多步制备技术，以恢复多个代谢化合物的种类进行深入和信息化代谢组学分析

该程序的总体目标是展示一种在复杂生物液体中分离代谢物的有效方法，以获得简化的样品以提高代谢组的覆盖率。为此，首先在每个样品中加入内标，以监测样品制备和仪器条件的重现性。第二步是向每个样品中加入冰冷的甲醇以沉淀蛋白质，否则可能会干扰后续的色谱和质谱分析。

接下来，液态液体萃取步骤将亲水性代谢物与疏水性代谢物分离。最后一步是固相萃取，将脂质代谢物进一步分馏成磷脂、脂肪酸和中性脂质。最终，这种组合多步骤方法用于显示有效的分离、出色的重现性和改进的血浆代谢组覆盖率。

与现有方法（例如简单的甲醇提取）相比，该技术的主要优点是我们获得了更高的代谢物覆盖率，尤其是脂质，这在进行代谢组学分析研究或对脂质特别感兴趣时非常重要。在蛋白质沉淀之前，首先准备样品，将样品解冻至室温。接下来，用预先制备的内标 ISTD 加标样品。

所有标准品浓度均已根据所用 MS 和 HPLC 仪器的灵敏度进行了必要调整。分析时，每个样品加标 10 μL。亲水性和疏水性标准溶液分别向每个样品中加入 10 μL 1 x 2 x 或 4 x 阳性对照溶液。

用内标和阳性对照溶液加标所有样品后，将每个样品涡旋 10 秒钟。开始蛋白质沉淀时，向每个样品中加入 400 μL 冰冷的甲醇。每管涡旋 10 秒，在 0 摄氏度下离心 15 分钟，18， 000 次。

G，应在试管底部形成蛋白质沉淀。离心后，将所有上清液转移到新的玻璃培养管中，然后在氮气下干燥。这些干燥的残留物稍后将进行液体萃取。

为了分析蛋白质沉淀组分，将 1 毫升甲基甲虫醚或 MTBE 添加到白色或灰白色蛋白质沉淀涡旋中每管 30 秒，并在零摄氏度下以 18， 000 次离心 15 分钟。G 将 MTBE 层倒出到新的玻璃培养管中。由于沉淀的大小因样品而异，因此对所有样品始终吸取相同量的 MTBE 非常重要。

例如，如果上清液量最少的样品只能倾析 900 μL，则倒出 900 μL。对于所有样品，再向蛋白沉淀涡旋中加入 1 毫升 MTBE，持续 30 秒，然后在 0 摄氏度或 15 分钟下离心。像以前一样加入 18， 000 倍 G，吸出 MTBE 层并加入到先前制备的玻璃培养管中。

通过氮气流干燥样品，并重悬于 200 μL 的一对一氯仿甲醇中。将每个样品转移到离心管中，并在 0 摄氏度下以 18， 000 倍 G 离心 15 分钟，然后用玻璃移液器将上清液转移到 autos 进样器螺帽小瓶中。要开始此过程，请使用玻璃移液器将 3 毫升 MTBE 添加到先前制备的干燥甲醇残留物中，然后涡旋 30 秒。

之后，向每根试管中加入 750 微升水并涡旋 10 秒。在室温下以约 200 倍 G 离心 10 分钟，可见两个不同的层离心后，小心吸出 2.5 mL 顶部 MTBE 层，不要移液下面的水层，然后转移到干净的玻璃培养物中。二。将 3 毫升 MTBE 添加到每个样品的剩余水部分中。

并每管涡旋 10 秒，以约 200 倍 G 离心 10 分钟。在室温下，吸出 3 毫升 MTBE，不要加水，并与之前的 MTBE 管混合。该 MTBE 馏分稍后将进行固相萃取。

通过在氮气下干燥来浓缩剩余的水层。将残留物重悬于 100 μL 的 1 中，并向每个试管涡旋中加入 400 μL 冰冷的甲醇，然后转移到微量离心管中。在零下 80 摄氏度下放置 20 至 30 分钟，让任何剩余的蛋白质在甲醇中沉淀出来。

接下来以 18， 000 倍 G 的离心力在零摄氏度下离心 15 分钟，离心后沿管侧面应有沉淀，吸出 450 微升上清液，不吸出沉淀物，转移至干净的微量离心管中。在不超过 45 摄氏度的真空离心浓缩器中完全干燥约 1 至 2 小时。将干燥的上清液重悬于 200 μL 5% 乙酰腈水中并涡旋。

将样品短暂转移到自动进样器、进样器、样品瓶中，并在零下 80 摄氏度下冷冻。要开始固相萃取程序，请在 35 至 C 的良好氮气流下干燥先前获得的 MTBE 馏分 10 至 15 分钟。当 MTBE 馏分完全干燥时，停止氮气流动，并使用玻璃移液器涡旋将每个样品快速重悬于一毫升氯仿中。

用 400 μL 己烷短暂清洗和调节固相萃取或 SPE 小柱两次。丢弃废物并更换新的玻璃收集管。将样品添加到 SPE 色谱柱中，施加真空并收集流出物。

使用玻璃移液器，向 SPE 色谱柱中加入 1 毫升 2：1 氯仿异丙醇，并在同一玻璃管中收集流出液。这是中性分数。在氮气下干燥中性馏分 10 至 15 分钟。

为了尽量减少玻璃移液器的氧化，向 SPE 色谱柱中加入 1 毫升 5% 乙酸的乙醚溶液，并收集流出物。这是脂肪酸分数。使用塑料吸头在氮气下干燥脂肪酸组分 10 至 15 分钟，以尽量减少氧化。

向 SPE 小柱中加入 800 μL 甲醇，并将流经的液流收集在 15 mL 塑料锥形管中，即为磷脂馏分。将磷脂组分转移至 1.5 mL离心管中，用真空离心浓缩器在 45 °C 下干燥样品约 1 至 1.5 小时。最后，reus 将三个馏分中的每个样品悬浮在 200 μL 100% 甲醇中，转移到自动进样器、进样器、小瓶中，并储存在负 80 摄氏度的冰箱中。

当使用定性和定量软件比较特征数量时，与甲醇萃取或仅 MTBE 萃取相比，M-T-B-E-S-P-E 方法在提取脂质标准品和内源性代谢物方面的有效性得到了总体上更好的提取和代谢物覆盖。液相色谱质谱分析后，M-T-B-E-S-P-E 馏分的比较显示，SPE 后三个馏分之间的重叠极小，这表明可以高效地将疏水性代谢物分离为各自的化学类别，从而更可靠地鉴定代谢物。此外，使用 M-T-B-E-S-P-E 方法（NR 12）对内标进行馏分回收表明，内标在其化学类别相关的馏分中有所提及。

为了评估数据的色谱重现性，对三个单独的混合血浆 QC 样品进行样品制备，并在 LCM MSS 仪器上将每个样品一式三份进样。一致的重叠证明了仪器和样品制备的重现性。观察到的脂肪酸组分负电离模式的化学噪声增加可能是由于 LCM S 溶剂中的污染物造成的。

因此，仅分析了 9 分钟之前暗示的代谢物。不要忘记，使用氯仿、MTBE、乙醚，甚至该方法中使用的更常见的试剂都可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如穿着实验室外套、戴手套和护目镜以及在通风橱中进行样品制备。