多步制备技术以回收多种代谢物化合物类别用于深入且信息丰富的代谢组学分析

本实验的总体目标是展示一种有效分离复杂生物流体中代谢物的方法，以获得简化的样品，从而提高代谢组覆盖度。首先向每个样品中加入内标物，以监测样品制备和仪器条件的重复性；第二步是向每个样品中加入冰甲醇，以沉淀可能干扰后续色谱分离和质谱分析的蛋白质。

接下来，液-液萃取步骤将亲水性代谢物与疏水性代谢物分离。最后一步是固相萃取，以进一步将脂质代谢物分为磷脂、脂肪酸和中性脂质。最终，这种联合的多步方法可实现有效的分离、优异的重复性，并提高对血浆代谢组的覆盖度。

与现有方法（如简单的甲醇提取法）相比，该技术的主要优势在于能够获得更全面的代谢物覆盖，尤其是脂质类物质，这在进行代谢组学分析研究或当脂质为特定关注对象时尤为重要。在进行蛋白质沉淀之前，首先将样本置于室温下解冻。随后，向样本中加入预先配制好的内标物（ISTD）。

所有标准浓度均已根据所用质谱（MS）和高效液相色谱（HPLC）仪器的灵敏度进行相应调整。分析时，向每个样品中加入 10 微升。对于亲水性和疏水性标准溶液，分别向每个样品中加入 10 微升的一倍、两倍或四倍阳性对照溶液。

所有样本加入内标物和阳性对照溶液后，每份样本涡旋振荡10秒。开始蛋白质沉淀时，向每份样本中加入400 µL冰甲醇。每管涡旋振荡10秒，然后在0 °C条件下以18,000 ×g离心15分钟。

G：离心后，管底应形成蛋白质沉淀。将上清液全部转移至新的玻璃培养管中，然后在氮气下干燥。此干燥残留物后续将进行液-液萃取。

对于蛋白质沉淀组分的分析，向白色或类白色蛋白质沉淀中加入一毫升甲基叔丁基醚（MTBE），每管涡旋振荡30秒，然后在0°C条件下以18,000 ×g离心15分钟。将MTBE层倾析至新的玻璃培养管中。由于不同样品的沉淀体积可能存在差异，因此重要的是要始终为所有样品吸取相同体积的MTBE。

例如，如果含上清液最少的样本只能倾倒出 900 微升，则仅倾倒 900 微升。对所有样本，在蛋白沉淀中加入 1 毫升甲基叔丁基醚（MTBE），涡旋振荡 30 秒，然后在 0 °C 下以 18,000 × g 离心 15 分钟。参照之前步骤，吸除 MTBE 层并转移至先前准备好的玻璃培养管中。

用氮气流干燥样品，并在200微升氯仿-甲醇1:1溶液中重新悬浮。将每个样品转移至离心管中，在0°C、18,000 × g条件下离心15分钟。随后，使用玻璃移液管将上清液转移至自动进样器螺口小瓶中。开始此操作时，用玻璃移液管向先前制备的干燥甲醇残留物中加入3毫升甲基叔丁基醚（MTBE），并涡旋振荡30秒。

随后，向每个试管中加入 750 µL 水，涡旋振荡 10 秒。在室温下以约 200 × g 离心 10 分钟，离心后可见两个明显分层。小心吸取上层 2.5 mL MTBE 层，避免吸到下方的水相，并转移至洁净的玻璃培养管中。向每个样品剩余的水相部分加入 3 mL MTBE。

每管涡旋10秒，然后在室温下以约200 × g离心10分钟。用移液器吸取3 mL甲基叔丁基醚（MTBE），注意避免吸入水相，并与之前收集的MTBE管合并。此MTBE相后续将进行固相萃取。

将剩余的水相在氮气下干燥浓缩。将残余物重新悬浮于100微升的溶液一中，并向每管加入400微升预冷甲醇，涡旋混匀，然后转移至微量离心管中。在-80摄氏度下静置20至30分钟，使残留的蛋白质在甲醇中充分沉淀。

接下来在0°C、18,000 × g条件下离心15分钟，离心后管壁应出现沉淀。用移液器吸取450微升上清液，注意避免吸到沉淀，并转移至一支干净的微量离心管中。在真空离心浓缩仪中于不超过45°C的条件下完全干燥，时间约为1至2小时。将干燥后的残留物用200微升5%乙腈水溶液重新悬浮，并涡旋振荡混匀。

将样品快速转移至自动进样瓶、进样器、小瓶中，并在负80摄氏度下冷冻。开始固相萃取步骤时，在35摄氏度下用氮气吹扫先前获得的MTBE组分10至15分钟，直至完全干燥。当MTBE组分完全干燥后，停止通入氮气，并使用玻璃移液管将每个样品迅速重悬于1毫升氯仿中，涡旋混匀。

用400微升正己烷对固相萃取（SPE）柱进行两次快速洗涤和活化。弃去废液，并更换新的玻璃收集管。将样品加入SPE柱中，施加真空，收集流出液。

用玻璃移液管向固相萃取柱中加入1毫升2:1的氯仿-异丙醇溶液，并将流出液收集到相同的玻璃管中。此为中性组分。用氮气吹干中性组分10至15分钟。

为尽量减少氧化，使用玻璃移液管向固相萃取柱中加入一毫升5%乙酸乙醚溶液，并收集流出液。此为脂肪酸组分。使用氮气吹干脂肪酸组分10至15分钟，以尽量减少氧化，操作时使用塑料吸头。

向固相萃取小柱中加入 800 微升甲醇，并用 15 毫升塑料锥形管收集流出液，此为磷脂组分。将磷脂组分转移至 1.5 毫升离心管中，于 45 °C 下用真空离心浓缩仪干燥样品约 1 至 1.5 小时。最后，将来自三个组分的每份样品重新悬浮于 200 微升 100% 甲醇中，转移至自动进样器小瓶中，并储存于 -80 °C 冰箱中。

M-T-B-E-S-P-E 方法在提取脂质标准品和内源性代谢物方面的有效性得到了验证，与甲醇提取或仅使用 MTBE 提取等其他方法相比，在采用定性和定量软件比较特征数量时，该方法获得了更优的提取效率和更广泛的代谢物覆盖范围。在进行液相色谱-质谱（LC-MS）分析后，对 M-T-B-E-S-P-E 方法所得固相萃取（SPE）三个组分进行比较，结果显示三者之间的重叠信号极少，表明该方法能够高效地将疏水性代谢物按其化学类别分离，从而提高代谢物鉴定的可信度。此外，通过 M-T-B-E-S-P-E 方法在各组分中对内标物的回收实验（NR 12）表明，各内标物均出现在与其化学类别相对应的组分中。

为评估色谱重现性，对三个独立的混合血浆质控样本进行了数据样本制备，并在LCM MSS仪器上对每个样本进行三针重复进样。一致的重叠峰表明仪器和样本制备具有良好的重现性。在脂肪酸组分的负离子化模式中观察到的化学噪声增加，可能是由于LCM S溶剂中的污染物所致。

因此，仅分析了在九分钟之前出现的代谢物。请注意，本实验中使用的氯仿、甲基叔丁基醚（MTBE）、乙醚，甚至一些更常见的试剂均具有极高危险性，在操作过程中必须采取防护措施，例如穿戴实验服、手套和护目设备，并在通风橱内进行样品制备。