组的异常结果归因于其所用连接酶浓度过高9。这一争议凸显了在使用传统环化实验时，DNA连接酶对环化动力学不可避免的影响9。此外，DNA连接酶还可能通过非特异性结合影响DNA的结构和刚性10,11。
为了消除依赖蛋白质的成环实验中的技术难题，我们近期开发了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的无蛋白成环检测方法12。该方法通过在DNA分子黏性末端附近标记的供体和受体之间的FRET信号来检测DNA成环构象。采用物镜型全内反射荧光显微镜（TIRFM），可长时间记录固定于表面的单个DNA分子所发生的可逆成环与解环事件的动态轨迹。本方法采用基于PCR的DNA分子组装策略，生成无错配的DNA分子，相较于Vafabakhsh和Ha所建立的类似方法，是一项关键性改进13。该实验方案的单分子特性不仅可测量整体平均值，还可获得数据分布信息；而FRET检测的优势则允许对同一个DNA分子在不同条件下（甚至在可能抑制连接酶活性的条件下）重复测量DNA成环动力学过程。
TIRFM 装置如图1所示。一个定制设计的样品台放置在奥林巴斯IX61显微镜主体上方。532 nm和640 nm的激光从侧面引入，并通过微小的椭圆镜14反射进入高数值孔径（NA）物镜，以在盖玻片-水界面处实现临界入射角。需要注意的是，对于此FRET应用，也可采用更为常见的基于二向色镜或棱镜的透镜式TIR装置。显微镜形成的荧光图像通过一个二向色镜被分为供体和受体两部分图像，随后分别重成像到一个EMCCD的两个半区上。额外使用长通发射滤光片以降低背景信号。
温度控制对于获得可重复的动力学数据至关重要。为了实现温度控制，物镜与显微镜主体的镜筒分离，以尽量减少热量传递，同时来自温控循环水浴（制冷/加热装置）的水在黄铜环中循环流动，该黄铜环紧密贴合在物镜外壳内部的金属结构周围。该装置可在盖玻片表面实现15至50 °C之间的稳定温度控制（图2）。本研究中，样品温度维持在24 °C。
以下方案介绍了DNA构建、DNA构型估算、单分子实验以及J因子测定的逐步操作流程。

<table><tbody><tr><td>小型DNA片段提取试剂盒-100次</td><td>VWR</td><td>97060-558</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺 40% 溶液 500 ml</td><td>VWR</td><td>97064-522</td><td></td></tr><tr><td>2% (w/v) 双丙烯酰胺溶液 500 ml</td><td>VWR</td><td>97063-948</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp DNA Ladder，100-1,000 bp</td><td>Fermentas</td><td>SM0241</td><td></td></tr><tr><td>微型垂直PAGE系统</td><td>VWR</td><td>89032-300</td><td></td></tr><tr><td>0.2 微米注射器滤器 &amp;mu;m CS50</td><td>VWR</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813-1G</td><td>三重态猝灭剂</td></tr><tr><td>原儿茶酸（PCA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08992-50MG</td><td>氧清除系统</td></tr><tr><td>原儿茶酸3,4-双加氧酶（PCD）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8279-25UN</td><td>氧清除系统</td></tr><tr><td>mPEG-硅烷，分子量 2,000，1 g</td><td>莱桑生物</td><td>MPEG-SIL-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>生物素-聚乙二醇-硅烷，分子量 3,400</td><td>莱桑生物</td><td>Biotin-PEG-SIL-3400-1g</td><td></td></tr><tr><td>亲和素，中性亲和素生物素结合蛋白</td><td>Invitrogen</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start 高保真 DNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>F-540L</td><td></td></tr><tr><td>凝胶/PCR DNA片段提取试剂盒</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47020</td><td></td></tr><tr><td>优质普通玻璃显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>VWR 微型矩形盖玻片，1 号</td><td>VWR</td><td>48404-456</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Isotemp 1006S 循环式制冷加热器</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>温度控制</td></tr><tr><td>目标冷却颈圈</td><td>Bioptechs</td><td>150303</td><td>温度控制</td></tr><tr><td>KMI53 生物显微测微尺载物台</td><td>Semprex</td><td>KMI53</td><td></td></tr><tr><td>高功率二极管泵浦固体激光器 532 nm 50 mW</td><td>Edmund optics</td><td>NT66-968</td><td>Cy3激发</td></tr><tr><td>CUBE 光纤尾纤式 640 nm，30 mW，光纤，FC/APC 接头</td><td>相干的</td><td>1139604</td><td>Cy5 激发</td></tr><tr><td>650 nm BrightLine 二向色分光镜</td><td>Semrock</td><td>FF650-Di01-25x36</td><td>分束二向色镜</td></tr><tr><td>LaserMUX 光束合束器，反射 514.5、532 &amp;和543.5 nm激光器，25 mm</td><td>Semrock</td><td>LM01-552-25</td><td>组合二向色镜</td></tr><tr><td>Brightline 荧光滤光片 593/40</td><td>Semrock</td><td>FF01-593/40-25</td><td>Cy3发射滤光片</td></tr><tr><td>635 nm EdgeBasic LWP 长通滤光片，25 mm</td><td>Semrock</td><td>BLP01-635R-25</td><td>Cy5 发射滤光片</td></tr><tr><td>EMCCD iXon+</td><td>Andor Technology</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td></td></tr><tr><td>IX51 倒置显微镜机身</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100倍油镜TIRF物镜，数值孔径1.49</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜用F型浸油</td><td>Olympus</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>2 mm 直径 45&amp;deg; 铝镀膜棒状透镜&amp;nbsp;</td><td>Edmund optics</td><td>54-092</td><td>微型镜</td></tr><tr><td>1/4&quot; 单轴平移台（便携式）</td><td>Thorlabs</td><td>MS-1</td><td>微型镜面的翻译</td></tr><tr><td>&amp;Oslash;1&quot; 消色差双合透镜，增透膜：400-700 nm，焦距=200 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-200-A</td><td>聚焦透镜</td></tr><tr><td>可调机械狭缝</td><td>Thorlabs</td><td>VA100</td><td></td></tr><tr><td>介质镜</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E02</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Oslash;1&quot; 消色差双合透镜，f = 100 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A</td><td>中继透镜</td></tr><tr><td>镜头安装座 &amp;Oslash;1&quot; 光学</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1</td><td></td></tr><tr><td>二向色滤光片支架</td><td>Thorlabs</td><td>FFM1</td><td></td></tr><tr><td>固定笼立方体平台</td><td>Thorlabs</td><td>B3C</td><td></td></tr><tr><td>用于运动学安装的装置 &amp;Oslash;1&quot; 光学</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td></td></tr><tr><td>N-BK7 平凸透镜 &amp;Oslash;1&quot;，f = 40 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1422-A</td><td>准直透镜</td></tr><tr><td>N-BK7 平凸透镜 &amp;Oslash;6.0 mm，f = 15 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1222-A</td><td>望远镜镜头</td></tr><tr><td>N-BK7 平凸透镜 &amp;Oslash;6.0 mm，f = 150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1433-A</td><td>望远镜镜头</td></tr></tbody></table>

通过单分子fret研究dna成环

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

双链DNA（dsDNA）的弯曲与许多重要的生物学过程相关，例如DNA-蛋白质识别以及DNA在核小体中的包装。双链DNA弯曲的热力学特性可通过一种称为环化的方法进行研究，该方法依赖DNA连接酶将双链DNA的短黏性末端共价连接。然而，连接效率可能受到多种与双链DNA成环无关因素的影响，例如连接黏性末端周围的DNA结构，而连接酶本身也可能通过非特异性结合等机制影响表观成环速率。在此，我们展示了一种无需使用连接酶、通过荧光共振能量转移（FRET）检测瞬时DNA环形成来测量双链DNA成环动力学的方法。双链DNA分子通过一种简单的基于PCR的方案构建，包含FRET荧光对和生物素连接臂。通过成环速率以及两个未连接黏性末端之间的退火速率，可提取出被称为J因子的成环概率密度。通过测试两种具有不同内在曲率的双链DNA，我们证明J因子对双链DNA的内在形状具有敏感性。

用于环化研究的DNA分子包含一段序列和长度可变的双链区域，以及彼此互补的单链突出端。这些突出端长度为7个碱基，能够相互退火以捕获环化状态。每个突出端均含有通过亚磷酰胺化学连接在DNA骨架上的Cy3或Cy5荧光染料。其中，含Cy5的突出端还连接有生物素-TEG（15个原子的四乙二醇间隔臂），用于表面固定（见图4A）。所有这些修饰均可通过基于PCR的实验方案引入双链DNA中（方案1及图3B）。所选用的突出端长度和序列在常规实验条件下可产生可检测且可逆的FRET信号。DNA环的形成与解离动力学对周围温度敏感，因此温度控制器对于实验的可重复性至关重要。此类控制器可方便地集成到显微镜系统中（图2）。
利用全内反射荧光显微镜（TIRFM），观察到表面固定的双链DNA分子上Cy3（供体）和Cy5（受体）信号呈现反相关波动（图4B）。在成环状态下，两个染料之间的距离小于5 nm，由于FRET效率较高，导致Cy5信号强而Cy3信号弱（图4A</str...

本研究介绍了一种利用单分子荧光共振能量转移（FRET）技术测量双链DNA成环动力学的详细实验方法。该方案还描述了如何提取称为J因子的成环概率密度。

通过单分子FRET研究DNA成环

双链DNA（dsDNA）的弯曲与许多重要的生物学过程相关，例如DNA-蛋白质识别以及DNA在病毒和细胞中的包装……

本实验的总体目标是探究在不使用DNA结合蛋白的情况下，双链DNA的成环动力学如何受其自身固有形状的影响。通过将染料分子掺入具有不同弯曲度的双链DNA片段中，即可利用荧光共振能量转移技术监测DNA成环过程。随后，可通过全内反射显微镜观察单个DNA分子的可逆成环与解环事件。随后，可从每个单分子荧光的时间轨迹中推算出DNA的成环速率。最终，可测量DNA的成环概率与片段内在形状之间的关系。该DNA成环检测方法的主要优势在于，它不依赖于可能影响DNA成环动力学的DNA结合蛋白。该简易方案涉及使用一种称为荧光共振能量转移的技术，以及基于PCR的DNA合成。为测量DNA的成环概率，首先通过重复一个10聚体序列来设计全局弯曲的DNA。例如，此代表性序列是一个186碱基对的弯曲DNA，其中X是一个随机额外碱基，而重复的10聚体序列两侧的序列是接头序列。接下来，使用引物一和引物二进行 PCR，其中引物二的 5' 端标记有 FRET 供体 SI 三。然后使用引物三和引物四进行 PCR，通过骨架进行 FRET 受体 SCI 五标记，并在引物三的 5' 端连接生物素接头。使用 PCR 纯化试剂盒纯化 PCR 产物后，将 SCI 三标记产物与 SCI 五标记产物在缓冲液中混合以进行链交换，最终浓度分别为 0.4 µM 和 0.1 µM。随后，将链置于 98.5 摄氏度下孵育两分钟，以每秒 0.1 摄氏度的速率逐渐冷却至 5 摄氏度，然后在 5 摄氏度下孵育两小时。为置换链以制备流动池，请使用钻床和金刚石钻头，在一块 3 英寸 × 1 英寸的载玻片两条对边上钻出六至七对孔。所有孔钻好后，在流动水下摩擦载玻片以去除所有可见的玻璃粉末。将载玻片竖直置于玻璃缸中，并注入蒸馏水。对玻璃缸进行15分钟超声处理，然后将载玻片转移至专用于丙酮清洗的玻璃缸中。向缸内注入丙酮，并在丙酮中对载玻片再进行15分钟超声处理。接下来，用乙醇喷洒载玻片，然后用水冲洗，再将载玻片转移至聚丙烯罐中。向聚丙烯罐中注入五摩尔浓度的氢氧化钾溶液，然后在最后一次清洗后，将载玻片再超声处理15分钟，随后用蒸馏水冲洗载玻片，再进行15分钟的超声处理。清洁盖玻片后，再次进行超声处理。以同样方式，在每个载玻片上滴加80微升新鲜配制的PEG溶液，然后轻轻地将盖玻片覆盖在PEG液滴上。45分钟后，使用镊子将盖玻片从载玻片上取下，用大量蒸馏水冲洗载玻片和盖玻片。待盖玻片和载玻片干燥后，将其置于干燥器中干燥，然后在载玻片上粘贴双面胶带薄条以形成通道，将盖玻片沿胶带条对齐覆盖，并用力按压盖玻片以形成液密通道。随后，使用五分钟环氧树脂密封通道边缘，以固定分子用于显微成像。首先，向一个通道内注入15微升链霉亲和素溶液。等待两分钟后，用100微升T50缓冲液冲洗该通道，然后向通道内注入50微升DNA样品。五分钟后，用 100 µL T 50 缓冲液冲洗掉未结合的 DNA，然后用含有氧气清除系统的成像缓冲液充满通道。现在将浸镜油滴在显微镜物镜上，然后用标本夹将流动池固定在显微镜载物台上。打开 532 纳米激光器。使用监视器上的荧光图像实时视图进行精细调整。调节焦距。开启 532 纳米激光器，开始数据采集。当大部分分子发生光漂白时，停止数据采集以处理和分析图像，使用 MATLAB 脚本遍历所有显示高、低 FRET 信号间多次转换的单分子时间轨迹。识别成环与未成环状态，然后通过确定两条拟合高斯曲线之间的交点，找到区分这两个分布的分界阈值。接着，通过将供体荧光强度除以供体与受体荧光强度之和来计算 FRET 效率。将高FRET值状态指定为成环状态，低FRET值状态指定为非成环状态。随后，使用MATLAB脚本分析在不同时间间隔内发生成环（即达到高FRET状态）的分子累积数NFT。自数据采集开始起，通过将NFT与指数函数进行拟合，即可提取出成环速率K_loop。若NFT增加bi，基本上可按方程所示用双指数函数拟合。此时，从此方程获得K下标loop以确定J因子流。将20微升浓度为30至50皮摩尔的生物素sci五寡核苷酸或引物三加入其中一个nut travain包被的通道，操作如前所述。接下来，用 100 µL T50 缓冲液冲洗通道，以洗去未结合的寡核苷酸，然后将补充了 PS3 寡核苷酸的新鲜制备的成像缓冲液注入样品室。保持 532 纳米激光开启，然后短暂开启 640 纳米激光，以定位任何表面结合的 sci-fi 寡核苷酸的位置。随后关闭 640 纳米激光，开始监测 FRET 信号。使用 MATLAB 脚本分析起始时处于未结合状态的分子数量。即具有低 sci5 荧光强度，但随后转变为 IL 状态的分子。即具有高 sci5 荧光强度的分子，作为时间的函数，从 sci5 荧光强度轨迹中，绘制此退火分子数量随时间变化的曲线，并用单指数函数拟合该曲线以获得退火速率。K_anil，在不同SI3寡核苷酸浓度下重复实验，以确认退火速率与反应物浓度之间的线性关系。从斜率中提取二级退火速率常数K'_ail。最后，计算J因子，其中K_loop是在相同缓冲条件下测得的成环速率，以测试双链DNA的内在曲率对成环的影响。在本实验中，构建了一条直链和一条弯曲的186碱基对双链DNA。与直链DNA相比，弯曲DNA在同一时间段内被确定会产生更多高FRET事件。在同一采集时间内，弯曲DNA的成环频率也比直链DNA高出四倍，这表明DNA的内在曲率能显著影响其成环动力学。在这最后的分析步骤中，J因子通过将成环速率除以一级退火速率常数计算得出，确定直链DNA的J因子为61 ± 3 nM，弯曲DNA的为265 ± 48 nM，这与先前的研究结果一致。遵循此流程，可以研究诸如温度、张力与粘度等环境因素对成环迁移率的影响。本方案不仅有助于研究DNA的聚合物物理学特性，还能向科研初学者或普通观众展示单分子荧光技术的强大功能。

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