Name: 微型涡辅助电穿孔的顺序传递分子 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-07T20:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 学习利用微型涡辅助电穿孔技术实现多种生物分子向相同细胞群体的顺序可控递送，该方法在保持高细胞活力的同时显著提升分子递送效率，适用于基因治疗和细胞重编程等生物医学研究。

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本工作由罗兰青年研究员项目资助。作者谨向哈佛大学罗兰研究所的科学家和工作人员致以诚挚感谢：Chris Stokes 在定制化计算机辅助压力控制系统搭建过程中提供了帮助，Diane Schaak 博士在生物样本处理方面提供了建议，Winfield Hill 负责了电子系统的开发，Alavaro Sanchez 博士提供了流式细胞仪的使用权限，Scott Bevis、Kenny Spencer 和 Don Rogers 负责加工了压力系统所需的机械管路部件。微流控模具在哈佛大学纳米系统中心（CNS）制备完成。

1. 细胞准备
<ol>
	<li>在每瓶组织培养T75培养瓶中加入10 ml Leibovitz L-15培养基（含10% (v/v) 胎牛血清和1% 青霉素-链霉素），接种转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231，细胞密度为1×105 个细胞/ml。</li>
	<li>将MDA-MB-231细胞置于37 °C、湿度饱和、0% CO2的培养箱中培养。</li>
	<li>接种后第2天进行实验，用0.25%胰蛋白酶-EDTA处理细胞2分钟消化细胞，随后加入8 ml完全培养基以终止胰蛋白酶的酶活性。</li>
	<li>将细胞在200 × g离心5分钟收集细胞沉淀，用Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS，1×，不含Ca2+和Mg2+）重悬，调整细胞浓度至5 × 105 个细胞/ml。</li>
</ol>
2. 装置设计与制备
注意：掩模、主模具制备以及微通道封装过程必须在洁净室中进行，而聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道的浇铸过程可在普通实验台面上完成。
<ol>
	<li>使用 AutoCAD 按照图1所示设计一种微流控装置。该装置应包含一个具有多个注射端口的入口、粗滤器以及两条平行的直矩形惯性聚焦通道（长度 L = 7 mm，宽度 W = 40 μm，高度 H = 70 μm）。每条直通道包含5个电穿孔腔室，腔室之间相距800 μm（WC = 400 μm），每个腔室设有两个用于铝电极的通孔。相邻横向排列的两个电穿孔腔室共用一个负极通孔。两条直通道在电穿孔区域下游汇合为一个出口。</li>
	<li>使用 LinkCAD 将带有微结构图案的 CAD 文件转换为 GDSII 文件。利用激光掩模写入仪在 5” × 5” 的掩模空白片上刻写微结构图案。按照制造商的协议对掩模进行显影。注：掩模显影过程包括光刻胶显影、铬层蚀刻和光刻胶去除。或者，也可从第三方制造商处购买高分辨率透明胶片（&#62;20,000 dpi）上的微结构图案作为掩模使用。掩模上的最终微米级特征应为透明区域，以匹配负性光刻胶的极性要求。</li>
	<li>采用标准软光刻技术23在4英寸硅片上制备该装置设计的铸造模具，将负性光刻胶以2,000 rpm转速旋涂，最终厚度为70 μm。</li>
	<li>将涂有负性光刻胶的硅片在95 °C下预烘20分钟。</li>
	<li>将掩模与硅片贴合，使用掩模对准器在紫外光源下曝光80秒（能量为17.4 mJ/cm2）。</li>
	<li>在 SU-8 显影液中对曝光后的硅片显影4分钟。</li>
	<li>使用表面轮廓仪测量显影后光刻胶的厚度。</li>
	<li>将弹性体与固化剂按10:1的比例充分混合（硅橡胶弹性体试剂盒），然后将混合物浇注到铸造模具上以制备 PDMS 复制品。将浇注的弹性体脱气30分钟，随后将含有脱气后弹性体的模具置于70 °C烘箱中固化2小时。</li>
	<li>将固化后的带有微通道图案的 PDMS 复制品从模具上剥离，并使用手摇钻打孔，用于入口、出口及电极插入。注：手摇钻的标准切削刃直径应为0.76 mm，足以牢固固定 PEEK 管（外径1/32”）和铝电极（外径0.029”）。</li>
	<li>通过氧等离子体清洗仪（射频功率75 W，氧气分压500 mTorr）处理玻璃载片7秒，然后将 PDMS 复制品键合至该玻璃载片上，从而形成封闭的微流控通道。</li>
</ol>
3. 流动实验
<ol>
	<li>将铝电极（0.029英寸外径）和出口聚醚醚酮（PEEK）管（1/32英寸外径）通过微通道中的孔插入指定位置（参见 图3B).</li>
	<li>连接电气设备18 负责向铝电极产生高压短脉冲方波（参见 图3C）与PDMS模具中流动的溶液接触。注意：设备应包括一个脉冲发生器和一个自制的高压放大器。18</li>
	<li>准备四个50 ml离心管，分别装入DPBS、含细胞的溶液和含生物分子的溶液，并将每根离心管连接至相应的瓶架，再与气动流量控制系统相连（参见 图3A).18</li>
	<li>将进样口PEEK管从样品瓶架连接至微流控装置上相应的进样孔。</li>
	<li>将方波脉冲的幅度 V 设为 100 V，以获得电场强度 E = V/Le，电穿孔室间的电场强度相当于 0.7 kV/cm。注：此处，Le 是正负电极与流动溶液接触的两个点之间的距离（参见 图1).</li>
	<li>将压力调节器设置为40 psi。注意：使用一个可手动调节的氮气源，以均匀加压所有样品瓶，并利用高速多通道装置，通过自行开发的LabVIEW软件及时激活各个溶液通道。18</li>
	<li>用于阀门控制，打开标记为定制开发的 LabVIEW 软件 阀杆，然后从名为“operate”的下拉菜单中点击运行。</li>
	<li>单击每个对应的阀门图标以打开阀门。注意：阀门激活时，其图标应变为绿色。单击已激活的图标将使阀门失活并关闭。关闭的阀门图标应变为灰色。</li>
	<li>打开DPBS储液罐的阀门（即，洗涤液）以启动流速，用于稳定细胞捕获涡流的生成，持续1.5分钟。</li>
	<li>将活性溶液通道从洗涤液切换至细胞溶液，使细胞在电穿孔室中滞留30秒（即，细胞捕获步骤）。</li>
	<li>在细胞捕获步骤之前，同时使洗涤液和细胞溶液流经装置10秒，以确保在溶液切换步骤期间流动不受干扰。注意：每次进行溶液切换时，均应重复此短暂的共流步骤。</li>
	<li>打开冲洗口，冲洗装置 20 秒，以去除未被捕获的污染细胞。</li>
	<li>将含有目标第一种分子的溶液（0.2 mg/ml 的 3,000 Da 中性与阴离子葡聚糖分子，或 1.5 mg/ml 的 70,000 Da 中性葡聚糖分子）注入装置中。</li>
	<li>注射分子溶液后立即施加五个短脉冲（Δt = 30 毫秒，间隔 2 秒），并使用示波器实时监测所施加电脉冲的幅度和持续时间。</li>
	<li>重复步骤 3.10，重复次数与需递送的额外分子数量相同。每次分子递送时，将细胞在分子溶液中孵育 100 秒，然后用洗涤溶液冲洗装置 100 秒，以去除多余的分子。</li>
	<li>以低于5 psi的操作压力将细胞释放至96孔板中，用于后续分析。注意：每次释放可收集约100 μl含100个细胞的溶液。</li>
	<li>重复实验步骤3.9至3.16三次，以收集足够用于流式细胞术的细胞。</li>
	<li>将含有处理后细胞的96孔板在228 × g下离心5分钟。</li>
	<li>移除含有过量荧光分子的上清液。</li>
	<li>用DPBS重悬细胞，用于流式细胞术分析。</li>
	<li>将细胞上样至流式细胞仪，用于分析分子摄取效率。</li>
</ol>

<ol><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+Past+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Diff%22%5BJournal%5D)">Electroporation Past present and future.</a> Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).</li>
<li>Geng, T., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+electroporation+for+cellular+analysis+and+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery.</a> Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).</li>
<li>Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+electro-microfluidic+channel+for+single+cell+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Fabrication of electro-microfluidic channel for single cell electroporation.</a> Biomedical Microdevices. 15, 759-766 (2013).</li>
<li>Neumann, E., Toensing, K., Kakorin, S., Budde, P., Frey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+electroporative+dye+uptake+by+mouse+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells.</a> Biophysical Journal. 74, 98-108 (1998).</li>
<li>Jaroszeski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+anticancer+agents+mediated+by+electroporation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Anti-Cancer+Drugs%22%5BJournal%5D)">Toxicity of anticancer agents mediated by electroporation in vitro.</a> Anti-Cancer Drugs. 11, 201-208 (2000).</li>
<li>Buntru, M., Gartner, S., Staib, L., Kreuzaler, F., Schlaich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+multiple+transgenes+to+plant+cells+by+an+improved+version+of+MultiRound+Gateway+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Delivery of multiple transgenes to plant cells by an improved version of MultiRound Gateway technology.</a> Transgenic Res. 22, 153-167 (2013).</li>
<li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4262-4267 (1999).</li>
<li>Heller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intradermal+delivery+of+interleukin-12+plasmid+DNA+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intradermal delivery of interleukin-12 plasmid DNA by in vivo electroporation.</a> DNA Cell Biol. 20, 381-381 (2001).</li>
<li>Boukany, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nat Nanotechnol. 6, 747-754 (2011).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+Effects+of+Nanosecond+Pulsed+Electric+Fields+Combined+with+Low+Concentration+of+Gemcitabine+on+Human+Oral+Squamous+Cell+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Synergistic Effects of Nanosecond Pulsed Electric Fields Combined with Low Concentration of Gemcitabine on Human Oral Squamous Cell Carcinoma.</a> In Vitro PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Kim, M. J., Kim, T., Cho, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+electroporation+chip+using+multiple+electric+field+zones+in+a+single+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Cell electroporation chip using multiple electric field zones in a single channel.</a> Appl Phys Lett. 101, (2012).</li>
<li>Wang, S. N., Lee, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-%2Fnanofluidics+based+cell+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Micro-/nanofluidics based cell electroporation.</a> Biomicrofluidics. 7, (2013).</li>
<li>Sharei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vector-free+microfluidic+platform+for+intracellular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery.</a> Proc. Natl Acad Sci USA. 110, 2082-2087 (2013).</li>
<li>Kim, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+by+OCT4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4.</a> Nature. 461, U649-U693 (2009).</li>
<li>Ozbas-Turan, S., Aral, C., Kabasakal, L., Keyer-Uysal, M., Akbuga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-encapsulation+of+two+plasmids+in+chitosan+microspheres+as+a+non-viral+gene+delivery+vehicle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Co-encapsulation of two plasmids in chitosan microspheres as a non-viral gene delivery vehicle.</a> J Pharm Pharm Sci. 6, 27-32 (2003).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, U311-U313 (2007).</li>
<li>Hur, S. C., Mach, A. J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+size-based+rare+cell+enrichment+using+microscale+vortices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">High-throughput size-based rare cell enrichment using microscale vortices.</a> Biomicrofluidics. 5, (2011).</li>
<li>Yun, H. Y., Hur, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+multi-molecule+delivery+using+vortex-assisted+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Sequential multi-molecule delivery using vortex-assisted electroporation.</a> Lab Chip. 13, 2764-2772 (2013).</li>
<li>Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+theory+and+methods%2C+perspectives+for+drug+delivery%2C+gene+therapy+and+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+Scand%22%5BJournal%5D)">Electroporation theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research.</a> Acta Physiol Scand. 177, 437-447 (2003).</li>
<li>Wang, J., Zhan, Y. H., Ugaz, V. M., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vortex-assisted+DNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Vortex-assisted DNA delivery.</a> Lab Chip. 10, 2057-2061 (2010).</li>
<li>Jia, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonviral+minicircle+vector+for+deriving+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells.</a> Nature Methods. 7, U146-U197 (2010).</li>
<li>Dunbar, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+to+hematopoietic+stem+cells+Implications+for+gene+therapy+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene transfer to hematopoietic stem cells Implications for gene therapy of human disease.</a> Annual Review of Medicine. 47, 11-20 (1996).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem-Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Soft lithography.</a> Angew Chem-Int Edit. 37, 551-575 (1998).</li>
<li>Graziadei, L., Burfeind, P., Barsagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+Unlabeled+Proteins+into+Living+Cells+by+Electroporation+and+Isolation+of+Viable+Protein-Loaded+Cells+Using+Dextran+Fluorescein+Isothiocyanate+as+a+Marker+for+Protein-Uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Introduction of Unlabeled Proteins into Living Cells by Electroporation and Isolation of Viable Protein-Loaded Cells Using Dextran Fluorescein Isothiocyanate as a Marker for Protein-Uptake.</a> Anal Biochem. 194, 198-203 (1991).</li>
<li>Dimitrov, D. S., Sowers, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Electroporation-Fast+Molecular-Exchange+by+Electroosmosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane Electroporation-Fast Molecular-Exchange by Electroosmosis.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1022, 381-392 (1990).</li>
<li>Sukharev, S. I., Klenchin, V. A., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev Yu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+electrophoretic+DNA+transfer+into+cells.+The+effect+of+DNA+interaction+with+electropores%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores.</a> Biophysical Journal. 63, 1320-1327 (1992).</li>
<li>Glogauer, M., McCulloch, C. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+large+molecules+into+viable+fibroblasts+by+electroporation+Optimization+of+loading+and+identification+of+labeled+cellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Introduction of large molecules into viable fibroblasts by electroporation Optimization of loading and identification of labeled cellular compartments.</a> Experimental Cell Research. 200, 227-234 (1992).</li>
<li>Verspohl, E. J., KaiserlingBuddemeier, I., Wienecke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+specific+antibodies+into+electropermeabilized+cells+is+a+valuable+tool+for+eliminating+specific+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+and+Function%22%5BJournal%5D)">Introducing specific antibodies into electropermeabilized cells is a valuable tool for eliminating specific cell functions.</a> Cell Biochemistry and Function. 15, 127-134 (1997).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

通过新的并行化电穿孔平台，在实现多分子递送通量和效率提升10倍的同时，还保留了先前开发的单腔室系统所具备的全部优势。18 此前已有的优势包括：(i) 对目标细胞进行预纯化以获得均匀的尺寸分布，从而提高细胞存活率；(ii) 对分子剂量进行精确且独立的控制；(iii) 操作时所需的电流量较低。选择荧光标记的葡聚糖作为目标分子，是因为它们在分子量、偶联荧光素类型以及电荷性质方面具有广泛的可选范围。这些大分子是此类研究的理想候选，因为它们本身无法穿透活细胞的细胞膜，且不表现出细胞毒性。24 在开展电穿孔实验前，已针对当前系统确定了荧光葡聚糖的最佳浓度、孵育时间以及电学参数。由于该平台具备实时监测分子摄取过程的能力，优化过程变得相对简单高效。若待测分子或细胞类型缺乏已知的电穿孔参数信息，该实时可视化功能将极为有益。所有测试分子的孵育时间均设定为100秒，此时所有10个腔室中被捕获的细胞均能实时检测到可识别的荧光强度信号，表明分子递送已成功完成。需注意，该时间并非实现分子递送所需的最短孵育时长。
关于使用电穿孔进行分子递送的过程，长期以来一直存在争议...

近年来，利用电脉冲促进细胞外分子进入胞质已成为操控哺乳动物细胞的一种有效手段。1 该过程也称为电穿孔，可逆性地使细胞膜通透化，从而使原本无法透过细胞膜的分子得以进入细胞内的环境。由于几乎任何类型的分子均可通过电穿孔在细胞膜上暂时形成的孔道导入各类细胞的细胞质中，因此该技术被报道比病毒介导、化学和光学等其他方法更具可重复性、普适性和高效性。2-3 该技术已被用于引入荧光分子，4 药物5 和核酸6-7 在保持细胞存活和完整的同时，鉴于这些优势，电穿孔已被采用为一种常见的实验室DNA转染技术， 体内 基因治疗8 以及细胞疫苗研究。然而，传统的电穿孔系统在处理尺寸异质性较大的样本时，仍难以同时实现高效的转染效率和细胞存活率，因为成功电穿孔所需的电场强度与细胞直径密切相关。此外，由于依赖于整体性的随机分子递送过程，这些系统无法精确控制多种分子的递送量。9 为了解决这些问题，许多研究团队开发了微流控电穿孔平台，该平台具有穿孔电压较低、转染效率更高、细胞死亡率显著降低以及能够递送多种分子等优势。10-13 这些优势的实现得益于微尺度电穿孔系统的小型化设计，其电极间距为亚毫米级，显著降低了成功递送所需的电压。此外，这些微尺度电穿孔系统能够实现均匀的电场分布，并快速消散产生的热量，从而在提高递送效率的同时降低细胞死亡率。采用透明材料制备这些微芯片还可进一步实现 原位 电穿孔过程的实时观察以及时调整参数。2,12 然而，对于新兴的研究和治疗应用而言，需要精确的剂量控制以及对分子和细胞相关参数的精确调控，6,14-16 仍未解决。
本研究展示了一种微流控涡旋辅助电穿孔系统，能够将多种分子依次递送至预先选定的、具有相同特征的目标细胞群体中。在电穿孔前，利用先前报道的尺寸选择性捕获机制分离出具有均匀尺寸分布的细胞。17-18 由于细胞尺寸分布均一，从而在给定电场强度下实现了更小的电穿孔效率差异和更高的细胞存活率。19 此外，通过微尺度涡旋持续搅动被捕获的细胞，可使分子在整个细胞质中实现均匀递送，这与此前使用另一种涡旋辅助电穿孔平台所报道的结果一致。20 为证明该系统适用于生物学研究中常用的多种分子，本研究将一系列不同分子量的生物大分子递送至转移性乳腺癌细胞中。同时，借助实时过程监测，本工作提供了更多证据，有助于终结长期以来关于电穿孔过程中分子递送机制的争议，即以电泳为主导还是以扩散为主导。14 与其他电穿孔系统不同，该平台独特地集成了多项优势：精确的多分子递送、高分子递送效率、极低的细胞死亡率、可递送分子的广泛尺寸与电荷范围，以及对电穿孔过程的实时可视化。基于上述能力，所开发的电穿孔系统在细胞重编程研究6,14,21-22、药物递送应用10,19 以及需要深入理解电穿孔分子递送机制的应用中，具有实际而广泛的工具性潜力。

<table><tbody><tr><td>MDA-MB-231 癌细胞系</td><td>美国典型培养物保藏中心（ATCC）</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&amp;rsquo;s L-15 培养基</td><td>Cellgro，Mediatech公司</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco，Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Cellgro，Mediatech公司</td><td>21-030</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Gibco，Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometer easyCyte HT</td><td>Millipore</td><td>0500-4008</td><td></td></tr><tr><td>氧气等离子清洗机</td><td>Technics Micro-RIE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dektak 6M 表面轮廓仪</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KMPR 1050</td><td>Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 硅弹性体试剂盒</td><td>道康宁</td><td></td><td></td></tr><tr><td>压缩氮气</td><td>Airgas</td><td>NI 300</td><td></td></tr><tr><td>高压调节器</td><td>McMaster-Carr</td><td>6162K22</td><td></td></tr><tr><td>下游调节因子</td><td>McMaster-Carr</td><td>4000K563</td><td></td></tr><tr><td>高速3/2通8阀阀组</td><td>Festo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>内联单向阀</td><td>Idex Health and Science</td><td>CV3320</td><td></td></tr><tr><td>5/32&quot; OD × 3/32&quot; ID 聚氨酯管</td><td>Pneumadyne</td><td>PU-156F-0</td><td></td></tr><tr><td>1/4&quot; OD X 0.17&quot; ID 聚氨酯管</td><td>Pneumadyne</td><td>PU-250PB-4</td><td></td></tr><tr><td>1/16&quot; PEEK 管路</td><td>Festo</td><td>P1533</td><td></td></tr><tr><td>1/32&quot; PEEK 管路</td><td>Idex Health and Science</td><td>P1569</td><td></td></tr><tr><td>PEEK 管路接头</td><td>Idex Health and Science</td><td>P881</td><td></td></tr><tr><td>脉冲发生器</td><td>HP</td><td>8110A</td><td></td></tr><tr><td>铝线</td><td>Bob Martin Company</td><td>6061 铝合金</td><td></td></tr><tr><td>示波器</td><td>安捷伦</td><td>DSO3062A</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td></td></tr><tr><td>T75 培养瓶</td><td>VWR</td><td>82050-862</td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖，四甲基罗丹明，3,000 分子量，阴离子</td><td>Gibco，Life Technologies</td><td>D3307</td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖，四甲基罗丹明，70,000 分子量，中性&amp;nbsp;</td><td>Gibco，Life Technologies</td><td>D1819</td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖，Texas Red，3,000 MW，中性</td><td>Gibco，Life Technologies</td><td>D3329</td><td></td></tr></tbody></table>

用于顺序分子递送的微尺度涡流辅助电穿孔仪

Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

电穿孔近年来受到越来越多关注，因为它是一种将非通透性外源分子探针物理导入细胞的极为强大的技术。本研究报道了一种微流控电穿孔平台，能够以精确且分子依赖性的参数控制，向哺乳动物细胞递送多种分子。该系统能够分离出大小分布均一的细胞，从而在给定电场强度下减少电穿孔效率的差异，提高样品存活率。此外，其过程可视化功能可实现对荧光分子摄取过程的实时观察，从而允许及时调整分子递送参数。 原位 以提高效率。为了展示所报道平台的广泛能力，选用不同大小和电荷性质的生物大分子（例如， 相对分子质量为 3,000 和 70,000 Da 的葡聚糖被高效递送至转移性乳腺癌细胞&#62;所有测试分子的细胞存活率均超过70%。该平台已证实其在拓展片上电穿孔技术具有应用潜力的研究领域中的使用价值。

开发的并行微流控电穿孔仪可将不同大小和电荷的生物大分子递送至活体转移性乳腺癌细胞中。通过监测经电穿孔处理的悬浮细胞荧光强度的变化，定性评估分子递送的成功与否。 原位 并通过流式细胞术分析的定量测量加以验证。 图 4A 显示90%经处理的细胞摄取了70,000 Da的中性葡聚糖。在统计分析中，为每种荧光染料设定强度阈值，以确保大多数（&gt;99%）的未处理活细胞计数低于阈值（见图4（c效率定义为成功摄取目标分子的细胞数与处理的细胞总数之比。 图 4B 表明效率并不因分子量或电荷的不同而发生显著变化（P &gt;0.1）。所有测试的葡聚糖分子递送至细胞质的效率均超过70%。此外， 图4D 展示了利用相同分子量（MW = 3,000 Da）的阴离子型和中性葡聚糖成功实现了顺序分子递送，双分子递送效率达56%。当前系统在细胞处理通量及多分子递送效率方面均比先前报道的系统高出10倍。18 且该改进不影响单分子递送效率（阴离子和中性葡聚糖分别为82%和70%）。
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开发了一种微流控涡旋辅助电穿孔平台，可对相同细胞群体依次递送多种分子，并实现精确且独立的剂量控制。在电穿孔前进行的基于尺寸的目标细胞纯化步骤，有助于提高分子递送效率和处理后细胞的存活率。

近年来，电穿孔技术受到越来越多的关注，因为它是一种非常强大的物理方法，可用于将非通透性物质导入细胞内……

本实验的总体目标是利用涡流辅助微流控穿孔装置，以高效、可顺序递送且剂量可控的方式，将多种具有生物学意义的分子递送入细胞。该目标的实现首先需要准备四个50毫升离心管，每个离心管中分别含有细胞和生物分子的DPBS溶液，并将每个离心管连接至与气动流控系统相连的相应瓶架上。第二步是将各个离心管的进样管路插入含有15针电极的微流控装置中。随后，细胞被引入装置，并被捕获在电穿孔腔室中形成的微尺度涡流内。最后一步是立即对捕获的细胞施加短暂的电脉冲，随后注入含有待递送生物分子的溶液至细胞质中。最终，可将此过程获得的细胞释放并收集，用于后续分析。该技术相较于现有方法的主要优势在于，能够以高效率和高细胞存活率，将精确控制的多种分子依次递送至预先选定的相同细胞群体中。该方法的可视化演示至关重要，因为液体交换步骤的学习难度较大，其关键在于掌握每种溶液中冷流步骤的时间控制。切换步骤的时机决定了细胞捕获的稳定性。本实验将使用一种转移性乳腺癌细胞系 M-D-A-M-B 2 31，在 T75 组织培养瓶中，以每毫升 1×10⁵ 个细胞的密度接种，总体积为 10 毫升，培养基为添加了 10%（体积比）胎牛血清和 1% 青霉素的 Leibovitz L-15 培养基。链霉素在37摄氏度、0%二氧化碳的湿润培养箱中孵育细胞。接种后两天，收集细胞用于实验。用布科氏磷酸盐缓冲液（Bukos phosphate buffered saline）或DPBS洗涤细胞后，用0.25%胰蛋白酶EDTA处理细胞两分钟。加入8 mL培养基以终止酶活性，通过离心（200 × g，5分钟）沉淀细胞，并将细胞重悬于培养基中，最终浓度为每毫升5 × 10⁵个细胞。本视频中不展示微流控电穿孔装置的设计与制备过程，相关内容详见随附的论文。该系统包含细胞、分子及冲洗溶液的进样口。两条用于惯性聚焦的直通道。10个带有电极和出口的电穿孔腔室，用于建立流动实验。通过微通道中的孔，将出口、聚醚醚酮（PEEK）管以及用于短脉冲高电压施加的15针铝电极插入指定位置。15针电极包含10个正极和5个负极。每个正极与负极之间的间距为1.5毫米，相同极性的电极之间间距为1.35毫米。将产生高压短方波脉冲的电气设备连接至与流动溶液接触的铝电极。在PDMS模具中，设备应包含一个脉冲发生器和一个自制的高压放大器。准备四个50毫升离心管，分别装有DPBS以及含有细胞和分子的溶液。将每个离心管连接至相应的瓶架，瓶架与气动流量控制系统相连。将进样峰管路从样品瓶架连接至微流控装置上相应的进样孔。接着，设置方波脉冲电压为100伏特。为了使电穿孔室中的电场强度达到 0.7 千伏/厘米，将压力调节器设置为 40 PSIA。使用一个手动可调的单一氮气源，对所有样品管进行均匀加压，并通过高速歧管及时激活各个溶液通道。通过定制的 LabVIEW 软件控制阀门。打开标记为“valve runner”的实验室视图软件，从名为“Operate”的下拉菜单中点击“Run”。点击相应的阀门图标“valve one”，打开DPBS储液罐的阀门，以启动流速，用于稳定细胞捕获涡流的生成，持续1.5分钟。在细胞捕获步骤之前，阀门图标应由灰色变为绿色，表示已激活，同时使洗涤液和细胞溶液流经装置，持续10秒。为确保在溶液切换步骤中流动不中断，每次溶液切换时都应重复此短暂的共流步骤。将正在使用的溶液通道从洗涤液切换至细胞溶液，以在电穿孔室中捕获细胞，持续30秒。在本视频中，蓝色荧光信号代表有活力的钩状结构。3、3、3、4、5 期细胞。打开清洗口，冲洗装置 20 秒。为去除未被捕获的污染细胞，流过含有第一个目标分子的溶液。为了可视化目的，将碘化丙啶注入装置中。在本实验中，使用核酸染料代替荧光标记的 DExT 链段，因为染料具有更优的信噪比；在分子溶液注入后立即施加五个短脉冲，并使用示波器实时监测所施加电脉冲的幅度和数量，可在显微镜下观察到分子的荧光信号；将细胞在分子溶液中孵育 100 秒。接下来，将含有第二种分子的溶液，即核酸染料 YoYo-1，流入装置中。在此演示中，第二种分子的递送无需额外施加电脉冲。该视频证实细胞现在表达了全部三种荧光信号：绿色对应于yo-yo、一，红色对应于碘化丙啶，蓝色对应于hooks。3、3、3、4、5。通过将操作压力降至5 PSI以下，将细胞释放至96孔板中，用于后续分析。每次释放可收集约100微升溶液，其中含有约100个细胞。必须至少重复电穿孔步骤三次，以收集足够用于流式细胞术离心的细胞。将含有处理后细胞的96孔板在228 ×g条件下于室温离心五分钟。室温下移除含有过量荧光分子的上清液，并将细胞重悬于DPBS中。若递送了荧光标记的 DExT 链，则随后通过流式细胞术分析细胞对分子的摄取效率。通过监测电穿孔后在 C two 中运行的细胞荧光强度的变化，定性判断分子递送是否成功，结果证实 90% 经处理的细胞摄取了 70,000 道尔顿的阴离子 DExT 链分子。每种转染的葡聚糖分子的效率定义为成功摄取目标分子的细胞数与处理的总细胞数之比，该效率不随分子量或电荷性质发生显著变化。所有测试的葡聚糖分子均以超过70%的效率递送至细胞质中。此处展示的是未经电穿孔处理细胞的代表性流式细胞术图谱。荧光阈值用于指示成功的分子递送，其设定依据对照样本的信号均低于该阈值的数据而确定。此代表性流式细胞术数据显示了依次电穿孔处理的细胞，流式细胞术图位于荧光条带图像旁；绿色方框代表仅摄取3000道尔顿中性葡聚糖的细胞信号，红色方框代表仅摄取3000道尔顿离子化DExT链段的细胞信号；黄色显示的信号来自同时摄取两种DExT链段分子的细胞，表明双分子递送效率为56%。该技术开发后，将有助于医学、生物技术与药理学领域的研究人员探索治疗试剂的联合使用，以在治疗复杂疾病中实现协同效应。请注意，使用高压电脉冲操作可能极为危险，在进行该实验步骤时，应始终采取必要的预防措施，例如确保自身接地。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

微型涡辅助电穿孔的顺序传递分子

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用于顺序分子递送的微尺度涡流辅助电穿孔仪

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