一种用于间隙连接功能检测的实验方法；在氧化铟锡上对贴壁细胞进行电穿孔

电穿孔是一种通过向活细胞施加电流，使其细胞膜上形成瞬时孔隙的技术。借助这些孔隙，原本无法穿过细胞膜的染料及其他分子可进入细胞内部，随后孔隙会迅速重新闭合，且不会对细胞造成损伤。我们将介绍如何对生长在部分涂有导电且透明材料的载玻片上的贴壁细胞进行电穿孔。

材料为氧化铟锡，当其传导电流时，会打开孔隙，使染料进入细胞。随后即可检测细胞是否具有间隙连接，以及间隙连接的数量。间隙连接是连接相邻细胞内部的小通道，允许小分子通过。长期以来，人们已认识到间隙连接通讯在细胞中具有多种重要功能，包括肿瘤形成和转移。

欢迎观看本 JoVE 细胞实验项目演示，介绍如何使用 Insitu 设备对贴壁细胞进行电穿孔。该图像显示了我们能够实现的效果：荧光染料（呈黄色）被导入生长在透明导电玻璃上的细胞中。在相位差显微镜下，可更清晰地观察到这一界限。

这就是结果。可以看到，染料通过间隙连接从左侧经电穿孔法加载了染料的细胞扩散到了右侧细胞，从而形成了这种荧光梯度，细胞为 tryps。

将细胞消化后转移至离心管中进行离心。细胞在培养腔内生长时必须充分铺展，因此最好通过离心去除残留的胰蛋白酶。

吸出含有微量胰蛋白酶的培养基，将细胞重悬于约一毫升生长培养基中，然后接种到小室中。用移液器吸取细胞悬液，打开小室盖子，将细胞悬液逐滴加入小室中，以便于转移操作。将小室放入一个六厘米的培养皿中。

将培养室放回培养箱中，使细胞继续生长。接种的细胞将充分铺展，并生长至相互接触，形成间隙连接。当细胞准备就绪进行电刺激时，将原位脉冲发生器设置为所需的条件。

有关简易设置过程的说明，请参阅操作手册。当原位电压设定完成后，键盘上的红灯将亮起。从水浴中取出两瓶已预热的不含钙离子的DMEM培养基，其中一瓶为含透析血清但不含钙离子的DMEM，另一瓶为普通DMEM。

在无钙条件下，将移液器预先调至较松档位以吸取黄色液体。不要等待，立即将细胞从培养箱中取出。首先将培养皿倒置，弃去洗涤烧杯中的培养基。

然后用不含钙的 DMEM 将其在组织洗涤液中轻轻蘸洗一次，注意不要完全去除所有 DMEM，以免细胞干燥。将 Lucifer yellow 小心地加入屏障上，避免扰动细胞，但操作需迅速，以防细胞干燥。每个腔室的一半使用 200 微升。

将盖子盖在原位腔室上，然后将其装入滑块中。通过推动滑块，确保腔室的末端标签插入滑块的插槽内。将腔室插入腔室支架中。

按下脉冲发生器键盘上的脉冲按钮。在电穿孔过程中，脉冲发生器和腔室支架上的LED将闪红光，随后闪绿光，表示初始化循环已完成。将滑块拉回腔室支架下方，并取出腔室。

吸出大部分 Lucifer yellow 以再次使用，但注意不要让细胞变干。加入不含钙的 DMEM。使用透析过的血清时，血清有助于多孔膜关闭，将培养板放回培养箱，以使 Lucifer yellow 通过间隙连接进行转移。

每次实验的时间必须保持一致，标准时间为三分钟。将培养基倒入废液烧杯中。

使用移液管或移液枪加入4%甲醛固定液，在室温下静置至少两分钟。倒掉甲醛溶液，并用PBS清洗数次。由于细胞已通过PBS固定在玻璃表面，因此在洗涤过程中几乎不会脱落。

为了能够在相差显微镜下观察细胞，必须在腔室上方放置盖玻片。用PBS填充腔室，形成凸起的弯月面。在避免产生气泡的情况下，放置盖玻片。

如果 PBS 溢出，不必担心，只需用纸巾吸去多余的 PBS 即可。你需要一台倒置荧光显微镜，最好配备相差功能以及适用于 Lucifer yellow 的滤光片组。在相差模式下，寻找电穿孔区域的边缘。

在荧光细胞下方会看到两条线。载玻片的一半会强烈发光。靠近发光细胞的那条线是电穿孔区域的边缘。

任何超出此范围的荧光均源于 Lucifer yellow 通过间隙连接的转移。例如，这幅上皮细胞图像显示，在图像左侧被电穿孔的细胞将 Lucifer yellow 转移至邻近未被电穿孔的细胞，从而形成从导电涂层边缘向右延伸的发光细胞梯度。此图像显示的是相同细胞在相差显微镜下的同一视野。

请注意，X线非常清晰可见。可通过手动分析电穿孔细胞的荧光和相差图像，对缝隙连接转移的程度进行定量测量。导电区域边缘的星形细胞被视为供体细胞。

它们已被电穿孔并释放出黄色的游离物质。它们将黄色荧光蛋白基因（luc）传递给右侧相邻的细胞，这些细胞继而继续传递，但传递量逐渐减少。

本例中，点与星的比率为41比8，可由此得出一个数值，用于比较此情况下缝隙连接转移的程度。5.1即为缝隙连接指数。除手动标记和计数细胞外，另一种方法是使用图像分析软件，测量电穿孔细胞边界非电穿孔侧的荧光相对强度。

这些细胞没有缝隙连接。此处为电穿孔区域的右侧边缘。请注意，荧光没有梯度分布，这在相差显微镜下表明不存在缝隙连接。

您可以清楚地看到所有细胞。请注意，X 线在此示例中也清晰可见。

腔室中的所有细胞均用表皮生长因子 EGF 进行刺激，10 分钟后固定并用磷酰化 arc 探针进行检测。请注意，右侧染色的细胞未经过电穿孔处理，而左侧至这条线为止的细胞已进行电穿孔。未电穿孔的细胞显示出棕褐色染色，使用了磷酰化 irk 抗体和免疫过氧化物酶法。

电穿孔的细胞未显示染色，因为电穿孔导入的磷酸化肽阻断了Grab2的SSH二结构域，从而抑制了EGF的Irk磷酸化。注意在电穿孔线右侧三到四个细胞长度范围内的区域，这些细胞尚未被电穿孔，但也未显示染色。这些细胞是通过缝隙连接从邻近已电穿孔的细胞获得了阻断肽。

这是最有力的证明，表明信号的抑制必须归因于该肽段，而不可能是电穿孔造成的假象。由于这些细胞未经过电穿孔处理，因此此处显示的是同一视野下的相差图像。请注意电穿孔后细胞形态未发生任何改变。

对于某些患者，可以在多种培养细胞中精确定量分析细胞间的缝隙连接通讯。通过引入多肽来阻断特定的信号通路，是一种有效评估已通过纯化蛋白鉴定出的蛋白质-蛋白质相互作用在活细胞中相关性的强大方法。这可能是开发肽类药物的第一步关键步骤。