在造血干细胞和祖细胞的成年小鼠颅骨骨髓体内四维跟踪
September 4th, 2014
造血干细胞和祖细胞（HSPCs）和骨髓龛之间的相互作用的性质知之甚少。定制的硬件修改和多步获取协议允许使用双光子共焦显微术图像体外骨髓区域内驻留标记HSPCs，跟踪相互作用和运动。
该程序的总体目标是获得包含造血干细胞和祖细胞的高分辨率 3D 堆栈，并通过多点延时成像监测它们随时间的变化。这是通过首先用亲脂性染料标记造血干细胞和祖细胞或 HSC 来实现的。然后将 HSC 注射到受体小鼠中。
使用定制的头件和标本架为小鼠准备显微镜检查，以实现稳定的动物定位。接下来，获得造血干细胞和祖细胞生态位的高分辨率堆栈，并最终对包含 HS PC 的多个骨髓位置进行延时成像，并使用双光子显微镜显示 HSC 在骨髓空间中的定位和移动。与现有方法（如骨髓切片免疫荧光）相比，该技术的主要优势在于，我们能够在四维尺度、三维加时间上捕获信息。
这项技术的影响延伸到血液疾病的治疗，因为它有助于了解我们需要在骨髓中引导造血干细胞的位置以保证它们的正确功能。当我们意识到首先能够随着时间的推移跟踪 HS PC 是多么重要时，我们第一次有了这种方法的想法。这种方法可以帮助我们回答关于干细胞生态位领域的任何问题，我们想知道干细胞在哪里以及它们随着时间的推移如何表现。
开始收获造血干细胞和祖细胞，如该实验室在之前的 geo 视频中所示，并在文本协议中引用。接下来，将亲脂性染料 DID 添加到终浓度为 5 微摩尔的细胞悬液中。立即涡旋悬浮液，以确保染料不会从溶液中沉淀出来，并且无法标记细胞。
将细胞在 37 摄氏度下孵育 10 分钟以洗涤细胞。首先以 500 倍 G 离心 5 分钟，然后倒出液体。然后将细胞重悬于 200 微升 PBS 中并收集到胰岛素注射器中。
与传统注射器相比，建议使用胰岛素注射器，因为它没有针头死腔。允许将整个细胞悬液施用给小鼠，通过尾静脉注射将细胞注射到致死的 I 辐射小鼠中。首先将鼠标放在温暖的房间里。
一旦尾静脉出现，血管舒张，将鼠标移动到限制器中。小心地将针头滑入尾静脉。将细胞注射到静脉中。
不应遇到对注射的抵抗。将鼠标放置过夜。为了让细胞迁移到骨髓空间，麻醉小鼠并通过花瓣反射监测深度麻醉的开始。
用 70% 乙醇在纸巾上擦拭头皮顶部。小心不要让任何乙醇进入老鼠的眼睛。为了暴露要成像的颅骨区域，用镊子抬起皮肤，同时支撑皮肤，在耳朵之间的后脑勺做一个小切口。
将剪刀滑到皮肤下，然后沿着所需成像区域的外侧轻轻剪开。用蘸有无菌 PBS 的无菌棉签擦拭裸露的骨头，以保持骨头湿润。这避免了可能影响成像质量的过度干燥和疤痕。
接下来，在乳清船中混合适量的牙科水泥，直到它变成糊状。快速将其涂抹在将连接到颅骨的高压灭菌器头件的底面上。在水泥凝固之前，将头件放在鼠标的头骨上，确保不要在成像区域沾上任何牙科水泥并等待其凝固。
涂抹少量水凝胶内，保持颅骨湿润，注意不要在水泥干燥时打扰水泥。然后将头件连接到支架上并将其固定到位。使用螺钉确保凹槽适合支架槽口。
在转移到显微镜之前，用无菌棉签去除水凝胶。接下来，将支架插入显微镜载物台，并将加热垫放在鼠标下方。插入直肠温度计探头，并用胶带将所有东西固定在载物台上。
将一小滴眼药膏涂抹在小鼠的眼睛上，以确保它们在麻醉下不会变干。在麻醉下，在成像过程中，任何时候都不得让鼠标无人看管。通过目镜聚焦在头骨上。
首先，使用水浸透镜用纯净的无菌水填充颅骨成像窗口。降低它，使其接触到水滴。使用显微镜目镜聚焦颅骨顶部。
将成像区域放在中央缝合线上，然后向头部后部移动以找到冠状缝合。作为起始位置，将软件置于捕获 XY 图像的模式以及三个 DZ 堆栈中。将成像速度设置为 400 赫兹，将分辨率设置为 512 x 512 像素。
设置软件以捕捉多个通道，并设置收集方法以更改堆栈之间或帧之间的设置。设置三个独立的拍摄设置。在每个堆栈的采集结束时关闭激光照明。
然后为双光子二次谐波生成骨骼信号设置第一次顺序扫描。打开多光子激光器的快门，确保多光子激光器的增益和偏移设置正确。此外，请确保激光功率为 12.5% 至 25% 并且激光已打开。
选择合适的 PMT 作为唯一的检测器，并将颜色更改为白色。在第二个设置下重复组合自发荧光和 DID 的通道设置程序。使用两个适当的 p mts 进行扫描。
将自发荧光的通道颜色更改为绿色，将 DID 的通道颜色更改为红色。最后，设置 GFP 检测的第三次也是最后一次扫描。将 488 纳米激光线的激光功率设置为 15% 左右选择合适的光电倍增管或 PMT 作为唯一的有源检测器，并将其伪彩色更改为绿色。
激活实时成像模式以开始对所选通道进行预览扫描，并调整探测器增益和偏移以实现最佳曝光。对顺序窗口中的每次扫描重复此作，并保存这些多通道扫描的设置以便于重复使用。然后激活本软件中称为标记和查找的多位置捕获并重置坐标点。
接下来，从中央缝合线和冠状缝线的交点开始扫描骨成像区域。使用自发荧光和 DID 以及复合视图扫描骨髓区域的深度。当检测到单元格时，通过单击标记和窗口左侧的 add new position 图标将其标记为新的坐标位置。
检查完当前视野后，将载物台移动一个视野的距离。对每个视野重复此过程。逐渐围绕整个成像窗口向中央缝合线左侧移动，向鼠标的鼻子移动。
一旦看到中央缝合分叉，移动到缝合线的右侧并重复该过程。以相反的方向扫描左侧。使用 mark and find 工具标记任何感兴趣的新单元格的坐标。
要查看这些点，请为每个位置的每个单元格周围设置 Zs 堆栈的顶部和底部。对于每个点，向上和向下聚焦并设置三个 DZ 堆栈捕获的顶部和底部 Z 位置。更新标记和查找中的单个点，将 Zack 间隔设置为 5 微米，并将每个顺序扫描通道的平均值设置为适当的质量。
通过启动整个扫描过程，为每个关注点获取高质量的参考堆栈。完成高质量扫描后，激活拍摄的延时设置和延时设置。将时间间隔设置为 5 分钟，并将总运行时间设置为所需的长度。
将这些设置应用于整体扫描。此示例显示了如何执行三个以上点的采集：通过修改这些设置，可以减少用于平均的扫描次数，将分辨率限制为 512 x 512 像素，从而减少扫描时间以允许 5 分钟的延时间隔。将扫描转换为双向和/或将扫描速度提高到 600 赫兹或更高，通过单击开始按钮和演示的软件，像以前一样开始成像。
成像完成后，按照文本协议中的详细说明执行小鼠安乐死。定制的高精度鼠标支架，包括颅骨成像窗口，允许对注射到致命照射受体小鼠中的标记 HS PC 进行长时间成像，此处显示的是单细胞分辨率 HSPC 的 2D 切片，包含来自胶原蛋白的骨髓区域厚度约为 90 至 120 微米的信号。骨骼以白色显示，DID 标记的细胞以红色显示。
自身荧光细胞显示为黄色，成骨细胞显示为绿色。此处显示的是已识别的 HS PC 的 40 倍延时电影，红色显示 A DID 标记的 HSC，绿色在成骨细胞附近迁移掌握后。这项技术应该能够在大约一个小时内完成手术和初始成像，然后有足够的时间进行延时成像。
观看此视频后，您应该对能够设置鼠标计算器的成像以及随着时间的推移查看多台 HS PC 充满信心。
概览
本研究提出了一种使用双光子和共聚焦显微镜对骨髓微环境中造血干细胞和祖细胞（HSPCs）进行高分辨率成像的方法。该技术能够跟踪HSPC的相互作用和随时间的移动，提供关于它们的行为和定位的见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 成像技术
背景
- 了解HSPC与骨髓微环境的相互作用对血液学治疗至关重要。
- 现有的方法如免疫荧光缺乏捕捉动态过程的能力。
- 本研究旨在增强对干细胞在其原生环境中行为的理解。
- 高分辨率成像允许进行4D分析（3D加上时间）。
研究目的
- 开发一种实时成像骨髓中HSPC的方法。
- 跟踪HSPC随时间的定位和移动。
- 改善对干细胞微环境及其治疗意义的理解。
使用的方法
- 用脂溶性染料标记HSPC以便可视化。
- 将标记的细胞注射到受体小鼠中以进行跟踪。
- 使用定制硬件对小鼠头骨进行稳定成像。
- 采用双光子和共聚焦显微镜进行高分辨率成像。
主要结果
- 成功对骨髓中的HSPC随时间进行成像。
- 展示了捕捉4D动态相互作用的能力。
- 提供了关于HSPC定位和行为的见解。
- 突出了该方法相对于传统技术的优势。
结论
- 这种成像技术是研究HSPC的重大进步。
- 它提供了对干细胞微环境动态的新见解。
- 该方法对针对血液学疾病的治疗具有潜在意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-resolution 4D imaging of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) in live mouse bone marrow enables direct observation of cell localization, migration, and niche interactions. This capability addresses a critical gap in understanding stem cell dynamics, supporting predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking for hematological disease research. The method enhances translational continuity by linking in vivo cellular behavior to therapeutic hypothesis testing and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of HSPC-niche interactions to clarify biological mechanisms.
- Supports functional target validation by tracking cell fate and movement in real time.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing spatial and temporal cell behaviors.
- Improves predictive confidence for prioritizing targets in hematopoietic research portfolios.
Screening & Assay Development
- Provides validated in vivo imaging systems for downstream compound evaluation.
- Delivers reproducible, quantitative 3D and time-lapse data for assay standardization.
- Enables screening of cell behaviors in response to candidate interventions within native microenvironments.
- Supports platform reuse for tracking various labeled cell populations in bone marrow.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with disease-relevant stem cell dynamics and niche biology.
- Enables longitudinal tracking of therapeutic cell engraftment and migration in vivo.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insights into cell therapy strategies.
- Facilitates biomarker discovery by correlating cell localization with functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging method integrates from early discovery through preclinical validation, bridging hypothesis-driven research and translational studies in hematopoietic biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on stem cell localization, migration, and niche engagement in vivo.
- Screening: Provides quantitative, reproducible imaging outputs for evaluating intervention effects on HSPC behavior.
- Analytics: Enables multi-channel, time-lapse data acquisition for robust statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects in vivo cell tracking to preclinical model validation and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible imaging platform adaptable to diverse cell types and experimental questions in bone marrow research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in stem cell research.
- Operational Value: Standardizes in vivo imaging workflows for reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking early-stage targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cell-based therapies and discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced microscopy and animal handling for in vivo imaging.
- Demands specialized instrumentation, including two-photon/confocal microscopes and custom specimen holders.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis workflows.
- Adaptable to various labeled cell types but dependent on robust labeling and detection strategies.
- Imaging duration and animal preparation may limit throughput for large-scale studies.
