微型涡辅助电穿孔的顺序传递分子
August 7th, 2014
微流体涡辅助电平台的连续交付的多个分子进入相同的细胞群与精确，独立的剂量控制开发。该系统的大小基于靶细胞纯化步骤前电穿孔辅助以增强分子递送效率和处理的细胞活力。
该程序的总体目标是使用涡旋辅助微流体孔以顺序和剂量可控的方式高效地输送各种类型的具有生物学意义的分子，这是通过首先准备四个 50 毫升离心管来实现的，这些离心管分别包含带有细胞和生物分子的 DPBS 溶液，并将每个管连接到其各自的小瓶支架连接到气动流量控制系统。第二步是将每个小瓶的入口管插入嵌入 15 针电极的微流体装置中。接下来，细胞流入设备，在那里它们被困在电穿孔室中形成的微尺度漩涡中。
最后一步是立即对被困的细胞施加短电脉冲，然后将含有要输送到胞质溶胶中的生物分子的溶液注入。最终，从该工艺中获得的细胞可以被释放和收集用于下游分析。与现有方法相比，该技术的主要优点是所提出的技术能够以高效率和活力将受控量的多个分子依次递送到预先选择的相同细胞群中。
这种方法的可视化演示至关重要，因为流体交换步骤很难学习，因为每个溶液的冷流步骤的时间都很重要。切换步骤决定了细胞捕获的稳定性。转移性乳腺癌细胞系 M-D-A-M-B 2 31 将在本实验板中使用每毫升 10 至 5 个细胞，体积为每 T 10 毫升 75 组织培养瓶，在补充有每体积 10% 体积、胎牛血清和 1% 青霉素的 Leibovitz's L 15 培养基中。
链霉素将细胞在 37 摄氏度的加湿培养箱中，0% 二氧化碳环境下孵育。接种后两天，收获细胞进行实验。用 bukos 磷酸盐缓冲盐水或 DPBS 洗涤细胞后，用 0.25% tripsin EDTA 处理细胞 2 分钟。
加入 8 毫升生长培养基，以 200 倍 G 离心 5 分钟，使酶活性沉淀细胞失活，然后重悬培养基至终浓度为 5 倍 10 至每毫升第五个细胞。微流体电穿孔装置的设计和制造不会在本视频中展示，但在随附的手稿中进行了描述。该系统由细胞、分子和冲洗溶液的进样口组成。
两个直线通道，用于惯性聚焦。10 个电穿孔室，带有电极和一个出口，用于流动实验。通过微通道上的孔，将出口、聚醚、醚酮或峰值管以及用于短脉冲、高压应用的 15 针铝电极插入指定位置。
15 针电极由 10 个正极和 5 个负极组成。每个正极与负极相距 1.5 毫米，相同极性的每个电极相距 1.35 毫米。将用于产生高压短方波脉冲的电气设备连接到与流动溶液接触的铝电极。
在 PDMS 模具中，设备应由脉冲发生器和内部构建的高压放大器组成。准备四个 50 毫升离心管，分别含有 DPBS 和带有细胞和分子的溶液。将每根管子连接到连接到气动流量控制系统的相应样品瓶支架上。
将样品瓶支架的入口峰管连接到微流体装置中的相应入口孔中。接下来，设置。方波脉冲的幅度为伏特至 100 伏特。
为了使整个电穿孔室的电场强度相当于每厘米 0.7 千伏。将减压阀设置为 40 PSIA，使用单个手动可调氮气源对所有样品瓶均匀加压，并利用高速歧管及时激活各个溶液端口。使用定制的实验室视图软件进行阀门控制。
打开标有 valve runner 的实验室视图软件，然后从标题为 Operate（作）的下拉菜单中单击运行。单击相应的阀门图标 valve 1 打开 DPBS 储液槽的阀门，以灌注 1.5 min 稳定细胞捕获涡旋产生所需的流速。在细胞捕获步骤之前，当激活液流、洗涤液和细胞溶液同时通过装置 10 秒时，阀图标应从灰色变为绿色。
为确保在溶液切换步骤期间流动不中断，应在每个溶液切换步骤中重复这个简短的 co flow 步骤。将活性溶液端口从洗涤溶液切换到细胞溶液，以将细胞捕获在电穿孔室中 30 秒。在这部电影中，蓝色荧光信号代表可行的钩子。
3、3、3、4、5 期细胞。打开清洗端口并冲洗设备 20 秒。为了去除未被捕获的污染细胞，流动含有第一个目标分子的溶液。
将碘化丙啶放入设备中用于可视化目的。在这个演示中，使用核酸染料代替荧光标记的 DExT 链，因为染料具有卓越的噪声信号比，在注射分子溶液后立即施加五个短脉冲，使用示波器实时监测施加的电脉冲的大小和数量，分子的荧光信号可以在显微镜下可视化， 将细胞在分子溶液中孵育 100 秒。接下来流出，将含有第二个分子的溶液，将核酸染料 yo-yo 一注入装置中。
在本演示中，无需额外的电脉冲应用即可提供第二个分子。这部电影证实了细胞现在表达所有三种荧光信号。绿色代表溜溜球，一，红色代表丙啶、碘化物，蓝色代表钩子。
3、3、3、4、5。通过将作压力降低到 5 PSI 以下，将细胞释放到 96 孔板中进行下游分析。从每次释放中收集大约 100 μL 含有 100 个细胞的溶液。
电穿孔程序必须重复至少 3 次，以收集足够的细胞用于流式细胞术离心机。96 孔板中含有 228 倍 G 的处理过的细胞，反应时间为 5 分钟。在室温下，去除含有过量荧光分子的上清液，并将细胞重悬于 DPBS 中。
如果递送荧光标记的 DExT 链，则随后分析细胞的分子摄取情况。通过流式细胞术提高效率。通过监测 C 2 中电穿孔轨道细胞的荧光强度变化来定性确定成功的分子递送，这证实 90% 的处理细胞摄取 70， 000 道尔顿离子 DExT 链分子。
每个转移的葡聚糖分子的效率定义为成功摄取目标分子的细胞数与处理细胞总数的比率，根据分子量或电荷没有太大变化。所有测试的葡聚糖分子均以大于 70% 的效率输送到胞质溶胶中，此处显示了我们未进行电穿孔处理的细胞的代表性流式细胞术图谱。根据数据设置表示分子成功递送的荧光阈值，以便发现来自对照样品的信号低于阈值。
顺序电穿孔细胞的代表性流式细胞术数据在荧光条纹图像旁边显示流式细胞术图，绿色框表示来自细胞摄取 3000 的信号，仅道尔顿中性葡聚糖，红色框表示来自细胞的信号。摄取 3000 道尔顿，一条离子 DExT 链，只有来自细胞摄取的荧光信号，两个 DExT 链分子都以黄色显示，表示其发育后的双分子递送效率为 56%。这项技术将有助于医学、生物技术和药理学领域的研究人员探索治疗试剂的组合，以在治疗复杂疾病中实现协同效应。
不要忘记，使用高压电脉冲可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如确保您接地。
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概述
一种微流控涡流辅助电穿孔平台能够以精确的剂量控制将多个分子顺序递送到相同的细胞群体中。这种方法提高了分子递送效率，同时保持了细胞活力。
关键研究组成部分
科学领域
- 微流控技术
- 电穿孔
- 细胞生物学
背景
- 电穿孔是一种用于将分子引入细胞的技术。
- 微流控装置允许精确控制流体流动和细胞操作。
- 生物分子的顺序递送可以改善实验结果。
- 在过程中保持细胞活力对下游应用至关重要。
研究目的
- 开发一个用于控制递送多种生物分子的平台。
- 提高分子递送到细胞的效率。
- 确保电穿孔后细胞的高活力。
使用的方法
- 准备含有细胞和生物分子的DPBS溶液。
- 使用气动流控系统进行流体递送。
- 在电穿孔室中形成微尺度涡流。
- 应用短时电脉冲以促进分子摄取。
主要结果
- 成功地将多个生物分子递送到细胞中。
- 处理后的细胞具有高效率和活力。
- 展示了顺序和控制剂量的能力。
- 处理后的细胞可进行下游分析的潜力。
结论
- 开发的平台在分子递送技术上提供了显著的进步。
- 它允许对生物分子递送的剂量和时间进行精确控制。
- 这种方法可应用于需要高细胞活力的各种生物学研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This microfluidic electroporation platform addresses the need for precise, sequential delivery of multiple biomolecules into homogeneous cell populations, a critical capability for combination therapy screening and mechanistic de-risking in early discovery. By enabling real-time visualization and in situ parameter adjustment, the system enhances predictive confidence in molecular uptake efficiency while maintaining high viability, supporting reliable go/no-go decisions in target validation workflows. The technology’s ability to deliver charged and neutral macromolecules with consistent efficiency (>70%) across molecular weights provides a scalable, reproducible foundation for assay development in oncology and pharmacology research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of combinatorial molecular effects on metastatic breast cancer cells through sequential, dosage-controlled delivery of dextran molecules with varying size and charge.
- Operational Value: Isolates uniform cell populations via microscale vortices, reducing variability in electroporation efficiency and enhancing reproducibility across replicates.
- Predictive Value: Real-time fluorescence monitoring allows immediate optimization of pulse parameters, improving delivery efficiency and data quality for downstream functional assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of standardized, electroporated cell samples suitable for flow cytometry-based quantification of molecular uptake, enabling robust assay readouts.
- Operational Value: Integrates pneumatic flow control and valve automation for consistent fluid exchange, supporting high-throughput sequential molecule delivery campaigns.
- Scalability: Platform design allows reuse across multiple experimental runs with minimal variation, supporting enterprise-level assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains high cell viability post-electroporation, ensuring recovered cells are suitable for downstream analysis such as flow cytometry and functional validation.
- Mechanistic De-risking: Enables controlled testing of molecular combinations to assess synergistic or antagonistic effects, reducing uncertainty in lead combination selection.
- Predictive Confidence: Demonstrated >70% delivery efficiency for both 3,000 and 70,000 Da dextran molecules supports reliable extrapolation to therapeutic macromolecules in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The platform fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where sequential biomolecule delivery enables systematic evaluation of combination effects on disease-relevant systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of molecular synergy by enabling precise, sequential delivery of probes to identical cell populations under controlled conditions.
- Screening: Delivers quantitative, fluorescence-based uptake metrics that allow comparison of molecular efficiency across varying physicochemical properties.
- Analytics: Generates measurable outputs (uptake efficiency, fluorescence intensity) suitable for statistical analysis and hit selection in screening campaigns.
- Translational Research: Preserves cell integrity for functional assays, bridging discovery findings to preclinical evaluation of molecular combinations.
- Enterprise Reuse: Designed as a modular fluidic system adaptable to various biomolecules and cell types, supporting repeated use across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in combination studies by enabling controlled, sequential delivery of multiple agents to uniform cell populations.
- Operational Value: Ensures reproducibility through precise flow control, vortex-based trapping, and real-time visualization, minimizing operator-dependent variability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by increasing success rates in molecular delivery experiments, reducing wasted reagents and failed runs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of molecular combinations based on validated delivery efficiency and cellular response data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic system operation, high-voltage pulse generation, and fluorescent microscopy for real-time monitoring.
- Depends on pneumatic flow control systems, pulse generators, high-voltage amplifiers, and oscilloscopes for precise electrical and fluidic control.
- Necessitates standardization of valve timing, pressure settings, and pulse parameters across users to ensure reproducible vortex formation and electroporation efficiency.
- Adaptation to different cell types may require optimization of flow rates, trapping duration, and pulse parameters based on cell size and membrane properties.
- Practical limitations include the need for careful handling of high-voltage components and potential shear stress on sensitive cell types during vortex formation.
