原位检测脑和心脏中使用主要组织相容性复合物II类右旋糖酐微球的自身反应性CD4 T细胞

本实验的总体目标是利用MHC II类分子dex三聚体，高特异性地检测自身反应性T细胞。在本视频中，从小鼠脑中获取脑组织，该小鼠为髓鞘蛋白脂质蛋白诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎模型小鼠。该过程首先通过精细地采集组织并制备组织块来完成。

第二步是使用viome将包埋有aros的组织切成200微米厚的切片。然后将切片转移至24孔板中的组织孵育腔内进行染色和固定。最后一步是将组织切片封片于显微镜载玻片上。

最终，使用共聚焦显微镜观察与葡聚糖探针和CD4抗体结合的细胞。我们最初提出这一想法，是在首次证明MHC II类葡聚糖探针在检测抗原特异性自身反应性CD4 T细胞方面比传统的MHC II类四聚体更为敏感时。通常，刚接触该方法的研究者会遇到困难，因为新鲜组织的切片及其操作具有较高的技术挑战性。

该方法的可视化演示至关重要，因为切片、封片和分析步骤较难掌握，操作较为复杂。除了丁博士外，我团队中的两位博士后研究人员 Chandy 和 Aaron，以及 Zoe 博士实验室的 Christian 也将共同演示该操作流程。在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠实施安乐死后，使用弯头剪刀以环形方式剪开颅骨，再用镊子小心翻转颅骨，暴露颅腔。使用洁净的解剖刀通过钝性解剖法取出脑组织。

将大脑半球与小脑分离。将大脑半球放入含有冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS）的离心管中，并将离心管置于冰上直至处理。将大脑半球置于冰上保存的一次性深底模具组织学盒中。

然后将熔融的4% PBS缓冲低熔点琼脂糖倒入胶带盒中。立即用镊子轻轻按压大脑，使组织完全浸入琼脂糖中，并将胶带盒置于冰上直至完全凝固。凝固后，修去包埋组织四周多余的琼脂糖，并略微暴露大脑腹侧表面。

接下来，将Vibram组织块表面涂抹瞬间胶，然后将包埋了aros的组织转移至涂胶的表面，使脑部暴露的腹面朝下贴合胶水，以便进行横切。组织一旦放置在块上后，不要再移动。将含有aros包埋组织的振动切片块置于冰上，静置使胶水干燥15分钟。

同时，将制备好的组织小室放入24孔板中，每孔放置一个组织小室。向含有组织小室的孔中加入1毫升冰冷的1×PBS，并将该板置于冰上。待胶水干燥后，将振动切片机刀片降至组织表面高度。

将Vibram切片速度设置为0.22毫米每秒，并以前向运动方式开始切片，制备200微米厚的脑组织切片。使用水彩软毛刷将每一片脑组织转移至组织室中。在24孔板中，切片完成前需将板置于冰上，以防止组织降解。

接下来，准备第二块24孔板，在其中3个孔中各加入300微升含有S型髓磷脂蛋白脂质蛋白1 39至1 51右旋体与CD4抗体的混合液。然后在另外3个孔中各加入300微升对照用IA型S型小鼠脑脊髓炎病毒70至86右旋体与CD4抗体的混合液。随后对各孔进行标记。

然后将含有指定用特定dex切割酶染色切片的三个组织孵育室转移至24孔板中指定的三个孔内，每孔放置一个孵育室。同样，将含有指定用对照dex扩增子染色切片的三个组织孵育室转移至其他相应孔中。每孔放置一个孵育室后，用盖子盖住各孔。

用铝箔包裹培养板，置于室温避光的摇床上，以缓慢旋转孵育1.5小时。孵育结束后，将组织切片转移至含有1毫升冰冷1×PBS洗涤液的新孔中，在摇床上洗涤至少10分钟，重复此洗涤步骤三次。

确保组织切片不会变干，因为它们可能会粘附在孵育 chamber 的侧壁上。将组织孵育 chamber 转移至一个新的孔中进行固定，该孔来自 24 孔板，内含一毫升过滤后的 4% 磷酸盐缓冲液（PBS）配制的多聚甲醛，置于摇床上以轻柔振荡孵育两小时。

再用 PBS 洗涤切片三次后，将染色并固定的切片置于干净的显微镜载玻片上。使用一支水彩软笔轻轻擦去多余的水分，注意不要触碰切片，然后用封片剂封片。加盖显微镜盖玻片，并将载玻片在室温下静置过夜，使其干燥。

在暗室中，使用 Nikon A1 Eclipse 90i 共聚焦显微镜系统进行常规扫描和图像采集。启动 NIS-Elements AR 软件，从面板中选择四乙基罗丹明、异硫氰酸荧光素或 TritC 以及 Cyan5 或 SCI5 通道。TritC 和 SCI5 通道的激发和发射波长默认显示。

将Trit Sea通道指定为绿色伪彩，SCI五通道指定为红色伪彩。将待检玻片置于显微镜载物台上，在100倍放大倍数下手动聚焦。将HV设为110，偏移量设为零，单击聚焦并调节电压。

为优化激光效果，请点击聚焦扫描，从上至下扫描样本，并设置用于图像采集的Z轴层面。然后点击通道序列（CH series），按顺序采集图像。通过红色和绿色通道信号的共定位情况，识别呈黄色点状的右旋（dextro）或阳性CD4阳性T细胞。

使用 Olympus FV 500 BX 60 共聚焦显微镜，可简便地对右旋或阳性 CD4 阳性 T 细胞进行定量计数。首先，打开 flu ovu 软件。从下拉菜单中选择染料 S SI 3 和 SCI 5，然后点击应用以加载相应的激光器。

将待观察的玻片置于显微镜载物台上，在低倍镜下手动对焦，同时开启SI三激光器，并对准炎症部位进行聚焦。将物镜切换至100倍放大倍数。在下拉菜单中将文件大小设置为512×512，点击对焦，并分别调节PMT增益和偏移值，以优化SI三和SCI五激光器的成像效果。点击Z轴载物台，然后在两个激光器均开启的状态下再次点击对焦。

通过点击向上和向下箭头设置Z轴的厚度。将Z轴间隔设置为2 µm。点击停止并选择。

依次选择 1、2、3，然后点击 X、y、Z，开始采集炎症灶内选定区域的Z系列图像，并将Z序列图像保存为VI文件。保存图像文件时，从Z序列图像中选择所需图像，然后以TIFF格式保存。

始终保存多页 TIFF 图像。首先为保护数据，下一步是检查三对经两组 dex 修剪剂染色的切片。首先，通过以水平垂直向上、水平垂直向下的移动方式扫描载玻片来获取 Z 序列图像，以避免在同一焦平面内重复获取 Z 序列图像。

获取Z序列图像后，应根据切片编号、切片名称以及所采集的Z序列图像数量对文件进行命名。使用ImageJ软件统计右旋阳性CD4阳性T细胞占CD4阳性T细胞总数的比例。在ImageJ中选择计数工具类型，勾选“显示全部”，通过点击每个细胞的中心开始计数，并利用侧向箭头在不同的Z序列图像中继续计数。

计数所有 CD4 T 细胞后，选择另一种计数器并计数 dextro 阳性 CD4 阳性 T 细胞。点击结果标签页，获取使用两种不同计数器计数的细胞总数。采用 EAE 小鼠新鲜制备的脑组织切片，通过共聚焦显微镜（LSCM）检测髓鞘蛋白脂蛋白（PLP）特异性 CD4 T 细胞，切片经含抗 CD4 抗体及 PLP 139-151 Dexters 或对照 TMEV 70-86 Dexters 的混合染色液染色。

共染色脑切片分析显示，PLP 139至151 dex三聚体阳性细胞呈红色，CD4抗体阳性细胞呈绿色，而双阳性细胞呈黄色。共染色细胞在周边区域呈现点状斑点，而在使用对照TMEV 70至86染色的切片中未见此特征。

通过原位染色法使用心脏肌球蛋白重链α 334至352 Dextramer检测心脏肌球蛋白特异性CD4+ T细胞，也已进行。利用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）对这些图像进行分析，结果显示：呈红色的MYHC 334至352 Dextramer阳性细胞，呈绿色的CD4阳性细胞，以及同时结合Dextramer和CD4的黄色点状细胞。对照组RNAs 43至56 Dextramer的背景染色可忽略不计。一旦掌握该技术，若操作得当，可在约8至10小时内完成，而其他已发表的方案则需三天时间。

在进行此操作时，重要的是要提前准备好试剂，并系统地遵循各个步骤。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对组织进行切片和染色，以对目标组织中的C反应性CD4 T细胞进行计数。