生物电子显微镜中冷冻断裂/冷冻蚀刻的基本技术要素

以下实验的目的是制备生物或其他材料的碳铂复型标本，用于透射电子显微镜观察。为实现这一目标，将制备成双复型和单复型的标本进行超快速冷冻，以限制冰晶的形成。随后，在液氮温度下通过远程操作于高真空环境中使冷冻标本断裂，从而沿脂质双分子层将膜结构劈开，产生一个细胞外表面和一个靠近胞质侧的表面。

作为可选的附加步骤，可通过将冷却切片机的机械臂置于样品台上方，在样品表面形成温度梯度，使水分从断裂表面升华，从而揭示样品表面下的结构特征。随后，通过在断裂表面蒸发碳和铂，制备表面复型。

原始样品由复制品消化而来，该复制品被转移至透射电子显微镜样品载网上。最终通过冷冻断裂-冷冻蚀刻技术，在透射电子显微镜下观察细胞膜、分子阵列以及纳米材料的三维结构细节。与现有的超薄切片观察等方法相比，该技术的主要优势在于，可在电子显微镜分辨率下以三维形式观察目标结构。

该方法有助于解答细胞与分子生物学及纳米技术领域中的一些关键问题，例如细胞膜的尺寸与结构特征，以及分子和纳米材料阵列的排列方式。当我意识到类似研究已在真核原生生物中开展并取得重要发现，但在人类健康相关主题上却受到较少关注时，我首次提出了该方法的构想。请按照文本方案中的描述，从生物样本的制备开始，进行冷冻断裂-冷冻边缘实验操作。

使用精细镊子和/或小规格注射针头，选择适合待处理样本大小和形状的金或铜质样品台。将样本的小碎片置于金属样品台顶部。对于单个复制品，用滤纸从样品台边缘吸去液体，以减少样本的液体含量，使其达到粘稠、略带胶状的一致性。

使用细规格的注射器针头在载片上形成组织隆起，以制备双面复型。将另一载片倒置，精确地放置在载片上方，并轻轻压在样品表面，形成三明治结构。

切勿将样品从两个样品台之间压出。接下来，用液氮填充两个带绝缘层的双层容器。第一个容器中放置一个带有小孔的金属杆，用于将商用气瓶中的少量丙烷气体冷凝为液体。

第二个容器是用于在液氮中短期保存冷冻样本的分区储存容器。仅可在经认证适用于此类用途的化学通风橱中使用丙烷。使用丙烷时需注意避免外部点火源，穿戴可抵御低温的防护服，并保持充分通风，因为丙烷具有爆炸性。

接触可能导致冻伤，并具有窒息性。将气瓶喷嘴置于丙烷中，充分打开气瓶阀门，使气体流入第一个容器的孔中，气体将尽快液化。用精细镊子夹取样品载物台，迅速浸入第一个容器中的液化气体内数秒钟。

然后迅速转移至第二个盛有液氮的容器中。待样本完全冻结后，置于液氮中保存，直至准备转移至冷冻断裂装置。在液氮环境下，将金制样本载片装入册式双复制样本托或夹紧装置中，并保持在此条件下，直至准备就绪后放入样本室。

当腔室达到高真空且载台已冷却至液氮温度时，关闭泵，倾斜腔室，并尽快将安装好的样品台放置到样品台上。然后重新开启泵以恢复高真空，并使用电子载台和机械臂温控系统将样品台温度调节至负100摄氏度。同时，将液氮导入切片机机械臂，使其达到液氮温度。

达到高真空后，将样品台温度降至零下100摄氏度，并使处于液氮温度的切片臂远程打开双复型样品 holder，从而在样品载台上断裂样品。作为可选的附加步骤，可在断裂后对样品进行蚀刻，以暴露其下层结构。为实现蚀刻，使用固定在切片臂夹具上的剃刀刀片刮削样品表面。将冷却的切片臂置于断裂表面之上，持续一至数分钟，使水分升华，从而暴露出真实的细胞表面、细胞外基质和/或分子组装结构。

接下来，启动铂碳电子枪或电阻枪，以30度至45度的角度在断裂表面蒸发一层薄薄的铂碳。此过程通常需要约15至20秒。以相同方式启动碳电子枪或电阻枪，从正上方90度方向在断裂样品表面蒸发一层薄碳，以增强复型的支撑性。在完成复型、投影和碳加固后，此步骤同样通常需要约15至20秒。

关闭真空泵和腔室，从仪器上取下样品台。使用精细镊子从双面复制簿夹具中取出每个金样品台，在空气中静置数秒使其轻微解冻，然后轻轻将样品台放入凹孔载片的水面上。用细金属丝环或由精细镊子夹持的常规铜制透射电镜载网小心移动复制品，转移至另一个含有5%重铬酸钠和50%硫酸溶液的凹孔载片中，浸泡1小时或更长时间。此步骤可将复制品上的实际生物样品材料消化去除。

消化完成后，将复制品转移回洁净的水面上，并捞取到标准的铜质透射电镜载网上。将支撑复制品的载网存放在 commercially available grid boxes（商用载网盒）中，可长期稳定保存数年。经轻柔操作或用于冷冻断裂蚀刻复制品的超微结构观察时，可在透射电子显微镜下以通常为 50 至 80 千伏的加速电压观察复制品。

使用标准透射电子显微镜胶片或高分辨率数字相机记录相关图像，这些图像显示真核细胞每个纤毛和鞭毛基部细胞膜上存在的结构。纤毛和鞭毛由环绕纤毛轴的膜结合颗粒阵列组成，这些颗粒排列成串，称为纤毛项链（ciliary necklace）。在正在进行纤毛生成（Clio Genesis）的上皮细胞管腔边缘，会出现特化的膜颗粒阵列。

这些颗粒排列代表了新生的纤毛项链结构，位于新生和成熟纤毛的基部。多种上皮细胞的冰冻断裂研究表明，在顶侧基底边界周围存在复杂的分支状条索与沟槽结构。对上皮细胞膜进行断裂时，可观察到紧密连接的质膜断裂面呈现为条索状，而细胞外断裂面则显示出相应的沟槽结构。

在多种组织的冰冻断裂制备样本中可见间隙连接，其表现为质膜断裂面上密集排列的颗粒，以及细胞外断裂面上对应的凹坑。图中所示为快速冷冻、深度蚀刻及旋转喷镀的示例。上皮细胞经细胞质断裂，箭头后方可见质膜断裂面。

通过后续蚀刻揭示的真实细胞表面。一旦掌握，该技术可在约三小时内完成一个循环，若操作得当，可获得一至三个样本。在进行此操作时，需牢记各个步骤之间具有高度的相互依赖性，任何一个步骤中的失误都可能导致最终结果无法满足后续观察与评估的要求。

该技术为细胞与分子生物学领域的研究人员探索基因突变如何导致细胞结构异常，以及这些异常如何引发病理状态和疾病，开辟了道路。