Name: 快速分离纯化线粒体移植用组织分离和鉴别过滤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 学习快速分离纯化具有呼吸活性线粒体的方法，使用大鼠肝脏或骨骼肌组织，通过组织解离器和尼龙滤膜过滤，在30分钟内完成分离。该方法适用于神经科学和细胞生物学研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由美国国家心肺血液研究所资助项目HL-103542以及波士顿儿童医院麻醉研究基金会授予CAP的杰出开拓者奖支持。

准备
<ol>
	<li>配制 1 M K-HEPES 储存液（用 KOH 调节 pH 至 7.2）。</li>
	<li>配制 0.5 M K-EGTA 储存液（用 KOH 调节 pH 至 8.0）。</li>
	<li>配制 1 M KH2PO4 储存液。</li>
	<li>配制 1 M MgCl2 储存液。</li>
	<li>配制匀浆缓冲液（pH 7.2）：300 mM 蔗糖、10 mM K-HEPES 和 1 mM K-EGTA。4 °C 保存。</li>
	<li>配制呼吸缓冲液：250 mM 蔗糖、2 mM KH2PO4, 10 mM MgCl2, 20 mM K-HEPES 缓冲液（pH 7.2）和 0.5 mM K-EGTA（pH 8.0）。4 °C 保存。</li>
	<li>通过将 80 g NaCl、2 g KCl、14.4 g Na2HPO4 和 2.4 g KH2PO4 溶解于 1 L 双蒸 H2O 中配制 10x PBS 储存液（pH 7.4）。</li>
	<li>取 100 ml 10x PBS 加入 1 L 双蒸 H2O 中，配制 1x PBS。</li>
	<li>通过称取 4 mg 枯草杆菌蛋白酶 A（Subtilisin A）至 1.5 ml 微离心管中配制枯草杆菌蛋白酶 A 储存液。-20 °C 保存至使用。</li>
	<li>通过称取 20 mg 牛血清白蛋白（BSA）至 1.5 ml 微离心管中配制 BSA 储存液。-20 °C 保存至使用。</li>
</ol>
线粒体分离（图 1）
<ol>
	<li>分离前立即用1 ml均质缓冲液溶解Subtilisin A。</li>
	<li>分离前立即用1 ml均质缓冲液溶解BSA。</li>
	<li>使用6 mm活检取样器采集两份新鲜组织样本，并将其置于盛有1x PBS的50 ml锥形离心管中，冰上保存。</li>
	<li>将两份6 mm组织样本转移至含有5 ml冰冻均质缓冲液的解离C管中。</li>
	<li>将解离C管安装至组织解离仪上，启动预设的线粒体分离程序（均质化60秒），对组织进行均质处理。</li>
	<li>将解离C管转移至装有冰的容器中。</li>
	<li>向匀浆液中加入250 μl Subtilisin A储存液，通过倒置混匀，并在冰上孵育10分钟。
	<ol>
		<li>若组织为纤维性组织，此步骤可选：以750 × g离心4分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将40 µm滤网置于冰上的50 ml锥形离心管上，用均质缓冲液预润湿滤网，然后将匀浆液过滤至该离心管中。</li>
	<li>向滤液中加入250 µl新鲜配制的BSA储存液，通过倒置混匀。 
	注意：如需进行线粒体蛋白测定，则省略此步骤。</li>
	<li>将40 µm滤网置于冰上的50 ml锥形离心管上，用均质缓冲液预润湿滤网，然后将滤液再次过滤至该离心管中。</li>
	<li>将10 µm滤网置于冰上的50 ml锥形离心管上，用均质缓冲液预润湿滤网，然后将滤液过滤至该离心管中。</li>
	<li>将滤液转移至两个预冷的1.5 ml微量离心管中，在4 ºC下以9,000 × g离心10分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀重悬于1 ml冰冻呼吸缓冲液中，并合并沉淀。</li>
</ol>
ATP 检测
注意：为了测定分离线粒体的代谢活性，可使用ATP检测试剂盒进行ATP发光检测。检测试剂盒中已提供相应的实验方案、试剂和标准品。以下为该操作步骤的简要说明。
<ol>
	<li>将试剂盒试剂平衡至室温。</li>
	<li>将冻干的ATP粉末溶于1,170 µl双蒸水中，配制10 mM ATP储备液。ATP标准储备液和制备好的线粒体样品置于冰上保存。</li>
	<li>向一管冻干底物溶液中加入5 ml底物缓冲液，轻轻混匀后避光放置。</li>
	<li>向黑色不透光底96孔板的所有孔中加入100 µl呼吸缓冲液。&#160;</li>
	<li>将制备好的样品中的10 µl线粒体加入黑色不透光底96孔板的各个孔中。注意：样品需设三个复孔。设一排用于标准品，并设三个负对照孔（仅含呼吸缓冲液）。</li>
	<li>向所有孔（包括标准品和对照孔）中加入50 µl哺乳动物细胞裂解液。</li>
	<li>将酶标板置于37 ºC、125 rpm的振荡培养箱中孵育5分钟。</li>
	<li>在孵育期间，用10 mM ATP储备液配制浓度分别为0.1 mM、0.05 mM、0.01 mM、0.005 mM、0.001 mM和0.0001 mM的ATP标准品溶液，标准品置于冰上保存。</li>
	<li>孵育结束后，根据板图指示，向相应孔中加入10 µl ATP标准品溶液。注意：标准品设两个复孔。</li>
	<li>向每个孔中加入50 µl重构后的底物溶液。</li>
	<li>将酶标板置于37 ºC、125 rpm的振荡培养箱中继续孵育5分钟。</li>
	<li>在连接分光光度计的计算机上打开Gen5 1.11软件。</li>
	<li>在“创建新项目”下，点击“实验”。</li>
	<li>点击“默认方案”，然后点击“确定”。</li>
	<li>在左侧栏中选择“方案”，然后选择“步骤”。</li>
	<li>选择“延迟”，设置为00:10:00，点击“确定”。</li>
	<li>选择“读数”，从下拉菜单中选择“发光检测”，并调整其他参数如下：读数类型为终点法，积分时间0:01.00 MM:SS.ss，滤光片设置1，发射孔，光路位置为顶部，灵敏度100，顶部探针垂直偏移1.00 mm。</li>
	<li>当酶标板准备就绪后，点击顶部的“读板”图标，然后点击“读数”。当分光光度计打开后，将酶标板放入托盘中，确保A1孔位于左上角。此时会弹出温度提示框，点击“读数”。注意：信号值越高，表明ATP水平越高，代谢活性越强。</li>
</ol>

<ol><li>van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S. J., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondrial+factors+in+apoptosis%3A+a+Russian+roulette+with+more+than+one+bullet%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet.</a> Cell Death Differ. 9 (10), 1031-1042 (2002).</li>
<li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+the+hub+of+cellular+Ca2%2B+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling.</a> Physiology (Bethesda). 23, 84-94 (2008).</li>
<li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+Dynamic+Organelles+in+Disease%2C+Aging%2C+and+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: Dynamic Organelles in Disease, Aging, and Development.</a> Cell. 125 (7), 1241-1252 (2006).</li>
<li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+Isolation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods.</a> PLoS ONE. 6 (3), e18317(2011).</li>
<li>Bensley, R. R., Hoerr, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+cell+structure+by+freeze-drying+method%3B+preparation+and+properties+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Studies on cell structure by freeze-drying method; preparation and properties of mitochondria.</a> Anat Rec. 60, 449-455 (1934).</li>
<li>Claude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+mammalian+liver+cells+by+differential+centrifugation+II.+Experimental+procedures+and+results%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation II. Experimental procedures and results.</a> J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).</li>
<li>Hogeboom, H., Schneider, W. C., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues%3B+isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver%3B+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).</li>
<li>Ernster, L., Schtaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+a+historical+Review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: a historical Review.</a> J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li>
<li>Schmitt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-automated+method+for+isolating+functionally+intact+mitochondria+from+cultured+cells+and+tissue+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies.</a> Anal Biochem. 443 (1), 66-74 (2013).</li>
<li>Fernández-Vizarra, E., Ferrín, G., Pérez-Martos, A., Fernández-Silva, P., Zeviani, M., Enríquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).</li>
<li>Graham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+3%2C+Unit+3.3%2C+Isolation+of+mitochondria+from+tissues+and+cells+by+differential+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 3, Unit 3.3, Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation.</a> Curr Protoc Cell Biol. , (2001).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).</li>
<li>Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nat Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).</li>
<li>Gostimskaya, I., Galkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+highly+coupled+rat+heart+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of highly coupled rat heart mitochondria.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li>
<li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Anal Biochem. 418 (2), 213-223 (2011).</li>
<li>Masuzawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+autologously+derived+mitochondria+protects+the+heart+from+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+J+Physiol+Heart+and+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury.</a> American J Physiol Heart and Circ Physiol. 304 (7), (2013).</li>
<li>McCully, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+isolated+mitochondria+during+early+reperfusion+for+cardioprotection%5BTitle%5D)+AND+%22American+J+Physiol+Heart+and+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection.</a> American J Physiol Heart and Circ Physiol. 296 (1), 94-105 (2009).</li>
<li>Olson, M. S., Von Korff, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+endogenous+substrates+of+isolated+rabbit+heart+mitochondria+during+storage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Changes in endogenous substrates of isolated rabbit heart mitochondria during storage.</a> J Biol Chem. 242 (2), 325-332 (1967).</li>
<li>Diepart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+measuring+oxygen+consumption+in+tumor+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for measuring oxygen consumption in tumor cells in vitro.</a> Anal Biochem. 396 (2), 250-256 (2010).</li>
<li>Lanza, I. R., Nair, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assessment+of+isolated+mitochondria+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Functional assessment of isolated mitochondria in vitro.</a> Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).</li>
</ol>

所有动物均按照现行的机构指南进行处理。我们没有需要披露的竞争性财务利益。

要成功利用本方案分离线粒体，必须将所有溶液和组织样本保持在冰上，以维持线粒体的活性。即使始终置于冰上，分离得到的线粒体其功能活性也会随着时间推移而下降19。我们建议所有溶液和添加物均预先配制。我们将Subtilisin A预先称重，以4 mg分装于1.5 ml微量离心管中，于-20 °C保存。同样，将BSA预先称重，以20 mg分装于1.5 ml微量离心管中，也可在-20 °C保存。使用前，将上述分装管从-20 °C取出，分别用1 ml匀浆缓冲液溶解Subtilisin A和BSA，用于线粒体分离实验。
使用6 mm活检穿孔器从骨骼肌组织获取的两块活检样本，足以提供用于临床和外科手术治疗干预所需的线粒体17-18。为了估算线粒体数量，我们采用了两种方法：血细胞计数板法和颗粒大小计数法。推荐使用颗粒大小计数法。颗粒大小计数仪利用电阻抗技术，测量通过特定尺寸孔径的颗粒体积。尽管颗粒大小计数仪成本较高，但其提供的估算结果准确可靠，且不受操作者影响。通过血细胞计数板法估算线粒体数量则更为经济。我们的研究表明，该方法所得结果变异较大，估算值通常比颗...

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/51682">Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration.</a> An optional step was added to step 7 of the &#39;Mitochondrial Isolation&#39; section of the protocol. The step is:
1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.

A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration.

Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

线粒体存在于人体除红细胞外的每个细胞中，参与大量重要的细胞和代谢过程1-4。由于具有多种功能，线粒体损伤可能产生有害影响3。为了研究线粒体功能与功能障碍，已有多种线粒体分离方法被报道。最早关于线粒体分离的文献可追溯至20世纪40年代5-8。首次有记录的尝试是通过研钵研磨肝组织，随后在盐溶液中以低速离心实现线粒体分离5,8。此后，其他研究团队在此基础上进行了改进，发展出基于差速离心的组织分级分离技术6-8。这些早期方法奠定了当前技术的基础，现代方法通常结合了匀浆和/或差速离心步骤9-15。不同实验方案中匀浆和离心步骤的数量各不相同。这些重复操作延长了线粒体分离所需时间，并最终降低其活性。此外，若操作控制不当，手工匀浆可能导致线粒体损伤并产生不一致的结果10,16。
近期，我们采用匀浆和差速离心法分离线粒体，并将其移植至心肌组织17,18。该分离过程耗时较长，约需90分钟，因此其临床应用受到限制。为了实现在线粒体在临床和外科治疗中的急性治疗用途，我们开发了一种快速的线粒体分离方法，可在30分钟内完成。
本方案的主要优势在于，标准化的组织解离可实现均匀且一致的组织匀浆，而手动匀浆难以达到这种效果。此外，采用差速过滤替代差速离心，避免了耗时且重复的离心步骤，从而能够更快速地分离出高纯度、具有活性且具备呼吸功能的线粒体。
在不到30分钟内分离出具有活性且具备呼吸功能的线粒体，使其具备临床应用价值。该分离方案有望应用于冠状动脉旁路移植术（CABG）及其他治疗性操作中。

<table><tbody><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Substilsin A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5380</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P2173</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374</td><td></td></tr><tr><td>ATPlite 发光检测试剂系统，&lt;br/&gt; 1,000 次检测装</td><td>Perkin Elmer</td><td>6016941</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 圆锥形离心管</td><td>BD</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m 尼龙滤器</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C 管</td><td>Miltenyl Biotech</td><td>120-005-331</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf 管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>6 mm 活检打孔器</td><td>Miltex</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;m Pluristrainer 滤器</td><td>Pluriselect</td><td>43-500-10-03</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 离心机 5415C</td><td>Marshall Scientific</td><td>EP-5415C&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS 组织解离仪&amp;nbsp;</td><td>Miltenyl Biotech</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板，组织培养处理</td><td>VWR</td><td>82050-732</td><td></td></tr><tr><td>Rotomax 120 旋转摇床</td><td>Heidolph</td><td>544-41200-00</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4 多功能混合型&lt;br/&gt; &amp;nbsp;微孔板读板仪</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multisizer 4 库尔特计数器</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63076</td><td></td></tr><tr><td>Oxytherm 系统</td><td>Hansatech Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr></tbody></table>

通过组织解离与差速过滤快速分离与纯化用于移植的线粒体

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

先前描述的使用差速离心和/或Ficoll梯度离心的线粒体分离方法需要60至100分钟才能完成。我们介绍一种利用商用组织解离仪和差速过滤法从哺乳动物活检组织中快速分离线粒体的方法。在此方案中，手动匀浆被组织解离仪的标准匀浆循环所取代，从而实现均匀且一致的组织匀浆，这是手动匀浆难以达到的效果。在组织解离后，匀浆液通过尼龙网滤器过滤，从而省去了重复的离心步骤。因此，线粒体分离可在30分钟内完成。该分离方案可从0.18 ± 0.04 g（湿重）的组织样本中获得约2 × 1010个具有活力且具备呼吸功能的线粒体。

使用组织解离和差速过滤法分离线粒体的操作步骤示意图如图所示 图1总操作时间少于30分钟。
使用6 mm活检穿孔器获取组织样本。组织重量为0.18 ± 0.04 g（湿重）。通过颗粒大小计数测定的线粒体数量显示，骨骼肌中分离得到的线粒体数量为2.4 × 1010 ± 0.1 × 1010，肝脏组织中为2.75 × 1010 ± 0.1 × 1010（图2A）。为便于比较，还使用血细胞计数板测定线粒体数量。血细胞计数板测定结果显示，骨骼肌中线粒体数量低估为0.11 × 1010 ± 0.04 × 1010，肝脏组织中为0.34 × 1010 ± 0.09 × 1010（图2A）。基于粒径分析仪测定的线粒体直径如图2B所示。代表性图谱显示，分离的线粒体集中在单一峰内，平均直径为0....

本文介绍了一种从哺乳动物组织活检样本中快速分离线粒体的方法。大鼠肝脏或骨骼肌样品使用商用组织解离仪进行匀浆，并通过尼龙滤网过滤实现差速分离线粒体。线粒体分离时间小于&#60;30分钟，而采用其他方法通常需要60至100分钟。

先前描述的采用差速离心法和/或Ficoll梯度离心法分离线粒体的方法需要60至100分钟……

本实验的总体目标是从大鼠组织中快速分离出纯净且具有呼吸功能的线粒体。首先通过结合并匀质化组织样品来实现这一目标，接下来将Subin A加入匀浆液中，并在冰上孵育。随后将匀浆与牛血清白蛋白（BSA）混合并进行过滤，再重复过滤一次。最后步骤为离心滤液，并将线粒体沉淀重悬于呼吸缓冲液中。最终可通过呼吸分析和ATP发光检测证明所分离的线粒体具有活性并具备呼吸功能。与现有方法相比，该技术的主要优势在于，现有方法报告的线粒体分离时间从60分钟到100分钟不等，而本方法可在30分钟内分离出具有活性且具备呼吸功能的线粒体。来自合作实验室的技术员Allison mackay将演示ATP发光检测法。在开始之前，将亚精胺（subin A）溶于1毫升匀浆缓冲液中，同时将牛血清白蛋白（BSA）也溶于1毫升匀浆缓冲液中。现在开始使用6毫米活检取样器采集两份新鲜组织样本，并将其保存在含有冰上预冷的1×PBS的50毫升离心管中。准备好后，将组织转移至含有5毫升冰浴匀浆缓冲液的解离C管中。然后，将该管安装到组织解离仪上，选择预设的线粒体分离程序，对组织进行匀浆处理。完成操作后，将离心管放回冰上，加入250 µL裂解液储存溶液。通过倒置混匀。当混合物呈现均匀分布时，将匀浆在冰上孵育10分钟。接下来，将一个40微米的网状滤器置于50毫升的锥形离心管上，并将该装置放入冰中。用匀浆缓冲液润湿滤器，然后将缓冲液弃入废液容器中。待一切准备就绪后，将匀浆液倒入滤器中，收集滤过液。加入250 µL BSA储存溶液，通过倒置混匀。但是，线粒体蛋白分析应跳过此步骤。现在再准备两份。将50毫升锥形离心管置于冰上，分别装上40微米滤膜和10微米滤膜。用少量匀浆缓冲液润湿两张滤膜后弃去该缓冲液。随后先将匀浆液通过40微米滤膜过滤，再通过10微米滤膜过滤。这些过滤步骤可显著提高线粒体的纯度。现在将滤液分装至两个预冷的1.5毫升微量离心管中，在4°C条件下以9,000 ×g离心10分钟。然后弃去上清液，重悬并合并两个纯化的线粒体沉淀。在1毫升冰冷的呼吸缓冲液中，整个操作过程必须在4摄氏度下进行，这一点至关重要。现在可以对纯化的线粒体进行检测，以确定所分离线粒体的代谢活性。可使用ATP检测试剂盒进行ATP发光检测。首先，将试剂盒中的试剂恢复至室温。接着，配制HT P储存液并置于冰上。下一步是向冻干的底物溶液中加入5 mL底物缓冲液。轻轻混匀后置于避光处。然后向不透光的黑色96孔板的每个孔中加入100 µL呼吸缓冲液。向ATP标准品下方的孔中加入10 µL已制备的线粒体。每种独特的线粒体样品均应设置三个复孔，并设三个仅含呼吸缓冲液的孔作为阴性对照。加样后，向每个孔中加入50微升哺乳动物细胞裂解液。将酶标板置于37摄氏度、120 RPM的振荡培养箱中孵育5分钟。孵育期间，配制一系列ATP标准品稀释液，浓度范围从十分之一毫摩尔至十分之一微摩尔。孵育结束后，根据板图指示，向各相应孔中加入10微升ATP标准品。接着，向每孔加入50微升复溶的底物溶液。然后再次将培养板孵育，与之前相同，孵育5分钟。接着在酶标仪上观察培养板。打开相应的软件。创建一个新项目。点击实验，然后点击默认方案，再点击确定。在左侧栏中选择“方案”，然后选择“步骤”。接下来，选择“延迟”，并将其设置为10分钟。然后确认该条目。现在从下拉菜单中选择、读取并选择发光。将其他设置调整如下：读取类型为终点法积分时间。一秒钟。滤光片组设置为一个发射孔光学位置，顶部灵敏度为100，顶部探针垂直偏移1毫米。完成这些设置更改后，单击“确定”。点击板布局并相应地进行设置。点击确定。现在所有设置已完成，点击顶部一行的读板图标，然后点击读取。当分光光度计开启后，将酶标板放入托盘中，确保A1孔位于左上角。此时将弹出显示温度的对话框，点击“确定”，然后继续进行数据分析。根据颗粒大小计数，约0.18克湿重的骨骼肌样本可获得约240亿个线粒体。相同大小的肝脏样本产生的线粒体数量多出数十亿。使用颗粒计数器时，线粒体血细胞计数仪的读数被低估。获得了一条代表性曲线，显示分离的线粒体集中在单一峰内，平均直径约为零点四微米。这与先前使用双酸法测定的报道一致。骨骼肌和肝脏组织中，每克组织的线粒体蛋白含量为数毫克。该产物具有活性且具备呼吸功能。分离线粒体的时间框架符合临床和外科治疗干预的要求。透射电子显微镜图像显示，所分离的线粒体均为电子致密结构，每10,000个中受损少于1个，每100,000个中污染少于1个，ATP检测结果表明线粒体具有活性，其ATP含量约为每毫克线粒体蛋白11至15纳摩尔。采用克拉克型电极进行线粒体呼吸分析，结果显示氧气消耗量约为每分钟180 MLEs。每毫克线粒体蛋白的呼吸控制指数（RCI）值均约为2.5，其中肝脏样本略高。一旦掌握该技术，若操作得当，可在30分钟内完成。

rapid-isolation-purification-mitochondria-for-transplantation-tissue

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

快速分离纯化线粒体移植用组织分离和鉴别过滤

我们描述了一种用于分离纯度高、耦联紧密的大鼠心脏线粒体的方案，适用于细胞生物能量学的功能或结构研究、生物物理测量、蛋白质组学或线粒体DNA与脂质分析。...

大鼠心脏线粒体的高效偶联制备

本视频介绍了使用差速离心结合密度梯度离心法从人卵巢癌组织中分离线粒体的实验步骤。所分离的线粒体可用于人卵巢癌线粒体蛋白质组的蛋白质组学分析。...

线粒体分离：一种从人卵巢癌组织样本中分离线粒体的技术

比较样品间线粒体膜电位可提供有关细胞状态的重要信息。本文详细描述了分离线粒体以及利用荧光法检测其对抑制剂和解偶联剂反应的实验步骤。通过细胞培养和细胞应激动物模型的应用，展示了该实验方案的方法学特点及其应用价值。...

从培养细胞和小鼠组织中分离线粒体及其功能分析

本文介绍了一种对先前报道方法的改进，该方法能够从小鼠骨骼肌的较小组织量中分离出高质量且高纯度的线粒体。该实验流程所获得的线粒体具有高度偶联性，在基于微孔板的呼吸测定实验中表现出良好的呼吸功能。...

从小鼠骨骼肌微量样本中分离线粒体用于高通量微孔板呼吸测定

在此实验中，从一只麻醉的猪体内取出股四头肌组织样本，并通过差速离心法分离线粒体。随后，采用高分辨率呼吸测定法测定线粒体呼吸链复合物I、II和IV的呼吸速率。...

通过差速离心法从骨骼肌中分离完整线粒体用于高分辨率呼吸测定

线粒体具有特化的核糖体，这些核糖体与其细菌和细胞质中的对应物存在差异。本文展示了如何从HEK细胞的天然区室中获取线粒体核糖体。该方法包括从悬浮细胞中分离线粒体，进而纯化线粒体核糖体。...

快速分离HEK细胞中的线粒体核糖体

我们提出了一种两步法高纯度线粒体分离方案，适用于蛋白质组水平的蛋白质鉴定与定量分析。该方案无需基因工程操作，因此适用于从任何原代细胞和组织中提取线粒体进行研究。...

无标记两步法分离线粒体以提升蛋白质发现与定量

线粒体接触位点是与线粒体内膜和外膜蛋白相互作用的蛋白质复合物。这些位点对于线粒体膜之间的通讯至关重要，从而也介导了细胞质与线粒体基质之间的交流。本文描述了一种用于鉴定可能属于此类特定蛋白质的候选分子的方法。...

一种改进的线粒体接触位点分离方法

本方案描述了一种在样品量有限的情况下分析呼吸链超级复合物的技术。...

从小型组织和细胞培养样品中分离线粒体用于线粒体超复合物分析

线粒体的生物能量学和代谢组学研究揭示了其在多种疾病中的多重作用，但这些细胞器的分离方法各不相同。本文详述的方法能够从多种组织来源中纯化出高质量的线粒体。其质量通过高分辨率呼吸测定法评估的呼吸控制比及其他指标来确定。...

从啮齿类动物心脏组织中稳健分离线粒体

学习快速分离纯化具有呼吸活性线粒体的方法，使用大鼠肝脏或骨骼肌组织，通过组织解离器和尼龙滤膜过滤，在30分钟内完成分离。该方法适用于神经科学和细胞生物学研究。

通过组织解离与差速过滤快速分离与纯化用于移植的线粒体

探索更多视频