快速分离纯化线粒体移植用组织分离和鉴别过滤
September 6th, 2014
一种用于线粒体的从哺乳动物组织活检快速分离方法进行说明。大鼠肝或骨骼肌肉制剂匀浆与商业组织离解和线粒体是通过尼龙网过滤分离差过滤。线粒体隔离时间是相对于60 <30分钟 - 用替代的方法100分钟。
该程序的总体目标是从大鼠组织中快速分离纯且具有呼吸能力的线粒体。这是通过首先关联和匀浆组织样品来实现的。下一步是将亚蛋白 A 混合到匀浆中并在冰上孵育。
然后过滤 BSA 中的匀浆混合并再次过滤。最后的步骤是离心滤液并将线粒体沉淀重悬于呼吸缓冲液中。最终，结果可以通过呼吸分析和 A TP 发光测定表明分离的线粒体是活的并且具有呼吸能力。
与报告线粒体分离时间从 60 到 100 分钟不等的现有方法相比，该技术的主要优点是可以在不到 30 分钟的时间内分离出活的和具有呼吸能力的线粒体。Allison mackay，来自合作实验室的技术人员将在开始之前演示 A TP 发光检测。将子蛋白 A 溶解在 1 毫升均质缓冲液中，并将 BSA 也溶解在 1 毫升均质缓冲液中。
现在开始使用 6 毫米活检样品打孔器收集两个新鲜组织样本，并将它们储存在 50 升离心管中的冰上 XPBS 中。准备好后，将组织转移到含有 5 毫升冰冷匀浆缓冲液的解离 C 管中。然后通过将试管安装到组织解离并选择预设的线粒体分离循环来匀浆组织。
完成后，将试管放回冰上，并在储备溶液中加入 250 μL Sub 溶液。通过倒置来混合它。当混合物看起来分布均匀时，将匀浆在冰上孵育 10 分钟。
接下来，将 40 微米网状过滤器放在 50 毫升锥形离心管上，并将其装入冰中。用均质缓冲液润湿过滤器，然后将缓冲液丢弃到废液容器中。然后，一旦一切准备就绪，将匀浆倒入滤液中。
加入 250 微升 BSA 储备溶液，倒置混合。但是，对于线粒体蛋白分析，应跳过此步骤。现在再准备两个。
50 毫升冰上锥形离心管，一个装有 40 微米过滤器，另一个装有 10 微米过滤器。用少许匀浆缓冲液润湿两个过滤器并丢弃该缓冲液。然后先将匀浆倒入 40 微米过滤器，然后倒入 10 微米过滤器。
这些过滤步骤显着提高了线粒体的纯度。现在将滤液分装在两个预冷的 1.5 毫升微量离心管中，并在 4 摄氏度下以 9， 000 Gs 离心 10 分钟。然后去除上清液，重悬并混合两个纯化的线粒体沉淀。
在一毫升冰冷的呼吸缓冲液中，整个过程必须在 4 摄氏度下进行，这一点至关重要。现在可以测试纯化的线粒体以确定分离的线粒体的代谢活性。A TP 发光检测可以使用 A TP 检测试剂盒进行。
首先，将试剂盒试剂加热至室温。接下来，制备 HT P 储备溶液并将其置于冰上。下一步是将 5 mL 底物缓冲液添加到冻干底物溶液中。
轻轻混合并置于黑暗中。然后向不透明黑色的 96 孔板的每个孔中加入 100 微升呼吸缓冲液。将 10 微升制备的线粒体添加到低于 A TP 标准的孔中。
每个独特的线粒体样品应接种在一式三份的板中，仅三个孔的呼吸缓冲液作为阴性对照。加载后，继续向每个孔中加入 50 μL 哺乳动物细胞裂解溶液。将板在 37 摄氏度下在轨道摇床上以 120 RPM 的速度孵育 5 分钟。
在孵育过程中，制备 A TP 标准品的稀释液，范围从 1 个 10 毫摩尔到 1 个 10 微摩尔。孵育后，将 10 μL 每种 A TP 标准品添加到板图上指示的相应孔中。接下来，向每个底物中加入 50 微升重构的底物溶液。
然后像以前一样再次孵育板 5 分钟。继续在读板器上检查板。打开下面的软件。
创建新项。单击 Experiment（实验）。然后点击 default protocol 并点击 ok。
在左列中，选择 protocol （协议）。然后过程 Next，选择 delay，并将其设置为 10 分钟。然后，好的，条目。
现在从下拉菜单中选择、读取并选择 luminescence。按如下方式调整其他设置。读取类型 终端节点集成时间。
一秒。滤光片设置一个发射孔光学位置，顶部灵敏度 100，顶部探头垂直偏移 1 毫米。进行这些设置更改后，单击 Ok （确定）。
单击板布局并进行相应设置。单击 确定。现在，所有内容都已设置完毕，单击顶行的 read plate 图标，然后单击 read。
当分光光度计打开时，将板放入托盘中，A孔位于左上角。现在将打开一个显示温度的框，单击确定，然后继续数据分析。根据粒径计数，重约 0.18 克湿的骨骼肌样本产生了约 240 亿个线粒体。
相同大小的肝脏样本多出数十亿个。使用粒子计数器低估了线粒体血细胞仪读数。获得了具有代表性的轨迹，表明分离的线粒体位于一个平均直径约为十分之四微米的峰下。
这与之前使用双酸测定的报道一致。线粒体蛋白以每克骨骼肌和肝脏组织几毫克的含量进行测量。该产品是可行的，并且呼吸能力强。
在适合临床和手术治疗干预的时间范围内分离线粒体。透射电子显微镜照片显示，分离的线粒体均为电子凹痕，损伤程度低于 10， 000 分之一，污染率低于 1/10 万 A TP 测定。结果显示，线粒体是可行的，TP 含量约为每毫克线粒体蛋白 11 或 15 纳摩尔。
使用 Clark 型电极进行线粒体呼吸分析，结果显示耗氧量约为每分钟 180 MLE 氧气。对于每毫克线粒体蛋白，虽然 RCI 值都在 2.5 左右，肝脏评分略高一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在不到 30 分钟的时间内完成。
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概述
本文描述了一种从大鼠组织活检中分离出纯净且具有呼吸能力的线粒体的快速方法。与传统方法相比，该程序显著缩短了分离时间至30分钟以内。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 线粒体研究
背景
- 线粒体对于细胞呼吸和能量生产至关重要。
- 传统的线粒体分离方法可能耗时较长。
- 快速分离技术可以提高实验效率。
- 活力良好的线粒体对于准确的代谢研究至关重要。
研究目的
- 开发一种从哺乳动物组织中分离线粒体的更快方法。
- 确保分离出的线粒体纯净且具有功能能力。
- 为后续的呼吸分析和ATP测定提供便利。
使用的方法
- 大鼠肝脏或骨骼肌样本的均质化。
- 使用商业组织解离器进行高效混合。
- 通过尼龙网过滤器进行顺序过滤。
- 在呼吸缓冲液中重悬线粒体沉淀。
主要结果
- 分离时间缩短至30分钟以内。
- 分离出的线粒体展示出活力和呼吸能力。
- 结果通过呼吸分析和ATP荧光测定验证。
- 该方法显示出在代谢研究中应用更广泛的潜力。
结论
- 该快速分离方法对获得功能性线粒体是有效的。
- 该技术可以简化线粒体研究中的研究过程。
- 未来的研究可能会探索其在各种哺乳动物组织中的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rapid mitochondrial isolation under 30 minutes enables timely functional assessment for preclinical metabolic studies and therapeutic screening. This method supports target validation by providing respiration-competent mitochondria from tissue biopsies, reducing biological variability in early discovery. The standardized tissue dissociation and filtration workflow improves reproducibility across labs, facilitating consistent data generation for go/no-go decisions in mitochondrial-targeted programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mitochondrial function as a therapeutic target in metabolic disease models.
- Operational Value: Replaces manual homogenization with standardized tissue dissociation for uniform sample preparation.
- Predictive Value: Yields viable mitochondria for respiration and ATP assays, supporting mechanistic de-risking of lead compounds.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides purified mitochondria suitable for high-content respiration and luminescence-based assays.
- Operational Value: Eliminates repetitive centrifugation steps through differential filtration, increasing throughput.
- Assay Readiness: Delivers consistent mitochondrial yields (~2x10^10 per 0.18g tissue) for reliable compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains mitochondrial integrity and respiration competence, critical for preclinical efficacy testing.
- Operational Value: Compatible with clinical timelines, enabling isolation within surgical intervention windows.
- Translational Continuity: Supports biomarker alignment via ATP content and oxygen consumption metrics.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from early target validation to preclinical mitochondrial assessment, offering a rapid, reproducible step before compound screening or efficacy studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of mitochondrial dysfunction in disease models through functional readouts.
- Screening: Enables assay-ready mitochondrial preparations with improved purity via sequential 40µm and 10µm filtration.
- Analytics: Generates quantitative outputs for respiration analysis (oxygen consumption) and ATP luminescence, facilitating condition comparisons.
- Translational Research: Connects to preclinical validation via respiration-competent mitochondria suitable for ex vivo testing.
- Enterprise Reuse: Standardized protocol using commercial tissue dissociator allows cross-lab adoption and workflow integration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in mitochondrial target engagement through validated respiration and ATP assays.
- Operational Value: Reduced isolation time (<30 min) and elimination of gradient centrifugation steps increase lab efficiency.
- Strategic Value: Enables faster iteration in lead identification by providing timely mitochondrial functional data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by reducing false positives in mitochondrial-targeted screening.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling and mitochondrial assay techniques.
- Dependent on access to a commercial tissue dissociator with preset mitochondrial isolation cycle.
- Necessitates sterile nylon mesh filters (40µm and 10µm) and temperature-controlled centrifugation (4°C, 9,000 x g).
- Standardization across tissue types (e.g., skeletal muscle, liver) may require optimization of dissociation parameters.
- Practical limitation: Method validated in rat tissues; extrapolation to human or other mammalian tissues requires additional validation.
