Name: 对缝隙连接检查功能测定;贴壁细胞的氧化铟锡电 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 学习利用氧化铟锡电穿孔技术检测贴壁细胞缝隙连接功能的方法。该技术通过向活细胞施加电流打开瞬时孔道，使荧光染料进入细胞，从而分析细胞间通讯机制及其在细胞生物学研究中的应用价值。

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感谢 Lowell Cochran 在专业摄像方面的协助。谨此感谢加拿大卫生研究院（CIHR）、加拿大乳腺癌基金会（CBCF，安大略省分会）、加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）、加拿大乳腺癌研究联盟、安大略省卓越中心、金斯顿乳腺癌行动组织以及通过赠款支持 LR 的 Clare Nelson 遗产基金所提供的资金支持。SG 获得了 NSERC 研究生奖学金。MG 得到了美国陆军乳腺癌研究项目、安大略省政府研究与创新部以及女王大学咨询研究委员会资助的博士后奖学金的支持。

1. 将细胞接种至电穿孔室中
<ol>
	<li>在超净工作台中，按照常规无菌操作技术对细胞进行胰蛋白酶消化。 
	注意：必须通过离心彻底去除胰蛋白酶的所有残留，因为其可能阻碍细胞在玻璃表面的铺展，从而影响黏附连接和间隙连接的形成。</li>
	<li>将1 ml细胞悬液移液至随附的无菌电穿孔室中 原位 电穿孔仪（图1），置于37 oC，CO2 培养箱 
	注意：可通过在纤连蛋白、胶原蛋白、多聚赖氨酸或细胞与组织黏附剂上包被来提高细胞黏附性（参见材料表）。</li>
	<li>当细胞形成融合单层时，即可进行间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）检测。</li>
</ol>
2. 电穿孔实验步骤
由于电穿孔法检测间隙连接通讯（GJIC）仅需几分钟，因此可在超净工作台外进行。若特定实验需要更长的孵育时间，则可全程在超净工作台内进行。无论何种情况，细胞培养的腔室必须保持无菌。
<ol>
	<li>配制5 mg/ml的Lucifer yellow溶液：将10 mg LY粉末（随电穿孔仪提供）溶解于2 ml无钙培养基中。对于需要较长孵育时间的实验，需对溶液进行滤膜除菌，并于4oC保存。</li>
	<li>吸除培养基，用无钙培养基轻轻洗涤细胞，注意避免刮伤单层细胞或使细胞干燥。若细胞干燥，其细胞核通常颜色变深，并在未进行电穿孔的情况下非特异性摄取LY染料。该现象在载玻片中央区域更为明显，因该区域更易暴露于气流中（图4F）。</li>
	<li>使用Eppendorf移液器将染料溶液（整个腔室加400 μl）沿腔室边缘加入，注意避免接触细胞层。</li>
	<li>将培养腔室放入电穿孔仪配套的夹持装置中，并施加适当强度的电脉冲（参见讨论部分）。</li>
	<li>小心吸除部分LY溶液。该溶液可在次要实验中重复使用一次。</li>
	<li>加入含10%透析血清的无钙DMEM培养基。</li>
	<li>将细胞置于培养箱中孵育3–5分钟，以允许染料通过间隙连接进行转移。 
	注意：此步骤中加入透析血清有助于细胞膜孔道的闭合。</li>
	<li>用无钙DMEM洗涤未摄入的染料，用于活细胞观察。或者，可在本步骤固定细胞，即向孔中加入4%多聚甲醛，随后用PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤。无论何种情况，洗涤步骤均需彻底去除背景染料。 
	注意：在初步实验以确定最佳条件时，若电压过低，可将细胞在培养箱中恢复数分钟，然后对同一张载玻片进行第二次电穿孔，以节省载玻片成本。</li>
</ol>
3. 显微镜检查
<ol>
	<li>使用配备适合所用染料滤光片的倒置显微镜，在荧光照明下观察细胞。对于 Lucifer yellow，激发波长为 423 nm，发射波长为 555 nm，适用于 Nikon IX70 显微镜的 WBV 滤光片。</li>
	<li>在塑料小室中加满液体后，将玻璃盖玻片置于其上，以消除弯月面效应，从而在相差显微镜下观察细胞形态。为获得更清晰的图像，可将小室从载玻片上取下，再将盖玻片放置于框架上。对于固定后的细胞，可在小室中加入甘油以便显微观察；而对于活细胞，则必须使用培养基填充。 
	注意：在染料转移后（如上文步骤 2.7 所述）用甲醛固定细胞，将更便于后续的洗涤和拍照。若细胞未固定，荧光通常在约 60 分钟内消失，具体时间取决于细胞类型、电压以及引入的 Lucifer yellow（LY）量；而在固定细胞中，荧光可维持数小时。然而，即使在固定细胞中，经过过夜（O/N）孵育后荧光也会逐渐减弱或消散。因此，电穿孔后应尽快拍照（图 2）。</li>
</ol>
4. 细胞间通讯的定量分析
<ol>
	<li>使用20倍物镜在荧光和相差显微镜下拍摄细胞照片（图3）。</li>
	<li>在电穿孔区域与非电穿孔区域交界处，识别并用星号标记发生电穿孔的细胞（图2，箭头所示，电穿孔边缘）。</li>
	<li>在非电穿孔侧识别并通过圆点标记因染料通过间隙连接转移而产生荧光的细胞（图3A 和 图3B）。</li>
	<li>将非电穿孔区域中荧光细胞的总数除以沿边缘的电穿孔细胞数量（图3A 和 图3B）。 
	注意：每次实验需计算至少200个连续相邻的边缘电穿孔细胞的染料转移情况。所得数值即为GJIC值。</li>
</ol>

<ol><li>Raptis, L., et al. Electroporation of Adherent Cells in Situ for the Study of Signal Transduction and Gap Junctional Communication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRaptis%2C+L+%22Electroporation+protocols%22">Electroporation protocols</a>. , The Humana Press Inc. edited by S Li 167-183 (2008).</li>
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<li>Raptis, L., Vultur, A., Tomai, E., Brownell, H. L., Firth, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+electroporation+of+radioactive+nucleotides%3A+assessment+of+Ras+activity+and+32P-labelling+of+cellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+A+Laboratory+Handbook%2C+Celis%2C+Ed%22%5BJournal%5D)">In situ electroporation of radioactive nucleotides: assessment of Ras activity and 32P-labelling of cellular proteins.</a> Cell Biology A Laboratory Handbook, Celis, Ed. 43, 329-339 (2006).</li>
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</ol>

通讯作者是女王大学持有的一项专利的发明人，该专利已授权给 Cell Projects Inc. 公司。该公司或该大学对论文内容没有产生任何影响。

实验方案中的关键步骤
电穿孔材料 
用于电穿孔的材料纯度至关重要。如果细胞非常扁平，则必须使用更高浓度的示踪染料（对于 Lucifer Yellow（LY）可高达 20 mg/ml），在这种情况下，材料纯度的重要性甚至超过形状更接近球形的细胞1。除了 LY 外，已有多种其他染料或非通透性分子被使用，例如一系列 Alexa 染料，可用于检测由不同连接蛋白（connexins）组成的通道25。然而，溴化乙锭（Ethidium Bromide）或碘化丙啶（Propidium Iodide）等染料会嵌入 DNA 中，导致细胞核强烈荧光，从而使染料转移的定量分析更加困难（图 4D）。示踪染料的配制及洗涤步骤必须在无钙生长培养基中进行，因为钙离子内流可能中断细胞间连接通讯，并降低细胞活力。所有溶液在电穿孔前必须保持在 37oC，这有助于孔道闭合并提高细胞存活率1。
<strong...

对细胞施加电流会通过一种称为电穿孔的过程在细胞膜上形成孔隙。这些孔隙允许多种非通透性分子穿过细胞膜。通过精确控制电场，可使形成的孔隙非常微小，并在对细胞生理状态干扰最小的情况下迅速重新闭合。有趣的是，贴壁细胞可在涂有导电且透明的氧化铟锡（ITO）的玻片上培养，并进行电穿孔。 原位，即在细胞生长的表面上进行，无需将细胞从表面解离并在悬浮状态下进行电穿孔。细胞在此表面上可良好生长，且由于细胞保持贴壁和伸展状态，可实现精细的显微观察。利用该技术，可将小分子非通透性物质瞬时导入几乎所有100%的细胞中，因此该技术特别适用于研究受体在配体刺激后信号通路中各组分的激活情况（综述见1).
电穿孔技术主要用于导入DNA（亦称为电转染）。然而，电穿孔 原位 可用于引入多种分子，例如多肽2-4寡核苷酸，例如反义RNA、双链DNA诱饵寡核苷酸（用于抑制转录因子结合）或siRNA3,5,6放射性核苷酸7-10蛋白质1112 或前体药物13电穿孔后，细胞可进行裂解以用于生化分析，或经固定后用抗体染色。
导电的ITO涂层非常薄，厚度为800-1,000Å，因此当细胞生长跨越导电涂层边缘时，不会因两种表面的高度差异而干扰细胞生长。这一特性使得未电穿孔的细胞可以与电穿孔的细胞并排培养，作为对照。如视频中所述，该方法也可用于检测间隙连接细胞间通讯（GJIC）。
间隙连接是连接相邻细胞内部的通道14间隙连接性细胞间通讯在肿瘤形成和转移过程中发挥重要作用，而癌基因（如Src）会抑制间隙连接性细胞间通讯15,16为了检测间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC），通常通过显微注射或划痕载入法将荧光染料（如 Lucifer yellow，LY）导入培养细胞中。17 通过荧光照明在显微镜下观察染料向邻近细胞的扩散情况。然而，这些技术 invariably 会造成细胞损伤。本文描述了一种细胞培养于部分涂覆 ITO 的玻璃载片上的技术18在载玻片的导电区域上生长的细胞中加入LY（或其他染料）后施加电脉冲，使染料进入细胞，同时在荧光照明下通过显微镜观察染料向相邻未电穿孔细胞的迁移情况。为了避免干扰容易从单层脱落的敏感细胞，设计了一种无需将电极放置在细胞上方即可施加电流的装置。19该方法能够在大量细胞中定量检测间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC），且不会对细胞代谢产生可检测到的干扰，这一点通过血清刺激后G1期持续时间未受影响得以证实。12，fos原癌基因蛋白水平升高（Raptis，未发表）或两种与细胞应激相关的激酶p38hog 或 JNK/SAPK 激酶1这种方法使得考察两者之间的关联成为可能 水平 癌基因表达、转化及间隙连接通讯18，以及Src和Stat3在多种细胞类型中对GJIC的影响，包括从肺肿瘤标本中 freshly cultured 的细胞20-23此外， 原位 采用所述无顶部电极装置进行电穿孔，已成功用于展示脂肪细胞分化过程中间隙连接的关闭，尽管在此阶段细胞对基质的贴附性有所降低19,24.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro http://www.cellgro.com/</td><td>50-013-PB</td><td></td></tr><tr><td>不含钙的DMEM</td><td>Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com)</td><td>SH30319-01</td><td></td></tr><tr><td>供体小牛血清&amp;nbsp;</td><td>PAA: http://www.paa.com/</td><td>货号 B15-008</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>PAA: http://www.paa.com/</td><td>货号 A15-751</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔装置</td><td>Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/</td><td>ACE-100</td><td></td></tr><tr><td>培养室</td><td>Cell Projects Ltd UK</td><td>ACE-04-CC</td><td>4孔</td></tr><tr><td>培养室</td><td>Cell Projects Ltd UK</td><td>ACE-08-CC</td><td>8孔</td></tr><tr><td>荧光黄</td><td>Cell Projects Ltd UK</td><td>ACE-25-LY</td><td>高纯度</td></tr><tr><td>CelTak</td><td>BD Biosciences</td><td>354240</td><td>细胞和组织粘附剂</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>胶原蛋白</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>多聚赖氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于间隙连接功能检测的实验方法；在氧化铟锡上对贴壁细胞进行电穿孔

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

该技术将细胞培养在部分镀有氧化铟锡（ITO）的玻璃载片上，ITO 是一种透明且具有导电性的材料。通过这种非创伤性的方式，可将多种分子（如多肽或寡核苷酸）导入几乎 100% 的细胞中。&#160; 此处，我们描述该技术如何用于研究细胞间通过缝隙连接的通讯。当对细胞所生长的导电表面施加电脉冲时，细胞膜上会形成孔道，荧光素黄即可进入细胞，这一过程称为电穿孔。紧邻电穿孔区域、生长在非导电&#160;玻璃表面的细胞不会通过电穿孔摄取荧光素黄，但可通过连接它们与电穿孔细胞的缝隙连接，接收到传递而来的荧光染料。细胞间染料传递的结果可在荧光显微镜下观察。该技术可实现对缝隙连接通讯的精确定量。此外，该方法还可用于导入多肽或其他非通透性分子，而小分子多肽经电穿孔后通过缝隙连接传递至邻近未电穿孔细胞以抑制信号传导，是研究信号抑制作用的有力例证。

图2显示了经电穿孔导入LY后的大鼠肝上皮T51B细胞22，在固定和洗涤后，分别在荧光（图A和图B）或相差（图C）照明下拍摄的图像。在图A中，电穿孔区域的边缘以红色标出。红色线右侧的荧光梯度表示染料通过间隙连接进行了转移。在图3A和3B中展示了间隙连接通讯的定量结果：电穿孔区域边缘的细胞被识别并用星号标记，而染料转移到达的细胞则用圆点标记。该比值表示每个电穿孔边缘细胞平均转移染料至多少个细胞。在此示例中，共有57个圆点和10个星号，即，GJIC=5.7。
在 C 和 D 中，通过慢病毒载体稳定表达 siRNA，T51B 细胞中的信号转导子和转录激活子-3（Stat3）表达下调，导致间隙连接通讯（GJIC）减少，这表现为缺乏染料传递22。
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本演示介绍了一种利用电穿孔技术对贴壁培养细胞进行研究的方法，用于分析细胞间连接通讯，同时细胞生长在涂有导电透明氧化铟锡的载玻片上。

在此技术中，细胞培养在部分涂有氧化铟锡（ITO）的玻璃载片上，ITO 是一种透明且具有导电性的材料。

电穿孔是一种通过向活细胞施加电流，使其细胞膜上形成瞬时孔隙的技术。借助这些孔隙，原本无法穿过细胞膜的染料及其他分子可进入细胞内部，随后孔隙会迅速重新闭合，且不会对细胞造成损伤。我们将介绍如何对生长在部分涂有导电且透明材料的载玻片上的贴壁细胞进行电穿孔。材料为氧化铟锡，当其传导电流时，会打开孔隙，使染料进入细胞。随后即可检测细胞是否具有间隙连接，以及间隙连接的数量。间隙连接是连接相邻细胞内部的小通道，允许小分子通过。长期以来，人们已认识到间隙连接通讯在细胞中具有多种重要功能，包括肿瘤形成和转移。欢迎观看本 JoVE 细胞实验项目演示，介绍如何使用 Insitu 设备对贴壁细胞进行电穿孔。该图像显示了我们能够实现的效果：荧光染料（呈黄色）被导入生长在透明导电玻璃上的细胞中。在相位差显微镜下，可更清晰地观察到这一界限。这就是结果。可以看到，染料通过间隙连接从左侧经电穿孔法加载了染料的细胞扩散到了右侧细胞，从而形成了这种荧光梯度，细胞为 tryps。将细胞消化后转移至离心管中进行离心。细胞在培养腔内生长时必须充分铺展，因此最好通过离心去除残留的胰蛋白酶。吸出含有微量胰蛋白酶的培养基，将细胞重悬于约一毫升生长培养基中，然后接种到小室中。用移液器吸取细胞悬液，打开小室盖子，将细胞悬液逐滴加入小室中，以便于转移操作。将小室放入一个六厘米的培养皿中。将培养室放回培养箱中，使细胞继续生长。接种的细胞将充分铺展，并生长至相互接触，形成间隙连接。当细胞准备就绪进行电刺激时，将原位脉冲发生器设置为所需的条件。有关简易设置过程的说明，请参阅操作手册。当原位电压设定完成后，键盘上的红灯将亮起。从水浴中取出两瓶已预热的不含钙离子的DMEM培养基，其中一瓶为含透析血清但不含钙离子的DMEM，另一瓶为普通DMEM。在无钙条件下，将移液器预先调至较松档位以吸取黄色液体。不要等待，立即将细胞从培养箱中取出。首先将培养皿倒置，弃去洗涤烧杯中的培养基。然后用不含钙的 DMEM 将其在组织洗涤液中轻轻蘸洗一次，注意不要完全去除所有 DMEM，以免细胞干燥。将 Lucifer yellow 小心地加入屏障上，避免扰动细胞，但操作需迅速，以防细胞干燥。每个腔室的一半使用 200 微升。将盖子盖在原位腔室上，然后将其装入滑块中。通过推动滑块，确保腔室的末端标签插入滑块的插槽内。将腔室插入腔室支架中。按下脉冲发生器键盘上的脉冲按钮。在电穿孔过程中，脉冲发生器和腔室支架上的LED将闪红光，随后闪绿光，表示初始化循环已完成。将滑块拉回腔室支架下方，并取出腔室。吸出大部分 Lucifer yellow 以再次使用，但注意不要让细胞变干。加入不含钙的 DMEM。使用透析过的血清时，血清有助于多孔膜关闭，将培养板放回培养箱，以使 Lucifer yellow 通过间隙连接进行转移。每次实验的时间必须保持一致，标准时间为三分钟。将培养基倒入废液烧杯中。使用移液管或移液枪加入4%甲醛固定液，在室温下静置至少两分钟。倒掉甲醛溶液，并用PBS清洗数次。由于细胞已通过PBS固定在玻璃表面，因此在洗涤过程中几乎不会脱落。为了能够在相差显微镜下观察细胞，必须在腔室上方放置盖玻片。用PBS填充腔室，形成凸起的弯月面。在避免产生气泡的情况下，放置盖玻片。如果 PBS 溢出，不必担心，只需用纸巾吸去多余的 PBS 即可。你需要一台倒置荧光显微镜，最好配备相差功能以及适用于 Lucifer yellow 的滤光片组。在相差模式下，寻找电穿孔区域的边缘。在荧光细胞下方会看到两条线。载玻片的一半会强烈发光。靠近发光细胞的那条线是电穿孔区域的边缘。任何超出此范围的荧光均源于 Lucifer yellow 通过间隙连接的转移。例如，这幅上皮细胞图像显示，在图像左侧被电穿孔的细胞将 Lucifer yellow 转移至邻近未被电穿孔的细胞，从而形成从导电涂层边缘向右延伸的发光细胞梯度。此图像显示的是相同细胞在相差显微镜下的同一视野。请注意，X线非常清晰可见。可通过手动分析电穿孔细胞的荧光和相差图像，对缝隙连接转移的程度进行定量测量。导电区域边缘的星形细胞被视为供体细胞。它们已被电穿孔并释放出黄色的游离物质。它们将黄色荧光蛋白基因（luc）传递给右侧相邻的细胞，这些细胞继而继续传递，但传递量逐渐减少。本例中，点与星的比率为41比8，可由此得出一个数值，用于比较此情况下缝隙连接转移的程度。5.1即为缝隙连接指数。除手动标记和计数细胞外，另一种方法是使用图像分析软件，测量电穿孔细胞边界非电穿孔侧的荧光相对强度。这些细胞没有缝隙连接。此处为电穿孔区域的右侧边缘。请注意，荧光没有梯度分布，这在相差显微镜下表明不存在缝隙连接。您可以清楚地看到所有细胞。请注意，X 线在此示例中也清晰可见。腔室中的所有细胞均用表皮生长因子 EGF 进行刺激，10 分钟后固定并用磷酰化 arc 探针进行检测。请注意，右侧染色的细胞未经过电穿孔处理，而左侧至这条线为止的细胞已进行电穿孔。未电穿孔的细胞显示出棕褐色染色，使用了磷酰化 irk 抗体和免疫过氧化物酶法。电穿孔的细胞未显示染色，因为电穿孔导入的磷酸化肽阻断了Grab2的SSH二结构域，从而抑制了EGF的Irk磷酸化。注意在电穿孔线右侧三到四个细胞长度范围内的区域，这些细胞尚未被电穿孔，但也未显示染色。这些细胞是通过缝隙连接从邻近已电穿孔的细胞获得了阻断肽。这是最有力的证明，表明信号的抑制必须归因于该肽段，而不可能是电穿孔造成的假象。由于这些细胞未经过电穿孔处理，因此此处显示的是同一视野下的相差图像。请注意电穿孔后细胞形态未发生任何改变。对于某些患者，可以在多种培养细胞中精确定量分析细胞间的缝隙连接通讯。通过引入多肽来阻断特定的信号通路，是一种有效评估已通过纯化蛋白鉴定出的蛋白质-蛋白质相互作用在活细胞中相关性的强大方法。这可能是开发肽类药物的第一步关键步骤。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

对缝隙连接检查功能测定;贴壁细胞的氧化铟锡电

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在哺乳动物细胞中异源表达离子通道的诱变与功能分析

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一种用于间隙连接功能检测的实验方法；在氧化铟锡上对贴壁细胞进行电穿孔

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