Name: 三维石墨电极介电泳装置的研制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: 学习利用三维层压石墨烯纸电极微装置进行介电泳实验，通过堆叠石墨烯纳米片纸与压敏胶带制备电极，实现聚苯乙烯微球的高效操控。该方法为生物分析与医学诊断提供了新型微流控技术平台。

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感谢XG Sciences慷慨捐赠石墨烯纸。感谢C. Friedrich博士慷慨提供微型钻孔设备供我们使用。特别感谢Tayloria Adams为视频进行解说。

1. 制备层压电极/绝缘三维结构
<ol>
	<li>对于一个6层石墨烯、5层胶带的器件，使用手术刀或类似的剃刀片配合直边尺，将石墨烯纸切割成六个尺寸为0.7 cm × 1.5 cm的矩形，并使用剪刀将双面压敏胶带裁剪成五条尺寸为1.3 cm × ~5 cm的条状。 
	注：如图1a所示，该设计构成一个包含3个接地电极和3个交流信号电极的器件。7 mm的导电层宽度足以适配载玻片，同时又足够宽以便于后续钻孔操作；2 mm的留边长度在反复使用时不易断裂，并有足够的空间用于连接铜线。器件的深度受限于端铣刀的加工深度。</li>
	<li>将第一层石墨烯纸平铺在洁净的载玻片上。缓慢地用一条胶带覆盖石墨烯纸的一端，保留约2 mm的边缘，以确保相邻两层石墨烯纸之间实现绝缘（图1b）。</li>
	<li>将第二层石墨烯纸放置在胶带之上，并相对于第一层石墨烯纸进行错位排列（图1a）。每次添加导电层后，施加适度压力（用拇指均匀按压，压力约为100 N，作用面积为0.7 cm2），以确保各层之间良好密封。</li>
	<li>对剩余各层重复步骤1.2和1.3，最顶层和最底层仍为石墨烯纸。沿图1b中所示虚线裁切，去除器件边缘多余的胶带，保留约1 mm的小边距，以确保石墨烯纸层之间的绝缘完全密封（图1b）。 
	注：最顶层和最底层不使用双面胶带，以避免在钻孔、安装至载玻片以及样品填充过程中吸附杂质。</li>
	<li>使用万用表（电阻模式）进行快速绝缘测试。将正负探针分别置于器件两侧不同位置（图1c中的A和B）；若测得高电阻（千欧至兆欧级别），则表明各层之间绝缘良好。将多层结构从载玻片上取下，准备进行微孔钻孔。 
	注：若在步骤1.2至1.4过程中相邻石墨烯纸层发生接触，器件通常会无法通过绝缘测试，此类器件应予以废弃。</li>
</ol>
2. 在层压结构中钻制微孔
<ol>
	<li>使用计算机控制的机械微铣削机，并选择直径为 700 µm、切削长度为 2.1 mm 的端铣刀。使用适当的夹具将层压结构固定在微铣削机的工作台上（图 2a 和 b）。将铣削机主轴转速设为 8,600 rpm，然后缓慢将端铣刀向下切入并穿过层压结构的中心。上下移动旋转的端铣刀，以修整微孔内部壁面。
	<ol>
		<li>微孔直径的选择受限于可用端铣刀的直径与切削长度之间的比例关系。应确保微孔内表面尽可能垂直且清洁，以实现最佳的电场梯度和光线在微孔中的透过效果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用加压空气清除微孔中的碎屑。按照步骤 1.5 所述进行另一次绝缘测试。</li>
</ol>
3. 将电极引线连接到层压结构
<ol>
	<li>将两根3 cm长的32 G铜线在2 cm处弯成直角。取约1.5 ml的导电银环氧树脂组分A和B，混合均匀。 
	注意：<img alt="电导率公式，铜和银环氧树脂；方程；用于导电性研究。" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51696/51696eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 1"></li>
	<li>手动将混合好的导电银环氧树脂涂覆在所有三层石墨烯纸的顶部和端部，以确保层压结构A侧各层之间具有良好的接触（图1c），然后将1 cm长的铜线末端插入环氧树脂中并置于任意两层之间。轻轻挤压各层，以去除多余的环氧树脂并确保良好的电接触。对层压结构的B侧重复此操作。</li>
	<li>将整个器件置于烘箱中的支架上，在70 °C、1 atm条件下干燥过夜。</li>
</ol>
4. 准备样品和培养基
<ol>
	<li>使用电导率仪、290 mM 甘露醇储备液以及等渗磷酸盐缓冲液（PBS）的逐级添加，配制一系列不同电导率的等渗培养基。 
	注意：在约 290 mOsm/L 的甘露醇溶液（非导电）中，电导率与约 290 mOsm/L PBS（导电）的体积浓度之间存在线性相关关系。本视频中使用的培养基电导率为 0.01 S/m。</li>
	<li>将聚苯乙烯微球与已配制的电导率培养基或超纯水（~5 x 10-6 S/m）按 1:50 的体积比混合。该方案也可轻松适用于生物细胞。</li>
</ol>
5. 设置实验并操作设备
<ol>
	<li>使用改良的纸夹或等效装置，以适中压力将设备夹紧在玻璃载片上（图2d）。夹具支脚应靠近微孔，以使层压结构与玻璃载片密封，防止样品泄漏。夹具应适配显微镜载物台，压力需优化至：a）避免层压结构变形；b）确保微孔中的液体不泄漏。变形会改变孔的几何形状和光路，降低实验的可重复性。</li>
	<li>使用微量注射器或等效工具，缓慢将约 1 µl 样品注入微孔中，避免引入气泡。如有必要可重复注射，并注意避免尖锐针头损伤微孔壁。略微过量填充微孔后，立即盖上盖玻片以去除多余液体、防止蒸发，并确保每次实验的体积一致。 
	注意：使用金刚石尖头玻璃刀可有效划痕并切割盖玻片至所需尺寸。</li>
	<li>将组装完成的层压微装置固定在显微镜载物台上，并将信号发生器的电极导线连接至装置上的两个铜电极。在 AxioVision（蔡司软件）中，点击按钮以多维采集模式启动相机记录。在CCD相机开始记录后的固定时间点启动信号发生器，以记录施加与不施加电场条件下的响应情况。 
	注意：本实验中施加了频率为 100 Hz 至 10 MHz、峰峰值电压为 15 Vpeak-peak 的信号，在玻璃载片表面以上 1 至 200 倍放大倍数下进行观察，无电场条件下持续 2 秒，施加电场条件下持续约 5 分钟。图像以每秒 1 至 5 帧（fps）的速率进行数字保存，用于后续分析。</li>
	<li>实验完成后，取下装置并拆除夹具。将玻璃载片和装置均浸入肥皂水中，然后充分冲洗。该装置可重复使用约 30 次，且性能保持稳定。</li>
</ol>
6. 数据分析与图像处理
<ol>
	<li>使用首选软件（如 ImageJ）分析图像数据。根据给定时间步长内连续图像中颗粒位移计算其速度。</li>
	<li>基于速度计算实验中的介电泳力（DEP 力）和电场强度，以汇总趋势并与理论进行比较29。</li>
	<li>在与电场梯度形状一致的微孔结构中，沿径向测量颗粒速度。从微孔边缘到中心，确定 8 条同心的等电位线（350、300、…、50、0 µm），形成 7 个区域。 
	注意：使用颗粒通过 50 µm 距离所需的时间来计算速度。当几何形状变化需要时，可对等电位线进行微调。</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文详细描述了一种新型微器件的制备方案，该器件包含6层石墨烯和5层胶带层。此外，通过观察6.08 µm聚苯乙烯微球的介电泳行为，并结合一种独特的、与几何结构相关的颗粒速度分析方法，展示了器件的工作原理。这种构建非线性电动力学器件的通用方法，相较于传统的电极和微流控层微加工技术成本更低，同时可获得同样可靠的结果。
此外，这种新型三维石墨烯纸微装置产生的实验介电泳结果与理论预测的行为以及先前报道的实验结果均相符35. 对于信号频率从100 Hz到10 MHz，以及介质电导率从1 ×&#160;10-4 S/m 到 1.3 S/m，实验验证了交叉频率的存在：在该频率以下观察到 pDEP，而在该频率以上观察到 nDEP。如图所示，在大部分电导率-频率范围内，观察到的是 nDEP。 图4a理论预测，6.08 µm 均匀的聚苯乙烯微球（ερ = 2.55, σρ = 1.3 ×&#160;10-3 S/m 36具有交叉频率当 σ<...

石墨烯是一种新型材料，以其优异的电子特性以及在化学和生物传感器应用方面的潜力而著称1。石墨烯纳米片已被用于催化剂载体2,3、生物传感器4、超级电容器5，以及包含石墨烯/聚苯胺和硅纳米颗粒/石墨烯复合材料的复合电极6-8。本文描述了将石墨烯纸用作一种独特的三维（3D）层状微流控装置中的电极。石墨烯纸电极与绝缘双面胶带层压结合，并在其中钻孔形成腔室，用于进行聚苯乙烯微球的三维交流介电电泳。
介电电泳（DEP）是指可极化粒子在非均匀电场作用下的运动现象。当粒子的极化能力高于或低于周围介质时，分别产生正介电电泳（pDEP）或负介电电泳（nDEP），导致粒子向电场最强或最弱区域移动。这种非线性电动力学工具已被广泛应用于颗粒和生物细胞的分离、分选、捕获与识别9-15。极化粒子所受的介电电泳力取决于电场梯度、粒子半径与形状、粒子的介电特性（包括电导率和介电常数），以及介质的电导率和介电常数。在传统的二维（2D）介电电泳中，粒子运动主要发生在由微加工表面电极之间形成的电场梯度主平面内；在大多数装置中，垂直方向上的运动相较于平面内方向可忽略不计。然而，利用电场梯度的第三维度实现三维（3D）介电电泳，可提高样品通量，并增强设计新型或改进型介电电泳分离方法的灵活性，其中流体流动方向与电场梯度方向相交16,17。其他特定结构设计包括基于三维绝缘体的介电电泳18、三维碳电极介电电泳13,19以及三维电沉积介电电泳10。研究表明，采用三维结构的装置可在连续流动模式下运行，从而实现更高的处理通量。在我们所使用的分层三维装置中，通过在不同焦平面上进行光学显微观察，可研究粒子在三维空间中的运动行为，并分析其随频率和介质电导率变化的响应特性。
Fatoyinbo&#160;et al. 首次报道了在三维层压电极/绝缘结构中使用交替堆叠的30 μm铝箔和150 μm环氧树脂薄膜实现介电电泳（DEP）20。Hubner&#160;et al. 随后设计了类似的三维层压电极，采用35 μm铜带和118 μm聚酰亚胺胶粘剂21。本研究借鉴了三维微井结构设计22,23，并创新性地利用50 μm石墨烯纸作为导电层、100 μm双面胶带作为绝缘层，实现了良好的密封性和充分的电屏蔽。石墨烯纸的多功能性是三维电极微器件的一个显著优势，因为石墨烯纳米片能够同时充当生物传感器，该研究团队此前已对此进行了验证24。
石墨烯纸/聚合物层压三维微装置内的场梯度取决于微孔尺寸、石墨烯纸层数以及施加的电场。关键尺寸包括垂直电极间距（导电层与绝缘层厚度）、微孔直径和高度（由堆叠层数决定）。电信号可通过调节幅值和频率进行优化。当前装置结构适用于批量操作，但也可定制为连续流动装置。本文所述的装置制备技术可通过更换所用的石墨烯纸，灵活适用于开发具有多种石墨烯纳米片特性的三维层压电极。使用石墨烯纸的优势在于其物理和化学性质的多样性、成本较低，且石墨烯纳米片可同时作为生物传感器，用于检测多种生物分析物24。高通量三维介电泳（DEP）系统的长期目标是快速识别细胞类型25-27，或实现无需标记、通过电学手段将病变细胞从健康细胞群体中分离28。本文展示了材料优化、装置制备与操作流程，并随后对典型实验结果进行了图示与分析。

<table><tbody><tr><td>聚苯乙烯微球</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>PP-60-10</td><td>6.08 &amp;mu;m 直径</td></tr><tr><td>石墨烯纸</td><td>XG Sciences, Inc.</td><td>XG 叶片 B-072</td><td></td></tr><tr><td>双面胶带</td><td>3M</td><td>N/A</td><td>136 办公胶带</td></tr><tr><td>银导电环氧树脂</td><td>MG chemicals</td><td>8331-14G</td><td>A 部分 &amp;和 B 包括</td></tr><tr><td>甘露醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>091M0020V</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>OmniPur</td><td>0381C490</td><td></td></tr><tr><td>显微镜（CCD相机）</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>函数/波形发生器</td><td>安捷伦</td><td>33250A</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>Hamilton</td><td>84505</td><td></td></tr><tr><td>纸夹</td><td>ADAMS</td><td>3300-50-3848</td><td></td></tr><tr><td>烘箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>280A</td><td></td></tr><tr><td>万用表</td><td>OMEGA</td><td>HHM25</td><td></td></tr><tr><td>微型铣床</td><td>AEROTECH</td><td>ABL1500 载物台/A3200 Npaq 控制器</td><td></td></tr><tr><td>立铣刀</td><td>ULTRATOOL</td><td>708473</td><td></td></tr><tr><td>AxioVision</td><td>蔡司</td><td>版本 4.8</td><td></td></tr></tbody></table>

三维石墨烯电极介电电泳装置的开发

Development of a 3D Graphene Electrode Dielectrophoretic Device

介绍了一种利用50 µm厚的石墨烯纸和100 µm双面胶带设计与制备新型三维电极微装置的方法。该方案详细描述了构建一种多功能、可重复使用、多层层压介电电泳腔室的步骤。具体而言，将六层50 µm x&#160;0.7 cm x&#160;2 cm的石墨烯纸与五层双面胶带交替堆叠后，夹紧固定于玻璃载片上。随后，使用计算机控制的微钻机在层压结构上钻出直径为700 μm的微孔。通过电阻测试确保相邻石墨烯层之间胶带层的绝缘性能。银导电环氧树脂连接交替的石墨烯纸层，并在石墨烯纸与外部铜导线电极之间形成稳定连接。完成后的装置被夹紧并密封至玻璃载片上。对多层装置内部的电场梯度进行了建模。在深度为1 mm的微孔中，演示了6 μm聚苯乙烯微球在介质电导率范围为0.0001 S/m至1.3 S/m、施加信号频率范围为100 Hz至10 MHz条件下的介电电泳行为。在大部分电导率-频率范围内，观察到三维空间中的负向介电电泳响应，且交叉频率值与先前文献报道的结果一致。该装置未抑制交流电渗和电热流，二者分别出现在低频和高频区域。本装置所用的石墨烯纸具有多功能性，在完成介电电泳表征后，还可进一步用作生物传感器。

在体积为 0.38 mm3 的圆柱形微孔中，对直径 6 µm 的聚苯乙烯微球进行了介电泳实验。结果表明，基于三维层状石墨烯纸的装置能够呈现出与三维金属箔层压装置20,21、传统二维金属电极装置26,27 以及二维绝缘体装置25 相似的介电泳特征。在后续实验中，施加了 15 Vpeak-peak 的交流信号，并将频率从 100 Hz 扫描至 10 MHz30。定性介电泳结果如 图 3 所示，分别为施加电场前（第一列）0 时刻和施加电场 5 分钟后（第二列）的图像。当无电场存在时，颗粒在重力作用下缓慢沉降到装置底部（图 3a 和 b）。图 3c 和 d 显示了在 1 kHz 下典型的正介电泳（pDEP）现象，表现为颗粒向微孔边缘聚集。图 3e 和 f 则展示...

采用一种具有高通量潜力的微装置，结合新型材料演示了三维（3D）介电泳（DEP）。将石墨烯纳米片纸与双面胶带交替堆叠，并在垂直于层方向钻出一个700 μm的微孔。在该微孔中展示了聚苯乙烯微球的介电泳行为。

一种新型三维电极微器件的设计与制备方法，采用50 μm厚的石墨烯纸和100 μm双面胶带制成。该……

本方案展示了制备三维层压石墨烯纸、微电极器件，以及在器件内通过介电泳（DI electrophoresis）或介电电泳（DEP）操控聚苯乙烯微珠或生物细胞的实验方法。此后，我们将把介电电泳简称为 DEP。器件的制备首先通过交替堆叠多层 50 微米厚的石墨纸和 N 减 1 层 100 微米厚的压力敏感聚合物胶带实现，从而形成一半为信号电极、一半为接地电极的结构。将各层压合在一起，修整边缘，然后在结构上钻出微孔。最后，使用银环氧树脂将两根铜导线分别连接到器件的两端。第二步是制备具有所需电导率的介电泳介质。随后将多聚星形微珠以特定的体积比悬浮于该介质溶液中。第三步也是最后一步，是将制备好的微珠悬液加载到装置中，将装置固定在显微镜载物台上，连接函数发生器，最终启动介电电泳（DEP）。最后利用显微镜记录DEP响应，并通过进一步分析研究细胞或颗粒的特性。石墨烯是一种多功能材料，因其强度以及热学和电学特性而被广泛应用。本方案利用一种低成本的石墨烯纸作为三维介电泳微装置中的导电电极层，该装置能够分辨颗粒和细胞，适用于血型鉴定或疾病细胞的医学诊断等应用。这种石墨烯纸电极微装置的优势包括更简便的制备工艺、更高的样品处理效率以及几何结构的灵活性。三维非均匀电场能够利用介电泳力操控大体积样品，这种力可基于颗粒和细胞固有的化学和形态学特性对其进行区分。使用石墨烯纸和胶带组装层压装置。本实验采用商业供应商提供的厚度为75微米的疏水性石墨烯纸和厚度为100微米的压敏双面胶带。首先用手术刀和直尺将石墨烯纸切割成 6.7 厘米 × 1.5 厘米的矩形，再用剪刀将双面压敏胶带剪成五条长约 1.3 厘米、约 5 厘米长的条状。将第一层石墨烯纸平铺在洁净的玻璃载玻片上。缓慢用一条胶带覆盖石墨烯纸的一端，留出约 2 毫米的边缘，以确保任意两层相邻石墨烯纸之间保持绝缘。将第二层石墨烯纸放置在胶带顶部，使其与第一层石墨烯纸错开。施加适度压力，以确保层间良好接触。对剩余的各层重复上述两个步骤，确保最顶层和最底层均为石墨烯纸。使用剪刀剪去器件边缘多余的胶带，保留约一毫米的微小边缘，以确保石墨烯纸层之间的密封绝缘。使用万用表进行快速绝缘测试，将正极和负极探针分别放置在器件两侧的电极引线上。数百千欧姆的高电阻表明各层之间具有良好的绝缘性。现在，该层压结构已准备好进行微孔钻孔。我们使用微型铣床在层压结构上钻出微孔。此处我们使用直径为700微米、刃长接近2.1毫米的微型立铣刀。微型立铣刀的选择依据是微孔的直径和装置的厚度。使用夹具将层压结构固定在微钻孔平台上，通过计算机控制将立铣刀准确定位在结构上方，同时对装置施加加压空气。启动立铣刀旋转，然后缓慢将其下降并穿过层压结构的中心。停止钻孔的深度应略大于层压结构的厚度，以确保彻底清除新孔中的碎屑。通过多次上下移动立铣刀穿过微孔，以修整孔内壁。微孔的内表面应尽可能保持垂直和清洁，以获得最佳的电场梯度并使光线顺利通过。将标准32号铜线剪成两段，每段三厘米长，并在距一端两厘米处折成两个直角。手动混合约0.75毫米的导电银环氧树脂A组分与约0.75毫米的B组分。在一个小型容器中，将导线通过小心地涂抹银环氧树脂至三层石墨烯纸的末端及层间，以确保各层之间具有良好的接触。接着，将一厘米长的导线置于任意两层之间，轻轻挤压各层以去除多余的环氧树脂并确保良好的电接触。对层压结构的另一侧重复此操作。将整个装置置于支架上，放入烘箱中，在70摄氏度和一个大气压下过夜干燥。从烘箱中取出装置，并检测电极引线之间的电气绝缘性。在此，我们通过混合不同比例的预先配制的290毫渗摩尔/升明胶溶液与PBS，制备一系列不同电导率的溶液介质。这些溶液经过简单配制，用于粗略模拟细胞培养缓冲液。这两种溶液的体积比与所得到溶液的电导率之间存在线性关系。通过移液方式，将混合的聚苯乙烯微球或生物细胞与配制好的电导率介质按 1:100 的体积比混合。取 10 微升聚苯乙烯微球和 1 毫升介质溶液加入样品瓶中。通过涡旋充分混匀样品。使用改良的纸质夹子或等效工具，以适中的压力将装置固定在玻璃载玻片上。支架应紧靠微孔，以使层压结构与玻璃载玻片密封，防止任何样品泄漏。应控制夹具的松紧度，避免装置发生形变，从而对微孔几何形状和光路造成不利影响。使用足够宽的金刚石刀尖玻璃切割器，在0.5毫米厚的盖玻片上切割出略大于微孔的裂口，将盖玻片裁切至合适尺寸后备用。使用该微量注射器，缓慢向微孔中注入约1微升的聚苯乙烯微球悬浮液。为避免引入气泡，若出现气泡应重复注射操作，并注意避免锋利的针头损伤微孔壁。略微过量填充微孔后，立即盖上预先准备好的玻璃盖片，以去除多余液体、防止蒸发，并确保体积的可重复性。每次实验时，将完整的层压微装置固定在显微镜载物台上，并连接信号发生器。使用鳄鱼夹将装置与铜导线相连，并通过显微镜软件调节焦距，以清晰观察微孔。屏幕中央显示参数为100赫兹至10兆赫兹，15伏特。将峰值顶点信号施加到设备上。在玻璃载片表面以上1至200微米处，以10倍放大倍率观察微孔中的微珠。点击按钮以开始相机记录与数据采集。在开始相机记录后两秒启动函数发生器信号。图像以每秒一到五帧的速度进行数字化保存，持续约五分钟，用于后续强度分析。实验结束后，移除装置并拆下夹具。用肥皂水清洗载玻片和装置。然后充分冲洗。在无电场的情况下，颗粒仅因重力作用沉降到装置底部。在约一千赫兹的电场下，正向介电泳行为表现为颗粒沿电场梯度向上移动，靠近石墨烯纸。当电场频率高于100千赫兹并进入兆赫兹范围时，可在微孔边缘观察到电极现象。观察到的负向介电电泳（DEP）表现为微珠沿电场梯度向微孔中心移动。该三维石墨烯纸电极微装置所得实验结果与理论预测行为及先前报道的实验结果均高度一致。器件制备具有极高的通用性。所提供的方案可轻松适用于层数更多或使用其他材料的器件。本视频详细展示了批量制备三维介电泳微器件的过程。然而，在未来的应用中，可以通过连续流动粒子或细胞悬浮液穿过该装置的微孔，以实现更高的通量。介电泳（DEP）分选具有多种应用灵活性，其中一个例子是：吸水性石墨烯纸可同时作为粒子或细胞浓缩装置的电极和滤膜，甚至可用作电动力学生物化学传感器。观看本视频后，观众应能够充分理解如何制备多层石墨烯纸、电极微装置，以及如何操作该装置进行粒子或细胞实验。

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三维石墨电极介电泳装置的研制

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