从Morphologically-和确定的Neurochemically海马的interneurons全细胞膜片钳记录
September 30th, 2014
皮层网络由一个小的，但不同组抑制性控制。因此的interneurons功能调查需要有针对性的记录和严格的鉴定。这里描述的是一种涉及从单个或突触耦合对神经元细胞内的标记，事后的形态学和免疫细胞化学分析的全细胞记录相结合的方法。
该程序的总体目标是表征已确定的海马细小白蛋白阳性神经元中 GABA B 受体介导的作用。这是通过首先生产高质量的急性海马切片来实现的。第二步是使用视频显微镜根据静脉 YFP 表达和平行白蛋白阳性神经元的已知特征选择神经元。
接下来获得全细胞膜片钳记录，并使用细胞外刺激或配对记录来检查 GABA B 受体介导的作用。最后一步是可视化神经元并确认记录的神经元实际上是 par 白蛋白阳性，并且是旁体细胞或树突状抑制神经元。最终，这种方法能够表征 GABA B 受体介导的抑制作用，并允许对记录的神经元间进行明确分类。
这种方法可以回答神经元间场中的关键问题。例如，神经元间如何相互交流，它们的兴奋性，它们的突触输出如何由神经调节系统控制。虽然这种方法提供了对 GABA 能的见解，即海马体对神经元的控制，但它也可以应用于其他大脑区域、神经调节系统或细胞类型。
从表达荧光静脉 YFP 的 17 至 24 日龄转基因大鼠中取出大脑，保存在半冷冻碳素蔗糖中，使用手术刀进行 CSF，去除皮层的额叶三分之一，小脑，并分离半球。去除皮层的背表面，提供一个平坦的表面来粘合大脑以进行切片。将半球粘在 viome 载物台上，用装满 rozen carbogen 天然蔗糖的 viome 浴
。CSF 切割海马形成的 300 微米横向切片。将每个切片转移到含有 35 摄氏度的碳基蔗糖、A CSF 的浸没式保温室中。30 分钟将最后一片放入温热的蔗糖中后，A CSF 将切片转移到室温下储存。
从玻璃毛细管中拉出贴片移液器，以实现 2 至 4 兆欧姆的移液器电阻。填充后，将海马切片转移到记录室中，用用单根丝纤维串起来的铂环将其固定到位。将腔室放入记录装置中，并以每分钟 5 至 10 毫升的流速开始用碳素加热记录 A CSF 进行灌注。
使用摄像机在 40 倍物镜放大倍率下评估 I-R-D-I-C 光学元件下的切片质量。假设切片质量良好。如果地层参数中可以看到大量圆形、中等对比度的 ca one 准金属细胞，则可以在光滑且轻微缩孔的表面下方 20 至 30 微米的深度看到。
使用 epi 荧光照明，将推定的快速尖峰间神经元识别为那些在蝶群层内或附近表达具有大型多极体细胞的静脉 YFP 的神经元。接下来，用含有低且生理相关氯化物浓度的溶液填充贴片移液器，以识别突触后电流，并将其放入头部的移液器支架中。然后通过管路施加较低的正压。
将移液器降低到切片表面，略微偏移到所选神经元的中心。将压力增加到 70 至 80 毫巴，并迅速将移液管通过切片降低到所选细胞的胞体上方。将移液管压在细胞膜上，使其上产生一个酒窝。
快速执行此步骤。为了防止相邻细胞的生物素标记，通过释放压力并同时对移液器施加 20 毫伏负电压命令来形成千兆欧姆密封。密封开始后，将电压命令降低到预期的静息膜电位，通常介于负 70 和负 60 毫伏之间。
现在施加一个短的负压脉冲来破坏膜贴，从而实现整个细胞的构型。使用电流钳模式，通过它们对一系列超极化到去极化电流脉冲的响应来识别快速尖峰神经元。为了观察突触诱发的反应，将细胞外刺激电极放置在镭层和层分子记录边界的切片中。
在电压钳模式下，使用隔离的恒压刺激器每 20 秒向突触前轴突输送 5 个 50 伏电刺激的单个或 200 赫兹序列。接下来，将离子型谷氨酸受体拮抗剂应用于浴中，以显示分离的单体。突触 IPSC。
应用 GABA a 受体拮抗剂进一步分离 GABA B 受体介导的 IPSC。开始配对录制。首先，像以前一样建立突触前神经元间的全细胞记录，并确认快速尖峰表型。
接下来，在持有突触前神经元的神经元间 20 至 100 微米的距离内修补 CA 1 寄生金属细胞。在电流钳制模式下。应用简短的 SRA 阈值去极化电流脉冲以在神经元间引发动作电位。
如果存在突触连接，神经元间的动作电位会导致 IPC 位于电压钳制的 ca 一个寄生合金单元中。一旦建立连接，在突触前快速尖峰神经元间引发动作电位对，具有两个间隔为 50 毫秒的去极化刺激的典型配对脉冲协议。收集对照痕迹后，将选择性 GABA B 受体激动剂巴氯芬应用于灌注的 A CSF，从而激活 GABA B 受体。
接下来，应用拮抗剂 CGP 55 8 45 以完全阻断受体介导的作用。记录完成后，在电压夹中慢慢将移液器从电池体中取出。随着串联测量电阻的增加，将膜电压降低到负 40 毫伏，通过形成一个由外而外的贴片来密封体细胞膜。
记录后，通过在 4 摄氏度洗涤磷酸盐缓冲液下浸入 4% 对甲醛和 0.1 摩尔磷酸盐缓冲液中过夜来固定切片，然后在磷酸盐缓冲盐水中封闭，用 10% 正常山羊血清 0.03%TRITTON X 100 和 0.05% 叠氮化钠在室温下封闭 1 小时，以标记 par 白蛋白表达， 使用在含有 5% 正常山羊血清、0.3%TRITTON X 100 和 0.05%叠氮化钠的 PBS 溶液中稀释的抗小清白蛋白单克隆小鼠抗体，在 4 摄氏度下孵育一抗 2 至 3 天。孵育后，在 PBS 中彻底冲洗切片，应用荧光抗美国二抗以及与荧光染料偶联的生物素结合蛋白剥离蛋白，并在含有 3% 正常山羊血清、0.1%tritton X 100 和 0.05% 钠的溶液中孵育在 PBS 中稀释，在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天，用 PBS 充分冲洗切片 2 到 3 次，然后在磷酸盐缓冲液中冲洗 2 到 3 次。
将切片安装在载玻片上，并使用 300 微米琼脂垫片防止切片塌陷。然后用荧光封固剂盖住切片，并用指甲油密封。用高放大倍率和数值孔径评估神经元间的 par 白蛋白免疫反应性。
物镜晶状体细胞被认为对 par 白蛋白具有免疫反应性。如果看到免疫标记与生物素标记的结构对齐，则使用激光扫描共聚焦显微镜拍摄 Z 轴系列图像，对荧光 Aden 进行成像以进行形态学鉴定和三维重建。然后将图像重建为三维神经元，结合树突和轴突树枝化。
此处显示了快速尖峰神经元间神经元响应单个细胞外刺激的复合突触反应。离子型谷氨酸受体拮抗剂、DNQX 和 A PV 分离株的应用、单体突触抑制突触后电流或 gabaa 受体拮抗剂的 IPSC 应用。Gazin 废除了 IPSC 的快速部分。
一系列 5 个刺激揭示了一个缓慢的 GABA B 受体介导的 IPSC，该 IPSC 被随后的 CGP 应用阻断。这些痕迹显示了在沐浴、巴氯芬应用和随后的 CGP 应用后的对照条件下，CA one 副金属细胞中突触前、快速尖峰神经元间和短潜伏期单一 I PSC 中的动作电位。请注意，巴氯芬使 IPSC 振幅降低约 50%，而 GABA B 受体拮抗剂导致 IPSC 振幅几乎完全恢复。
IPSC 振幅的时程图显示了巴氯芬和 CGPA 快速尖峰的影响，在 20 倍放大倍率下显示的神经元间有一个体细胞，位于镭层的边界，一个区域的 parama doll，树突垂直运行并跨越所有层。虽然大部分轴突存在于细胞体层内和周围，这与篮状细胞一样，但 60 倍放大图像显示了典型的轴突篮子围绕推定的 ca one parametal salata 形成，这些轴突以橙色星号标记。此处显示了同一神经元间的三维重建，其中胞体和树突为黑色，轴突为红色。
ca one 的图层以蓝色划定：一旦掌握。该技术可以在一天内完成，开发后一次对多个切片进行博士后形态学分析。这种组合方法为海马和皮质微回路的研究人员探索神经元间类型的形态生理多样性以及结构功能相互关系铺平了道路。
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概述
本研究聚焦于在已识别的海马小钙蛋白阳性间质神经元中表征GABA B受体介导的效应。该方法涉及高质量的急性海马切片、靶向神经元选择以及全细胞膜片钳记录，以检查抑制效应。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 电生理学
- 细胞生物学
背景
- 抑制性间质神经元在皮层网络中扮演着至关重要的角色。
- 小钙蛋白阳性间质神经元对理解抑制控制非常重要。
- GABA B受体在介导抑制性神经传递中具有重要意义。
- 靶向记录和识别间质神经元对功能研究至关重要。
研究目的
- 表征海马间质神经元中GABA B受体介导的效应。
- 确认记录的神经元的身份为小钙蛋白阳性。
- 区分不同类型的抑制性神经元。
使用的方法
- 急性海马切片的制备。
- 基于YFP表达使用视频显微镜选择神经元。
- 从选择的神经元进行全细胞膜片钳记录。
- 事后形态学和免疫细胞化学分析以确认神经元身份。
主要结果
- 成功表征了GABA B受体介导的效应。
- 将小钙蛋白阳性间质神经元识别为细胞体周围或树突型。
- 证明了该方法在研究抑制性电路中的有效性。
- 根据形态标准明确分类了记录的间质神经元。
结论
- 综合方法允许对间质神经元功能进行精确的研究。
- 理解GABA B受体效应增强了对抑制机制的认识。
- 该方法可以应用于其他类型的间质神经元，以获得更广泛的见解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Characterizing GABA B receptor-mediated inhibition in defined interneuron populations supports target validation in CNS drug discovery by linking molecular mechanisms to circuit-level function. This approach enables mechanistic de-risking of GABAergic modulators through direct measurement of synaptic effects in genetically identified cell types. The method enhances predictive confidence in lead identification by providing quantitative, reproducible electrophysiological readouts from disease-relevant neuronal systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of GABA B receptor function in parvalbumin-positive interneurons to validate target engagement and pathway modulation.
- Operational Value: Provides a standardized workflow for isolating and recording from genetically defined interneuron subtypes using fluorescent markers.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by confirming neuron identity through post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.
- Operational Value: Facilitates paired recording configurations to assess synaptic connectivity and inhibitory transmission in hippocampal circuits.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative measurements of GABA B receptor-mediated IPSCs to enable dose-response analysis of agonists and antagonists.
- Operational Value: Establishes a reproducible assay platform with defined stimulation protocols and pharmacological isolation steps for compound screening.
- Scientific Value: Allows isolation of monosynaptic IPSCs through ionotropic glutamate receptor blockade to assess direct interneuron-to-neuron signaling.
- Operational Value: Supports scalability through acute slice preparation and standardized perfusion conditions for multi-day electrophysiological studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links hippocampal interneuron function to disease-relevant circuit dynamics in models of epilepsy, anxiety, and cognitive disorders.
- Operational Value: Enables longitudinal assessment of GABAergic modulation across developmental stages using transgenic rodent models.
- Scientific Value: Supports biomarker alignment by correlating electrophysiological phenotypes with morphological and neurochemical identification.
- Operational Value: Provides a platform for evaluating target selectivity and off-target effects of GABAergic compounds in native tissue.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization by providing mechanistic insights into GABAergic modulation in defined neuronal populations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of GABA B receptor role in inhibitory control of hippocampal interneuron excitability and synaptic output.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized whole-cell patch clamp recordings with quantifiable IPSC amplitudes and kinetics.
- Analytics: Enables comparative analysis of synaptic responses under control, agonist, and antagonist conditions to assess compound efficacy and potency.
- Translational Research: Connects electrophysiological findings to morphological validation for enhanced target-to-pipeline continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiological platform adaptable to other interneuron types and brain regions via promoter-driven fluorescent labeling.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking GABA B receptor modulation to measurable inhibitory effects in identified interneurons.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized slice preparation, fluorescent neuron targeting, and post-hoc confirmation protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct evidence of target engagement in native neuronal circuits.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of GABAergic modulators based on functional validation in disease-relevant interneuron populations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, fluorescent microscopy, and histological processing for neuron identification.
- Dependent on transgenic animal models expressing fluorescent markers under interneuron-specific promoters.
- Necessitates vibration-dampened recording chambers and perfusion systems for stable whole-cell recordings.
- Involves optimization of pipette resistance and sealing parameters for reliable gigaohm formation in acute slices.
- Limited by slice viability duration, requiring timely experimentation post-dissection for optimal recording quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
1:46
Preparation of Acute-hippocampal Slices
0:05
Title
3:00
Whole Cell Patch-clamp Recording from Fast-spiking Interneurons
5:58
Extracellular Electrical Stimulation to Evoke GABAB Receptor-mediated Responses
6:56
Paired Recordings of Synaptically Coupled Fast-spiking INs and CA1 PCs
8:42
Visualization and Immunocytochemistry of Fast-spiking Interneurons
11:30
Results: GABAB Receptor-mediated Currents and Presynapitc Inhibition in Identified Hippocampal Parvalbumin Interneurons
13:59
Conclusion
