对形态学和神经化学鉴定的海马中间神经元进行全细胞膜片钳记录

本实验的总体目标是表征GABA B受体在已鉴定的海马区表达钙结合蛋白parvalbumin的中间神经元中所介导的作用。首先，通过制备高质量的急性海马脑片来实现这一目标；第二步，利用视频显微镜，根据静脉YFP表达以及已知的parvalbumin阳性神经元的特征来选择神经元。

接下来进行全细胞膜片钳记录，并采用细胞外刺激或配对记录来检测GABA B受体介导的效应。最后一步是观察神经元，并确认所记录的神经元确实为小清蛋白阳性，且属于轴周或树突抑制性神经元。该方法最终能够表征GABA B受体介导的抑制效应，并对所记录的中间神经元进行明确分类。

该方法可解答中间神经元领域的关键问题。例如，中间神经元之间如何相互交流，它们的兴奋性以及突触输出如何受到神经调制系统调控。尽管该方法揭示了GABA能系统对海马中间神经元的调控机制，但也可应用于其他脑区、神经调制系统或其他细胞类型。

取出一只17至24日龄的转基因大鼠的脑组织，该大鼠表达荧光静脉YFP蛋白，脑组织保存在半冷冻的碳合蔗糖人工脑脊液中。使用解剖刀切除大脑皮层前三分之一、小脑，并分离两侧半球。去除皮层的背侧表面，以获得一个平坦的表面，便于将脑组织粘附于切片阶段。将半球粘附于振动切片机（viome）载物台上，同时确保振动切片机浴槽中充满冷冻的碳合天然蔗糖溶液。

使用脑脊液（CSF）切割海马体形成区，获得300微米厚的横切片。将每一片切片转移至含有碳氧混合气体饱和蔗糖脑脊液（sucrose A CSF）的浸没式保存 chamber 中，温度维持在35摄氏度。在最后一片切片放入预热的蔗糖脑脊液（sucrose A CSF）中30分钟后，将切片转移至室温下保存。

用玻璃毛细管拉制膜片钳电极，使其电阻达到 2 至 4 兆欧。填充电极后，将海马脑片转移至记录室，并用缠绕单根丝线的铂金环固定。将记录室置于记录装置中，并以每分钟 5 至 10 毫升的流速灌注经加温的含碳合气的 aCSF 溶液。

使用摄像机在40倍物镜放大倍数下，通过I-R-D-I-C光学系统评估脑片质量。若在光滑且轻微凹陷的表面下方20至30微米深度的parametal层中，可见大量轮廓清晰、中等对比度的圆形ca one parametal细胞，则可认为脑片质量良好。

使用落射荧光照明，将表达静脉黄色荧光蛋白（YFP）、位于或靠近parama层且具有大体积多极胞体的神经元识别为快速放电型中间神经元。接下来，用含有低浓度且符合生理条件的氯离子溶液填充膜片钳电极，以用于检测突触后电流，并将电极置于头部支架的电极夹中。随后通过管路施加轻微正压。

将移液管降至切片表面，略微偏离所选神经元的中心位置。将压力增加至70至80毫巴，迅速将移液管穿过切片，直至到达所选细胞胞体的正上方。将移液管轻压至细胞膜上，使其表面形成凹陷。

迅速执行此步骤。为防止邻近细胞被生物素标记，通过释放压力并同时向玻璃微电极施加负20毫伏的电压指令来形成吉欧姆密封。一旦开始封接，将电压指令降低至预期的静息膜电位，通常为负70至负60毫伏之间。

现在施加一个短暂的负压脉冲以破裂膜片，从而实现全细胞记录构型。使用电流钳模式，通过观察神经元对一系列从超极化到去极化电流脉冲的反应，识别快速放电的中间神经元。为观察突触诱发反应，将细胞外刺激电极置于脑片上辐射层与分子层交界处进行记录。

在电压钳制模式下，使用隔离的恒压刺激器，每隔 20 秒向突触前轴突施加单次或 200 赫兹的五次 50 伏电刺激脉冲串。接着，向灌流液中加入离子型谷氨酸受体拮抗剂，以分离出单突触抑制性突触后电流（IPSC）。

通过施加GABA a受体拮抗剂，进一步分离由GABA B受体介导的抑制性突触后电流。开始进行成对记录时，首先像之前一样建立突触前中间神经元的全细胞记录，并确认其快速放电表型。

接下来，在距离中间神经元（该中间神经元与突触前中间神经元相连）20至100微米范围内，对CA区的一个参数膜细胞进行膜片钳记录。在电流钳模式下，施加短暂的SRA阈值去极化电流脉冲，以诱发该中间神经元的动作电位。

如果存在突触连接，则中间神经元中的动作电位会导致电压钳制的腹外侧一个旁细胞中出现突触后电流。一旦建立连接，使用典型的双脉冲方案，通过两个间隔为50毫秒的去极化刺激，在突触前快速放电中间神经元中诱发出成对的动作电位。在采集完对照轨迹后，将选择性GABA B受体激动剂巴氯芬加入灌流的人工脑脊液（ACSF）中，从而激活GABA B受体。

接下来，施加拮抗剂CGP 55 845以完全阻断受体介导的效应。记录完成后，在电压钳制模式下缓慢将移液管从细胞胞体中撤出。当测得的串联电阻增加时，将膜电压降低至负40毫伏，以形成外向外膜片，从而封闭胞体膜。

记录完成后，将脑片浸入含0.1摩尔磷酸缓冲液的4%多聚甲醛中，于4摄氏度固定过夜，随后用磷酸缓冲液洗涤，再用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，然后在室温下用含10%正常山羊血清、0.03%TRITON X-100和0.05%叠氮化钠的溶液封闭一小时。为标记小清蛋白（parvalbumin）表达，使用抗小清蛋白单克隆小鼠抗体，将其稀释于含5%正常山羊血清、0.3%TRITON X-100和0.05%叠氮化钠的PBS溶液中，将脑片与一抗在4摄氏度孵育2至3天。孵育结束后，用PBS充分冲洗脑片，加入荧光标记的抗小鼠二抗以及与荧光染料偶联的生物素结合蛋白（streptavidin），在含3%正常山羊血清、0.1%TRITON X-100和0.05%叠氮化钠的PBS溶液中于4摄氏度孵育过夜。次日，用PBS彻底冲洗脑片2至3次，再用磷酸缓冲液冲洗2至3次。

将切片置于载玻片上，并使用300微米的琼脂垫片防止切片塌陷。然后用荧光封片介质加盖盖玻片，并用指甲油封固。使用高倍镜和高数值孔径物镜评估中间神经元的血清白蛋白免疫反应性。

认为颗粒蛋白阳性的目标神经元细胞具有免疫反应性。若免疫标记显示与生物素标记的结构一致，则使用激光扫描共聚焦显微镜沿Z轴连续成像，对荧光腺体进行形态学鉴定及三维重建。随后将图像重建为神经元的三维结构，包含树突和轴突的分支形态。

此处展示了一个快速放电中间神经元在单次细胞外刺激下产生的突触复合反应。应用离子型谷氨酸受体拮抗剂 DNQX 和 APV 可分离出单突触抑制性突触后电流（IPSC）；而应用 GABAA 受体拮抗剂 Gazin 则消除了 IPSC 的快速成分。

五次刺激诱发的反应显示出由GABA B受体介导的缓慢抑制性突触后电流（IPSC），该电流在随后施加CGP后被阻断。这些记录 trace 显示了在对照条件下、浴施加巴氯芬（baclofen）后以及随后施加CGP后，突触前快速放电中间神经元的动作电位及CA1区颗粒膜细胞的短潜伏期单突触抑制性突触后电流（IPSC）。注意，巴氯芬使IPSC的振幅降低了约50%，而GABA B受体拮抗剂CGP则使IPSC振幅几乎完全恢复。

IPSC 振幅的时间进程图显示了巴氯芬和 CGPA 的作用。如 20 倍放大图像所示，该快速放电中间神经元的胞体位于 CA1 区辐射层与近分子层交界处，其树突垂直走行并贯穿所有层次。虽然大部分轴突位于细胞体层及其周围，符合篮状细胞的典型特征，但 60 倍放大图像显示了轴突围绕假定的 CA1 区近分子层篮状结构形成的典型形态，该位置由橙色星号标记。此处还展示了同一中间神经元的三维重建图像，其中胞体和树突以黑色表示，轴突以红色表示。

CA1 区的各层以蓝色标出。掌握该技术后，可在一天内完成实验，并可同时对多个切片进行形态学分析。该联合方法为研究海马和皮层微环路的研究人员探索中间神经元类型的形态学、生理学多样性及其结构与功能之间的相互关系开辟了道路。