通过组织解离与差速过滤快速分离与纯化用于移植的线粒体
2014年9月6日
本文介绍了一种从哺乳动物组织活检样本中快速分离线粒体的方法。大鼠肝脏或骨骼肌样品使用商用组织解离仪进行匀浆，并通过尼龙滤网过滤实现差速分离线粒体。线粒体分离时间小于<30分钟，而采用其他方法通常需要60至100分钟。
本实验的总体目标是从大鼠组织中快速分离出纯净且具有呼吸功能的线粒体。首先通过结合并匀质化组织样品来实现这一目标，接下来将Subin A加入匀浆液中，并在冰上孵育。
随后将匀浆与牛血清白蛋白（BSA）混合并进行过滤，再重复过滤一次。最后步骤为离心滤液，并将线粒体沉淀重悬于呼吸缓冲液中。最终可通过呼吸分析和ATP发光检测证明所分离的线粒体具有活性并具备呼吸功能。
与现有方法相比，该技术的主要优势在于，现有方法报告的线粒体分离时间从60分钟到100分钟不等，而本方法可在30分钟内分离出具有活性且具备呼吸功能的线粒体。来自合作实验室的技术员Allison mackay将演示ATP发光检测法。在开始之前，将亚精胺（subin A）溶于1毫升匀浆缓冲液中，同时将牛血清白蛋白（BSA）也溶于1毫升匀浆缓冲液中。
现在开始使用6毫米活检取样器采集两份新鲜组织样本，并将其保存在含有冰上预冷的1×PBS的50毫升离心管中。准备好后，将组织转移至含有5毫升冰浴匀浆缓冲液的解离C管中。然后，将该管安装到组织解离仪上，选择预设的线粒体分离程序，对组织进行匀浆处理。
完成操作后，将离心管放回冰上，加入250 µL裂解液储存溶液。通过倒置混匀。当混合物呈现均匀分布时，将匀浆在冰上孵育10分钟。
接下来，将一个40微米的网状滤器置于50毫升的锥形离心管上，并将该装置放入冰中。用匀浆缓冲液润湿滤器，然后将缓冲液弃入废液容器中。待一切准备就绪后，将匀浆液倒入滤器中，收集滤过液。
加入250 µL BSA储存溶液，通过倒置混匀。但是，线粒体蛋白分析应跳过此步骤。现在再准备两份。
将50毫升锥形离心管置于冰上，分别装上40微米滤膜和10微米滤膜。用少量匀浆缓冲液润湿两张滤膜后弃去该缓冲液。随后先将匀浆液通过40微米滤膜过滤，再通过10微米滤膜过滤。
这些过滤步骤可显著提高线粒体的纯度。现在将滤液分装至两个预冷的1.5毫升微量离心管中，在4°C条件下以9,000 ×g离心10分钟。然后弃去上清液，重悬并合并两个纯化的线粒体沉淀。
在1毫升冰冷的呼吸缓冲液中，整个操作过程必须在4摄氏度下进行，这一点至关重要。现在可以对纯化的线粒体进行检测，以确定所分离线粒体的代谢活性。可使用ATP检测试剂盒进行ATP发光检测。
首先，将试剂盒中的试剂恢复至室温。接着，配制HT P储存液并置于冰上。下一步是向冻干的底物溶液中加入5 mL底物缓冲液。
轻轻混匀后置于避光处。然后向不透光的黑色96孔板的每个孔中加入100 µL呼吸缓冲液。向ATP标准品下方的孔中加入10 µL已制备的线粒体。
每种独特的线粒体样品均应设置三个复孔，并设三个仅含呼吸缓冲液的孔作为阴性对照。加样后，向每个孔中加入50微升哺乳动物细胞裂解液。将酶标板置于37摄氏度、120 RPM的振荡培养箱中孵育5分钟。
孵育期间，配制一系列ATP标准品稀释液，浓度范围从十分之一毫摩尔至十分之一微摩尔。孵育结束后，根据板图指示，向各相应孔中加入10微升ATP标准品。接着，向每孔加入50微升复溶的底物溶液。
然后再次将培养板孵育，与之前相同，孵育5分钟。接着在酶标仪上观察培养板。打开相应的软件。
创建一个新项目。点击实验，然后点击默认方案，再点击确定。
在左侧栏中选择“方案”，然后选择“步骤”。接下来，选择“延迟”，并将其设置为10分钟。然后确认该条目。
现在从下拉菜单中选择、读取并选择发光。将其他设置调整如下：读取类型为终点法积分时间。
一秒钟。滤光片组设置为一个发射孔光学位置，顶部灵敏度为100，顶部探针垂直偏移1毫米。完成这些设置更改后，单击“确定”。
点击板布局并相应地进行设置。点击确定。现在所有设置已完成，点击顶部一行的读板图标，然后点击读取。
当分光光度计开启后，将酶标板放入托盘中，确保A1孔位于左上角。此时将弹出显示温度的对话框，点击“确定”，然后继续进行数据分析。根据颗粒大小计数，约0.18克湿重的骨骼肌样本可获得约240亿个线粒体。
相同大小的肝脏样本产生的线粒体数量多出数十亿。使用颗粒计数器时，线粒体血细胞计数仪的读数被低估。获得了一条代表性曲线，显示分离的线粒体集中在单一峰内，平均直径约为零点四微米。
这与先前使用双酸法测定的报道一致。骨骼肌和肝脏组织中，每克组织的线粒体蛋白含量为数毫克。该产物具有活性且具备呼吸功能。
分离线粒体的时间框架符合临床和外科治疗干预的要求。透射电子显微镜图像显示，所分离的线粒体均为电子致密结构，每10,000个中受损少于1个，每100,000个中污染少于1个，ATP检测结果表明线粒体具有活性，其ATP含量约为每毫克线粒体蛋白11至15纳摩尔。
采用克拉克型电极进行线粒体呼吸分析，结果显示氧气消耗量约为每分钟180 MLEs。每毫克线粒体蛋白的呼吸控制指数（RCI）值均约为2.5，其中肝脏样本略高。一旦掌握该技术，若操作得当，可在30分钟内完成。
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概述
本文介绍了一种从大鼠组织活检样本中快速分离纯度高且具有呼吸功能的线粒体的方法。与传统方法相比，该方法将分离时间显著缩短至30分钟以内。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 线粒体研究
背景
- 线粒体对细胞呼吸和能量产生至关重要。
- 传统的线粒体分离方法可能耗时较长。
- 快速分离技术可提高实验效率。
- 具有活性的线粒体对于准确的代谢研究至关重要。
研究目的
- 建立一种更快捷的从哺乳动物组织中分离线粒体的方法。
- 确保所分离的线粒体具有高纯度和良好的功能活性。
- 为后续的呼吸作用分析和ATP检测提供便利。
使用的方法
- 大鼠肝脏或骨骼肌样品的匀浆处理。
- 使用商用组织解离仪进行高效混匀。
- 通过尼龙网筛进行逐级过滤。
- 将线粒体沉淀重悬于呼吸缓冲液中。
主要结果
- 分离时间缩短至不到30分钟。
- 分离得到的线粒体表现出活性和呼吸功能。
- 通过呼吸分析和ATP发光检测验证了结果。
- 该方法在代谢研究中具有更广泛的应用潜力。
结论
- 快速分离方法适用于获取具有功能的线粒体。
- 该技术可简化线粒体研究中的实验流程。
- 未来的研究可探索其在多种哺乳动物组织中的应用。
常见问题
行业重要性概述
在30分钟内快速分离线粒体，可及时进行功能评估，适用于临床前代谢研究和药物筛选。该方法通过从组织活检样本中获取具有呼吸功能的线粒体，支持靶点验证，减少早期发现阶段的生物学变异。标准化的组织解离和过滤操作流程提高了不同实验室之间的可重复性，有助于在线粒体靶向项目中做出一致的“推进/终止”决策。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：可在代谢疾病模型中将线粒体功能作为治疗靶点进行研究。
- 操作价值：采用标准化的组织解离方法替代手动匀浆，实现样品制备的一致性。
- 预测价值：可获得具有活性的线粒体，用于呼吸和ATP检测，支持对先导化合物进行机制层面的风险评估。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：提供适用于高通量呼吸和基于发光检测的高纯度线粒体。
- 操作价值：通过差速过滤消除重复的离心步骤，提高处理通量。
- 检测适用性：每0.18 g组织可获得稳定且一致的线粒体产量（约2×10^10），适用于可靠的化合物筛选。
转化与临床前研究
- 科学价值：维持线粒体完整性和呼吸功能，对临床前疗效测试至关重要。
- 操作价值：与临床时间线相兼容，可在手术干预时间窗内完成分离。
- 转化连续性：通过ATP含量和氧气消耗指标支持生物标志物的匹配。
流程与工作流整合
该方法适用于从早期靶点验证到临床前线粒体评估的发现连续过程，可在化合物筛选或药效学研究之前提供一个快速且可重复的步骤。
- 发现生物学：通过功能性读数支持在疾病模型中对线粒体功能障碍进行假设验证。
- 筛选：通过连续的40µm和10µm过滤，实现纯度更高的即用型线粒体制备。
- 分析：生成用于呼吸分析（耗氧量）和ATP发光检测的定量结果，便于不同条件间的比较。
- 转化研究：提供具有呼吸活性的线粒体，适用于离体检测，从而衔接临床前验证。
- 企业级复用：采用商用组织解离仪的标准操作流程，支持跨实验室推广及工作流程整合。
运营与企业影响
- 科学价值：通过经过验证的呼吸和ATP检测，可预测线粒体靶点结合的置信度。
- 操作价值：缩短分离时间（<30分钟）并省去梯度离心步骤，提高实验室效率。
- 战略价值：通过及时提供线粒体功能数据，加快先导化合物的筛选迭代。
- 项目组合影响：通过减少线粒体靶向筛选中的假阳性结果，支持基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备组织处理和线粒体检测技术方面的专业知识。
- 依赖于配备预设线粒体分离程序的商用组织解离仪。
- 需要无菌尼龙筛网滤器（40µm 和 10µm）以及温度可控的离心设备（4°C，9,000 × g）。
- 在不同类型组织（如骨骼肌、肝脏）间的标准化可能需要优化解离参数。
- 实际局限性：该方法已在大鼠组织中验证；外推至人类或其他哺乳动物组织需进一步验证。
