Name: 冷冻断裂/冷冻蚀刻的生物电子显微技术的基本要素 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: 学习冷冻断裂/冷冻蚀刻技术制备生物样品用于透射电子显微镜观察。该方法通过超快速冷冻和真空断裂揭示膜超微结构，适用于神经科学和材料科学研究。

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本演示文稿获得了飞行护士医学研究基金会授予 JLC 的临床创新奖以及美国环境保护局的资助。尽管本文所描述的研究工作已由美国环境保护局通过与北卡罗来纳大学教堂山分校环境医学、哮喘与肺生物学中心签订的协作协议 CR83346301 全额或部分资助，但该研究尚未经过该机构所要求的同行评审和政策审查，因此不一定反映该机构的观点，不应推断其官方认可。提及商品名称或商业产品并不构成对其使用的认可或推荐。

1. 冻裂/冻蚀生物样品的制备
<ol>
	<li>使用常规的电子显微镜固定液配方，例如在 0.1 M 磷酸盐缓冲液中加入 2% 戊二醛和 2% 多聚甲醛，对生物组织进行 1 小时的初次固定。注意：尽管某些类型的样品可能希望在未固定的情况下直接冷冻，但通用的血液传播病原体防护措施要求，当样品为人源组织时，必须进行适当的固定处理。</li>
	<li>初次固定后，将样品置于含有 0.2 M 蔗糖的相同缓冲液中漂洗，时间不超过 1 小时。</li>
	<li>将样品转移至冷冻保护剂溶液中，该溶液由 25% 甘油溶于 0.1 M 磷酸盐缓冲液组成，浸泡时间不超过 1 小时。</li>
</ol>
2. 冷冻断裂前标本的冷冻与储存
<ol>
	<li>选择适当尺寸和形状的金或铜制样品台，用于处理待测样品&#160;（图4）。</li>
	<li>使用精细镊子和/或细规格注射针头，将样品的小碎片置于金属样品台顶部。
	<ol>
		<li>用滤纸从样品台边缘吸去液体，以减少样品中的液体含量，使其达到粘稠、略带胶状的一致性。</li>
		<li>对于单面复型，使用细规格注射针头在样品台上堆起组织小丘；对于双面复型，将另一个样品台倒置，精确地对准并轻压在样品表面，形成夹心结构（图5A）。切勿将样品从两个样品台之间压出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用液氮填充两个绝缘杜瓦瓶。注意：第一个杜瓦瓶内装有带小凹槽的金属杆，用于将市售气瓶中的少量丙烷气体液化（图5B）；第二个杜瓦瓶为分区的储存/暂存容器，用于在液氮中短暂保存冷冻样品。
	<ol>
		<li>将气瓶喷嘴插入丙烷液化凹槽中，打开气瓶阀门，使气体流入第一个杜瓦瓶的凹槽内并液化。注意：警告！！丙烷具有爆炸性，接触可导致冻伤，且为窒息性气体。仅可在经认证适用于此类操作的化学通风柜中使用丙烷，同时须避免意外点火源，穿戴防低温保护服，并保持充分通风。</li>
		<li>尽快用精细镊子夹起样品台，迅速浸入第一个杜瓦瓶中的液化气体中数秒钟，然后立即转移至第二个盛有液氮的暂存杜瓦瓶中（图5B）。</li>
		<li>样品完全冻结后，应保存在液氮中，直至准备转移至冷冻断裂装置。如需长期储存，可将样品台转移至更大的液氮储存杜瓦容器中，但须注意防止样品台解冻。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 冷冻断裂仪器的操作与样品处理
<ol>
	<li>将样品装载到黄铜样品台并放入样品腔
	<ol>
		<li>在液氮条件下，将金质样品载片装入册式双面复型样品台或夹持装置中，并保持在此状态，直至准备将其置于样品腔内（图6）。</li>
		<li>当样品腔达到高真空（约 2 × 10-6 mbar）且样品台已冷却至液氮温度时，关闭真空泵，向腔体通气，并尽快将已安装的样品载片放置到样品台上。</li>
		<li>重新开启真空泵，恢复高真空状态，并通过电子控制调节样品台和刀臂的温度，将样品台温度调整至 -100 °C，同时将液氮导入超薄切片机刀臂，使其达到液氮温度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>断裂过程
	<ol>
		<li>当达到高真空、样品台温度为 -100 ºC 且切片机刀臂处于液氮温度时，远程打开双面复型样品台，从而使样品载片上的样品发生断裂（freeze-fracture_movie1.mov）。</li>
		<li>对于计划在断裂后进行蚀刻处理的样品，使用固定在切片机刀臂夹具上的剃须刀片刮削（即 断裂）样品表面，以替代步骤 3.2.1（freeze-etch_movie2.mov）。</li>
		<li>若需进行额外的冷冻蚀刻步骤，将冷却的切片机刀臂置于断裂表面之上，持续一至数分钟。注：此操作将使断裂表面的水分子升华（即 蚀刻）。该操作的效果是通过水的升华暴露真实的细胞表面、细胞外基质和/或分子组装结构，同时获得穿过膜脂双层的断裂面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>金属投影及使用电子枪蒸发复型支撑层
	<ol>
		<li>启动铂/碳电子束或电阻加热蒸发源，以 30º–45º 角度在断裂表面蒸发一层薄铂/碳膜（约 2 nm 厚度）。此过程通常需要约 15–20 秒。</li>
		<li>如同步骤 3.3.1 一样启动碳电子束或电阻加热蒸发源，从正上方（90º）向断裂样品表面垂直蒸发一层薄碳膜，以增强复型的机械强度。此过程通常也需要约 15–20 秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>复型的回收
	<ol>
		<li>完成金属投影和碳加固后，关闭真空泵，向腔体通气，并从仪器中取出样品台。</li>
		<li>使用精细镊子从双面复型册式夹具中取出每个金质样品载片，在空气中稍作解冻数秒后，轻轻将其放入点板中的水面上（图7）。注：附着有样品材料的碳/铂复型将漂浮至水面。</li>
		<li>使用细金属丝环或由精细镊子夹持的标准铜制透射电镜载网操控复型，并将其转移至另一装有 5% 重铬酸钠溶于 50% 硫酸溶液的点板中，浸泡一至数小时。注：该溶液可消化去除复型上的生物样品材料。家用漂白剂可替代重铬酸钠/硫酸溶液使用。</li>
		<li>消化完成后，将复型转移回洁净的水面上，用标准铜制透射电镜载网捞取。注：复型在消化过程中可能碎裂成小片，但即使非常微小的复型也可能包含重要信息，应予以回收并进行观察。将承载复型的载网存放在市售的载网盒中，在轻柔操作下可长期稳定保存多年。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 冻裂-蚀刻复型的超微结构检查
<ol>
	<li>在透射电子显微镜中以通常为 50 - 80 kV 的加速电压观察复型样品。</li>
	<li>使用标准透射电镜胶片或高分辨率数码相机记录相关图像。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

自引入并实现商业化以来的数年间，冰冻断裂/蚀刻技术被广泛用于生物膜结构的研究。事实上，某些膜结构特化的最佳观察视角正是通过冰冻断裂/蚀刻制样获得的。这些研究不仅增进了人们对膜结构组织的理解，还揭示了结构与功能之间的相互关系。
常规生物电子显微镜技术的出现使人们意识到，用于赋予生物样本差分电子密度的化学处理过程——包括醛类固定剂、活性化学物质以及重金属——本身会导致人工假象的产生。冷冻断裂技术的发展在一定程度上正是为了减少样品制备过程中产生的人工假象。然而，人们也认识到冷冻断裂/蚀刻技术会引入其自身特有的一系列假象，其中最主要的是冰晶损伤。将组织直接浸入液氮时，由于样品周围会形成一层起隔热作用的氮气层，导致冷却速率降低，从而形成冰晶，破坏超微结构细节。这一问题可通过使用甘油等 cryoprotectant（冷冻保护剂）以及先将组织在液氮冷却的丙烷中冷冻来克服。历史上，浸入式冷冻曾使用液氮冷却的氯氟烃类物质，但这些物质因对环境有害而已被逐步淘汰。即使在最佳的冷冻保护条件下，该过程的本质仍不可避免地导致细胞质断裂面呈现粗糙、砾石状的表面；然而，穿过膜结构的断裂面则显示出高度有序的特征，其...

生物样本冷冻断裂处理的概念及其实际应用由Steere在半个多世纪前首次提出1。早期的装置将不同的组件整合成一个可独立运行的单元1。原始装置经过改进和完善，发展为 commercially available instruments（商用仪器），以满足远程操作、维持高真空环境以及碳和金属蒸发等关键需求，从而制备出适用于透射电子显微镜观察的复型样品（图1 和 图2）。
典型的仪器由一个高真空腔室组成，腔室内设有样品台和切片机臂，可调节液氮流量（图1）。腔室还包含两支电子枪，一支用于稳定碳蒸发，位于样品台90º位置；另一支用于铂/碳喷镀，角度可调，通常为15º–45º（图2）。设备通电后可启动真空泵，电子控制面板用于调节温度和控制电子枪。
冷冻断裂技术最初旨在改善病毒的成像效果，但后来更广泛地被用作研究和分析细胞膜及其特化结构的方法2,3。事实上，该技术在阐明细胞和组织的结构与功能关系方面发挥了关键作用，许多相关研究已成为细胞生物学与分子生物学领域的经典贡献4-9。开发冷冻断裂技术的主要目标和理论基础在于，减少传统生物电子显微镜中因化学固定和样品处理过程所导致的、在电镜分辨率下可见的人为假象。该方法的核心是尽量减少化学固定，并以足够快的速度将样品冷冻，通常在冷冻保护剂存在条件下进行，以抑制冰晶形成及其他冷冻过程中产生的人为假象。近年来，随着分子生物学家和材料科学研究人员对纳米颗粒与纳米材料研究兴趣的回升，该技术再次受到广泛关注。
冰冻断裂与冰冻蚀刻图像具有三维特征，有时会被误认为是扫描电子显微照片。然而，冰冻断裂样品是通过透射电子显微镜进行观察的，其在高分辨率形态学研究中的主要贡献在于能够独特地呈现细胞膜的结构与功能单元。冰冻断裂处理首先通过足够快速地冷冻细胞和组织以限制冰晶形成，或使用甘油等冷冻保护剂来实现。随后在真空条件下将样品断裂，并通过在断裂表面蒸发碳和铂来制备复型。原始样品被消化去除后，仅留下复型，并将其转移至标准的透射电镜样品载网上。对冰冻断裂图像的另一种常见误解是认为其显示的是细胞表面。但实际上，冰冻断裂的基本原理在于：断裂过程会沿着脂质双分子层将生物膜劈开（图3）。这一过程在生物膜中产生两个断裂面：其中一个断裂面揭示了靠近胞质侧的膜半层结构，称为PF面（protoplasmic fracture face）；另一个则揭示了靠近细胞外环境的双分子层半层结构，称为EF面（extracellular fracture face）。真正的细胞表面在冰冻断裂图像中并未呈现，只有在断裂后追加冰冻蚀刻步骤时才会出现。为了有效蚀刻先前断裂的样品以揭示表面细节，样品必须快速冷冻，且不能含有无法蚀刻的冷冻保护剂。通过将冷却微刀臂置于样品台上方，使样品所处阶段与冷却微刀臂之间形成温差，从而促使样品表面的水分升华，实现对断裂样品表面下结构的暴露。当在冰冻蚀刻操作过程中，断裂样品表面的水分子发生升华后，实际的细胞表面、细胞外基质、细胞骨架结构以及分子复合物等特征便可在高分辨率下显现。因此，“冰冻断裂”与“冰冻蚀刻”并非可互换的术语，而是代表一个逐步进行的过程，其中后者是否实施取决于具体研究需求，可能并非必要或不被期望。
经过冷冻断裂/冷冻蚀刻处理后，断裂表面会接受定向蒸发的碳和铂镀膜，以提供支撑并增强复制品的成像反差。铂/碳成像蒸发可采用单向或旋转方式，通过电阻丝或电子枪完成。从已知角度（通常为30º–45º）进行单向投影镀膜，有助于进行某些形态计量学计算。经过深度蚀刻处理的样品通常采用旋转投影镀膜，其最终图像在摄影反转后用于评估。
冰冻断裂/冰冻蚀刻技术的既往及当前目标是尽量减少与更常规的透射电子显微镜方法相关的化学固定和样品处理过程中产生的假象。然而，该技术的一个显著优势在于能够提供三维细节信息，从而有助于在生物学、材料科学和纳米技术样品中获取形态计量数据。冰冻断裂和冰冻蚀刻过程复杂且涉及多个环节，其部分应用步骤可根据需要进行定制。本文概述了该技术的主要特征，读者可参考已发表的完整实验方案10,11，以了解具体操作细节并根据特定研究需求对流程进行优化调整。

<table><tbody><tr><td>巴尔泽斯冷冻断裂/冷冻蚀刻设备</td><td>巴尔泽斯</td><td>BAF400T</td><td></td></tr><tr><td>标准缓冲液</td><td>多家供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>标准醛类固定剂</td><td>多家供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>重铬酸钠</td><td>多家供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>多家供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>铂/碳蒸发用一次性耗材</td><td>Technotrade International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td>多家供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙烷</td><td>多家供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电子显微镜用一次性耗材</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>卡尔·蔡司公司</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

生物电子显微镜中冷冻断裂/冷冻蚀刻的基本技术要素

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

冰冻断裂/冰冻蚀刻是一种用于制备样品（通常为生物样品或纳米材料）的技术，其过程包括将样品快速冷冻、断裂并复制，以生成可用于透射电子显微镜观察的碳/铂“复型”。样品通常在冷冻保护剂存在下经历超快速冷冻，以抑制冰晶形成，随后在液氮冷却温度及高真空条件下进行断裂。通过从特定角度蒸发沉积碳和铂，对所得断裂表面进行复制并加以稳定，从而使复型呈现出表面的三维结构细节。该技术在研究细胞膜及其特化结构方面具有重要价值，并显著促进了人们对细胞形态与其功能之间关系的理解。在本报告中，我们综述了实施冰冻断裂所需仪器设备与技术操作流程、相关术语及断裂面的特征、常规操作的多种变体，以及冰冻断裂图像解读的标准。该技术已广泛应用于细胞生物学多个领域的超微结构研究，并在分子科学、纳米技术与材料科学研究中作为一种新兴成像手段展现出广阔前景。

冰冻断裂图像解释的关键前提是，断裂面穿过膜的脂质双层，形成两个断裂面，按惯例称为PF面（质膜断裂面）和EF面（细胞外断裂面）（图3）。PF面是膜脂质双层中靠近细胞胞质的一侧，而EF面是靠近细胞外环境的脂质双层一侧。冰冻断裂技术特别适用于膜结构的研究，这两个断裂面通常明显不同：PF面上分布着大量与膜相关的颗粒，而EF面上的颗粒则较少。冰冻断裂细胞的胞质内容物通常呈现粗糙的外观，不具有明显的结构特征，尽管膜包被的细胞器（如细胞核和高尔基体）仍可被清晰识别。使用该技术的研究人员尤其关注可据其功能进行解释的膜结构特化区域，这些区域包括膜相关颗粒的特定分布、纤毛膜的特化结构以及细胞间连接结构。
纤毛相关结构
位于每个真核生物纤毛和鞭毛基部细胞膜上的是由膜相关颗粒组成的阵列，这些颗粒排列成链状结构，环绕纤毛轴丝，被称为纤毛项链（图8）12-16。该结构在不同物种中表现出一定程度的形态学异质性，据推测具有多种功能，因为它在纤毛形成过程...

本文介绍了用于透射电子显微镜观察的生物样品和纳米材料冷冻断裂处理的基本技术及其优化方法。该技术是揭示生物膜超微结构特征和特化结构的首选方法，同时也可用于材料科学和纳米技术产品中获取超微结构水平的尺寸与空间数据。

冷冻断裂/冷冻蚀刻是一种将样品（通常为生物样品或纳米材料）进行冷冻、断裂和复制的技术过程……

以下实验的目的是制备生物或其他材料的碳铂复型标本，用于透射电子显微镜观察。为实现这一目标，将制备成双复型和单复型的标本进行超快速冷冻，以限制冰晶的形成。随后，在液氮温度下通过远程操作于高真空环境中使冷冻标本断裂，从而沿脂质双分子层将膜结构劈开，产生一个细胞外表面和一个靠近胞质侧的表面。作为可选的附加步骤，可通过将冷却切片机的机械臂置于样品台上方，在样品表面形成温度梯度，使水分从断裂表面升华，从而揭示样品表面下的结构特征。随后，通过在断裂表面蒸发碳和铂，制备表面复型。原始样品由复制品消化而来，该复制品被转移至透射电子显微镜样品载网上。最终通过冷冻断裂-冷冻蚀刻技术，在透射电子显微镜下观察细胞膜、分子阵列以及纳米材料的三维结构细节。与现有的超薄切片观察等方法相比，该技术的主要优势在于，可在电子显微镜分辨率下以三维形式观察目标结构。该方法有助于解答细胞与分子生物学及纳米技术领域中的一些关键问题，例如细胞膜的尺寸与结构特征，以及分子和纳米材料阵列的排列方式。当我意识到类似研究已在真核原生生物中开展并取得重要发现，但在人类健康相关主题上却受到较少关注时，我首次提出了该方法的构想。请按照文本方案中的描述，从生物样本的制备开始，进行冷冻断裂-冷冻边缘实验操作。使用精细镊子和/或小规格注射针头，选择适合待处理样本大小和形状的金或铜质样品台。将样本的小碎片置于金属样品台顶部。对于单个复制品，用滤纸从样品台边缘吸去液体，以减少样本的液体含量，使其达到粘稠、略带胶状的一致性。使用细规格的注射器针头在载片上形成组织隆起，以制备双面复型。将另一载片倒置，精确地放置在载片上方，并轻轻压在样品表面，形成三明治结构。切勿将样品从两个样品台之间压出。接下来，用液氮填充两个带绝缘层的双层容器。第一个容器中放置一个带有小孔的金属杆，用于将商用气瓶中的少量丙烷气体冷凝为液体。第二个容器是用于在液氮中短期保存冷冻样本的分区储存容器。仅可在经认证适用于此类用途的化学通风橱中使用丙烷。使用丙烷时需注意避免外部点火源，穿戴可抵御低温的防护服，并保持充分通风，因为丙烷具有爆炸性。接触可能导致冻伤，并具有窒息性。将气瓶喷嘴置于丙烷中，充分打开气瓶阀门，使气体流入第一个容器的孔中，气体将尽快液化。用精细镊子夹取样品载物台，迅速浸入第一个容器中的液化气体内数秒钟。然后迅速转移至第二个盛有液氮的容器中。待样本完全冻结后，置于液氮中保存，直至准备转移至冷冻断裂装置。在液氮环境下，将金制样本载片装入册式双复制样本托或夹紧装置中，并保持在此条件下，直至准备就绪后放入样本室。当腔室达到高真空且载台已冷却至液氮温度时，关闭泵，倾斜腔室，并尽快将安装好的样品台放置到样品台上。然后重新开启泵以恢复高真空，并使用电子载台和机械臂温控系统将样品台温度调节至负100摄氏度。同时，将液氮导入切片机机械臂，使其达到液氮温度。达到高真空后，将样品台温度降至零下100摄氏度，并使处于液氮温度的切片臂远程打开双复型样品 holder，从而在样品载台上断裂样品。作为可选的附加步骤，可在断裂后对样品进行蚀刻，以暴露其下层结构。为实现蚀刻，使用固定在切片臂夹具上的剃刀刀片刮削样品表面。将冷却的切片臂置于断裂表面之上，持续一至数分钟，使水分升华，从而暴露出真实的细胞表面、细胞外基质和/或分子组装结构。接下来，启动铂碳电子枪或电阻枪，以30度至45度的角度在断裂表面蒸发一层薄薄的铂碳。此过程通常需要约15至20秒。以相同方式启动碳电子枪或电阻枪，从正上方90度方向在断裂样品表面蒸发一层薄碳，以增强复型的支撑性。在完成复型、投影和碳加固后，此步骤同样通常需要约15至20秒。关闭真空泵和腔室，从仪器上取下样品台。使用精细镊子从双面复制簿夹具中取出每个金样品台，在空气中静置数秒使其轻微解冻，然后轻轻将样品台放入凹孔载片的水面上。用细金属丝环或由精细镊子夹持的常规铜制透射电镜载网小心移动复制品，转移至另一个含有5%重铬酸钠和50%硫酸溶液的凹孔载片中，浸泡1小时或更长时间。此步骤可将复制品上的实际生物样品材料消化去除。消化完成后，将复制品转移回洁净的水面上，并捞取到标准的铜质透射电镜载网上。将支撑复制品的载网存放在 commercially available grid boxes（商用载网盒）中，可长期稳定保存数年。经轻柔操作或用于冷冻断裂蚀刻复制品的超微结构观察时，可在透射电子显微镜下以通常为 50 至 80 千伏的加速电压观察复制品。使用标准透射电子显微镜胶片或高分辨率数字相机记录相关图像，这些图像显示真核细胞每个纤毛和鞭毛基部细胞膜上存在的结构。纤毛和鞭毛由环绕纤毛轴的膜结合颗粒阵列组成，这些颗粒排列成串，称为纤毛项链（ciliary necklace）。在正在进行纤毛生成（Clio Genesis）的上皮细胞管腔边缘，会出现特化的膜颗粒阵列。这些颗粒排列代表了新生的纤毛项链结构，位于新生和成熟纤毛的基部。多种上皮细胞的冰冻断裂研究表明，在顶侧基底边界周围存在复杂的分支状条索与沟槽结构。对上皮细胞膜进行断裂时，可观察到紧密连接的质膜断裂面呈现为条索状，而细胞外断裂面则显示出相应的沟槽结构。在多种组织的冰冻断裂制备样本中可见间隙连接，其表现为质膜断裂面上密集排列的颗粒，以及细胞外断裂面上对应的凹坑。图中所示为快速冷冻、深度蚀刻及旋转喷镀的示例。上皮细胞经细胞质断裂，箭头后方可见质膜断裂面。通过后续蚀刻揭示的真实细胞表面。一旦掌握，该技术可在约三小时内完成一个循环，若操作得当，可获得一至三个样本。在进行此操作时，需牢记各个步骤之间具有高度的相互依赖性，任何一个步骤中的失误都可能导致最终结果无法满足后续观察与评估的要求。该技术为细胞与分子生物学领域的研究人员探索基因突变如何导致细胞结构异常，以及这些异常如何引发病理状态和疾病，开辟了道路。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

冷冻断裂/冷冻蚀刻的生物电子显微技术的基本要素

来源：Schönherr, S., 等. 结合光遗传学与冰冻断裂复型免疫标记技术研究小鼠杏仁核中谷氨酸受体的输入特异性分布。 J. Vis. Exp.

小鼠脑组织冰冻断裂标本中神经元膜蛋白的免疫标记

为了保存神经元结构以进行超微结构分析，我们描述了一种将原代神经元接种于透射电镜载网后进行瞬时冷冻的实验方案，从而获得悬浮于玻璃态冰层中的样品。这些样品可用于冷冻电子显微镜观察，以在纳米尺度上可视化细胞结构。...

利用冷冻电子断层扫描技术观察处于冷冻水合状态神经突的原代神经元制备

我们介绍了一种收集和处理完整线粒体冷冻电子断层成像图的方法。该技术可提供关于天然生物膜中大型膜蛋白复合物的结构、功能和组织的详细信息。...

通过电子冷冻断层扫描技术可视化线粒体中的ATP合酶二聚体

冷冻电子显微镜，包括扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM），广泛用于含水量较高的生物样品或其他材料的表征1。利用扫描电镜/聚焦离子束（FIB）可识别样品中感兴趣的结构特征，并切割出一片薄而电子束可穿透的薄片，用于转移至冷冻透射电镜中进行进一步分析。...

利用聚焦离子束制备冷冻电子显微镜样品

获得高质量的透射电子显微镜图像具有挑战性，尤其是在植物细胞中，因其含有大量充满水的液泡和通气空间。串联的高压冷冻与快速冷冻置换技术可显著缩短植物样品透射电镜制样的时间，同时获得超微结构保存极为良好的样品。...

植物组织的串联高压冷冻与快速冷冻置换透射电子显微镜制样技术

本文描述了一种简便且低成本的冷冻固定方法，用于通过透射电子显微镜观察悬浮细胞。...

冷冻蚀刻：用于透射电子显微镜下悬浮细胞超微结构与免疫定位研究的工具

我们开发了一种电子显微镜下的新方法， "闪光与冷冻，"...

闪光-冷冻：一种利用电子显微镜捕捉膜动态的新型技术

本文介绍了一种结合两种样品处理技术的实验方案：高压冷冻与微波辅助样品处理，随后进行极小树脂包埋，以用于聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）获取数据。本方法以小鼠胫神经样品和Caenorhabditis...

高压冷冻、微波辅助对比度增强及最小树脂包埋的生物样本制备用于体积成像

本文展示了如何使用三明治式冷冻装置对生物样本（包括细菌、酵母、培养细胞、分离细胞、动物和人体组织以及病毒）进行快速冷冻，同时还展示了快速冷冻后制备样本以进行超薄切片的方法。...

利用夹心式冷冻装置进行快速冷冻以实现电子显微镜中生物样本良好超微结构保存

本文概述了用于手动冷冻生物样品以进行单颗粒冷冻电子显微镜观察的印迹-投入法。...

生物样品单颗粒冷冻电镜观测的手动印迹- plunge 冷冻制备方法

我们介绍一种分离和冷冻断裂源自癌性尿路上皮细胞的细胞外囊泡（EVs）的实验方案。冷冻断裂技术揭示了EVs的直径和形状，以及作为其独特特征的EV膜内部结构。这些信息对于理解EVs如何与受体细胞膜相互作用具有重要意义。...

用于细胞外囊泡分析的冰冻断裂电子显微镜技术

学习冷冻断裂/冷冻蚀刻技术制备生物样品用于透射电子显微镜观察。该方法通过超快速冷冻和真空断裂揭示膜超微结构，适用于神经科学和材料科学研究。

生物电子显微镜中冷冻断裂/冷冻蚀刻的基本技术要素

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