一种新型显微切割方法恢复结核分枝杆菌从福尔马林固定，石蜡包埋肺肉芽肿特异性转录

显微切割已被广泛地用于DNA，RNA，和在组织内蛋白质的检查。激光捕获显微术（LCM）是最常用的方法，而是一种新的研磨技术，mesodissection，是最近可用。我们证明RNA提取从mesodissected福尔马林固定，石蜡的结核分枝杆菌肉芽肿包埋组织幻灯片。

该程序的总体目标是从正式和固定的石蜡包埋载玻片中显微解剖组织。这是通过首先从代表性的 Hematin 和 Eoin 染色玻片创建参考图像来实现的。第二步是将相应的未染色的正式和固定石蜡包埋玻片放在器械载物台上，并将所需的解剖区域与参考图像对齐。

接下来，对解剖区域进行注释，并将消耗性公钻头装入缓冲液并加载到仪器中。最后一步是解剖注释的组织。最终，使用 RNA 提取扩增和 R-T-P-C-R 的组合来展示如何将解剖的组织用于感染的 Reeses 玛卡肺肉芽肿内结核分枝杆菌的整体基因表达分析。

这种方法可以帮助回答结核病研究领域的关键问题，例如结核分枝杆菌在不同感染状态下在类人体内生态位中表达的基因的身份。此外，这些数据将有助于解释这些不同疾病状态中病原体、代谢和生理差异的调节。从而产生特定的药物靶点。

美观解剖仪器配备了集成两个 ID 成像软件的数字显微镜和一个用于控制 XY 载物台位置的纵杆。在开始此过程之前，请按照随附手稿中的说明使用成像软件校准仪器以创建参考图像。首先将血红素和 eoin 染色或 h 和 e 载玻片放在载玻片上，并在载玻片顶部放置一个不透明的盖子。

然后通过将纵杆移动到 h 和 d 滑块的所需区域来驱动仪器。保存使用 capture reference 选项卡生成的图像 对齐要解剖的组织。单击主屏幕上的解剖组织选项。

在设置选项卡中，填写作员解剖登记号、参考登记号 exci 或条形码编号解剖液、批号 exci 大小和描述。单击 find tissue（查找组织）选项卡。导入之前保存的参考图像。

放置未染色的正式和固定石蜡包埋或 FFPE。在载物台上滑动 5 微米厚的厚度。将舞台移动到与参考图像中描述的区域相同的区域。

单击 align 选项卡。使用鼠标和相关箭头将参考图像与未染色的图像对齐。最后，通过单击"注释"选项卡对幻灯片进行注释。

使用鼠标在幻灯片的所需区域周围画一个圆圈，该区域将被进行微切片。通过用所需的缓冲区填充消耗品邮件钻头来开始此过程，在本例中为 PKD Buffer，以流体运动方式上下拉动柱塞数次。确保排除气泡。

按下 Z 轴按钮抬起 Z 轴。将消耗品邮寄钻头装入仪器。将易损件公头滑入机器顶部，使仪器上的白线与易损件公头上的黑线对齐。

按下吸液复位按钮，将柱塞降低到正确的位置。再次按下 Z 轴按钮降低 Z 轴，首先开始组织解剖，打开解剖选项卡。接下来，将电机和吸液速度调到 1。

选中 show tracking 框。这允许用户在解剖过程中可视化解剖区域。按住接合按钮和吸气按钮，同时逆时针方向移动纵杆。

继续逆时针方向解剖，直到吸出物满并且标签变为红色。要先收集解剖的样本，请按 Z 轴按钮抬高轴，然后在消耗性公头尖端下方放置一根 0.5 微升微量离心管，快速按下吸液控制杆，将样品弹出到微量离心管中。组织碎片现在将包含在微量离心管中。

用更大的力按压吸液控制杆，弹出用过的耗材 mal bit。本视频中演示的方案用于显微解剖感染结核分枝杆菌或 MTB 的 Resus Maca 在不同感染阶段的肺肉芽肿。参考图像显示了来自活动性感染的马卡雷斯的 h 和 D 染色肉芽肿，待解剖的感兴趣区域以绿色勾勒。

中间图像显示了解剖前相应的 5 微米厚度的未染色 FFPE 玻片。使用软件对区域进行对齐，相关感兴趣区域以绿色勾勒。右侧的图像描绘了相同的未染色 FFPE 玻片后解剖，解剖区域以蓝色表示。

随后从每种感染状态的中胚层解剖肉芽肿中提取 RNA，下表显示了结果。使用 NanoDrop 获得 RNA 浓度。然后将 RNA 扩增、纯化并逆转录为 CD N-A-R-T-P-C-R，关于 16 s 核糖体亚基的结果证实了 MTB 核糖体亚基 16 s 的存在，因此证实了 MTB 的存在。

在来自 CDC 1551 菌株的显微解剖样品基因组 DNA 中，按照此程序使用 MTB 作为标准。可以进行其他方法，如 D-N-A-R-N-A 和蛋白质提取，以回答有关基因组学、转录组学和蛋白质组学的其他问题。观看此视频后，您应该对如何从肺肉芽肿中显微解剖 FFPE 样本有很好的了解。

该程序不仅限于 MTB 感染的肺肉芽肿，还可以应用于其他病原体的病变。