RNA催化剂作为记者为筛选药物对RNA编辑在锥虫
July 22nd, 2014
的高灵敏度基于核酶的测定，适用于针对锥虫病原菌中 RNA 编辑独特过程的化学物质的高通量筛选。抑制剂可用作 RNA 编辑过程的假设驱动分析的工具，并最终用作治疗药物。
该程序的总体目标是使用从 Trias Broce 中提取的功能性 omes 进行 RNA 编辑，以快速鉴定 omes 抑制剂。这是通过首先从 tbr 中分离线粒体和目标 edito 区来实现的。第二步是制备合成的 RNA 编辑报告基因底物。
接下来，化合物与 RNA 编辑报告基因一起与纯化的 edito 区结合。在存在阻断编辑区功能的化合物的情况下，RNA 报告基因不会进行编辑，并且将保持非活性。最后一步是添加 F 线底物并监测 RNA 编辑报告基因选择性和特异性切割该底物的能力。
在抑制性化合物的情况下，RNA 编辑被阻断，并且会检测到荧光信号减弱或没有荧光信号。最终，使用实时 PCR 机器来监测从 FRET 底物发射的荧光随时间的变化。与传统的体外编辑分析相比，该技术的主要优点是它是一种简单快速的基于荧光的混合和测量报告基因分析，可用于针对 RNA 编辑的化合物的高通量筛选。
首先，如随附文本方案中所述，为 tusi pro 无环形式细胞准备生长培养基。接下来，种植 300 毫升 TBRC 1.7。野生型 pro acyclic 在 28 摄氏度下形成细胞，同时以 70 RPM 摇动细胞 48 小时。
一旦细胞密度达到每毫升 10 倍 10 至第七个细胞的密度，将细胞在 6， 000 GS 下在 4 摄氏度下离心 10 分钟。然后用 50 毫升冷冻磷酸盐、缓冲盐水、葡萄糖或 PBSG 缓冲液洗涤沉淀，并在 4 摄氏度下以 10， 000 G 离心细胞 10 分钟。首先，我们将收获的细胞悬浮在 30 毫升 DTE 缓冲液中，使用 40 毫升预冷无菌羽绒均质器在冰上破坏细胞膜 10 次。
接下来，立即将 4.3 ml 60% 蔗糖加入匀浆并离心。溶液在 4 摄氏度下以 15， 800 Gs 反应 10 分钟。为了降低线粒体，将线粒体沉淀重新悬浮在 4.6 毫升 STM 缓冲液中。
然后加入 13.8 微升 0.1 摩尔氯化钙和 4 微升 RNA 游离 DNA，并在冰上孵育混合物 1 小时。接下来，加入 4.6 ml STE 缓冲液灭活 DNA，并在 4 摄氏度下以 15， 800 Gs 离心混合物 10 分钟。然后将沉淀重新悬浮在 400 μL 裂解缓冲液中，并将混合物转移到微量离心管中。
向试管中加入终浓度为 1% 的 10% Triton X 100，并在试管旋转器上将裂解物在 4 摄氏度下孵育 15 分钟。然后通过在 4 摄氏度下以 17， 000 Gs 的浓度离心溶液 2 次，持续 15 分钟来清除线粒体裂解物，每次都保留澄清的 snat。按照手册中的说明，使用两个 XHHE 梯度缓冲液和一个梯度标记，将 10 mL、10% 至 30% 线性甘油梯度倒入超速离心管中。
接下来，小心地从甘油梯度顶部取出 500 微升溶液，并将 500 微升清除的线粒体裂解物轻轻加载到超速离心管中。在 4 摄氏度下以 178， 000 GS 离心管 6 小时。在 4 摄氏度下从梯度的顶部到底部依次收集 500 微升馏分。
然后用液氮吸附、冷冻馏分并储存在零下 80 摄氏度。Anil 相应的 DNA 模板，其中包含 T 7 互补序列，摩尔比为 1：1。接下来，使用体外转录试剂盒转录 RNA，并按照说明手册进行作。
通过加入等体积的 7 摩尔尿素染料来终止转录反应。在过滤灭菌的 9% 变性聚丙烯酰胺凝胶上运行。然后使用短波紫外灯定位并切除相应的 RNA。
将切除的凝胶片放入微量离心管中，加入 400 微升凝胶洗脱缓冲液，在室温下在试管旋转器上洗脱 RNA 过夜。接下来，加入 1 毫升冷的 100% 乙醇，并在零下 20 摄氏度下孵育 30 分钟，沉淀洗脱的 RNA。将混合物在 16， 000 GS 下在 4 摄氏度下离心 30 分钟，以沉淀 RNA。
然后用 1 毫升 75% 乙醇洗涤沉淀，并在 4 摄氏度下以 16 GS 离心管 20 分钟。接下来，我们将 RNA 沉淀悬浮在不含 RNA 的水中，以使用列出的比例达到所需的浓度。通过将 1 微升 pre A six RBZ 和 1 微升 GA six RBZ 混合在微量离心管中开始测定。
将溶液在 70 摄氏度下孵育 3 分钟，然后在室温下静置 10 分钟。接下来，准备预混液并将 anil pre A six RBZ 和 GA six RBZ 添加到混合物中。最后，然后将 18 μL 预混液分配到孔中。
接下来，用板密封机密封板并将其向下旋转以去除任何气泡。然后在 2 微升 GA six RBZ 竞争产品中孵育后，将板在 28 摄氏度下孵育 4 小时。对于每个，将新的密封件放在板上，然后将其旋转并使用以下程序进行实时 PCR。
程序完成后，向每个孔中加入 1 微升 Frent 底物，最终体积为 23 微升，并用新的密封件密封板。快速离心板并将其放回实时荧光定量 PCR 仪中。接下来，使用以下步骤对新实验进行编程。
然后通过选择所有需要读取的孔并选择 FAM 过滤器来设置板。将输入体积设置为 23 μL 并开始运行。最后，通过在条形图上绘制斜率进行分析，计算从每个样品获得的值的斜率，以获得动力学测量值。
为了确定该分析的质量，计算了不同底物的信噪比。使用 Tamara Quinter 和 Iowa Black dark Quinter 的品丝基材都是用于高通量筛选的可行选择。使用基于荧光的测定法测试甘油梯度级分的体外编辑活性，当需要更多编辑区时，可以合并最活跃的级分。
使用不同的对照样品来分析反应中缺少任何 RNA 编辑组分的变量。Cleve 在编辑反应的所有组分存在下观察到底物切割，在没有抑制剂或存在所有编辑组分和无活性化合物的情况下。相比之下，抑制性化合物可以阻断 RNA 编辑并用作阳性对照 在尝试此过程时。
保持无 RNA 的环境并尽可能保护 FRET 底物和光敏化合物免受光线照射非常重要。
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概览
本研究提出了一种基于核酶的检测方法，旨在对靶向试剂组瘤原虫病原体RNA编辑的化学物质进行高通量筛选。该检测方法能够识别可用于假设驱动分析和潜在治疗应用的抑制剂。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 病原体生物学
背景
- RNA编辑是试剂组瘤原虫病原体中的关键过程。
- 理解RNA编辑可以带来新的治疗策略。
- 目前研究RNA编辑的方法在灵敏度和通量方面存在局限。
- 本研究旨在为此目的开发更有效的检测方法。
研究目的
- 创建一个用于RNA编辑的灵敏核酶基检测方法。
- 促进潜在抑制剂的高通量筛选。
- 推进对试剂组瘤原虫RNA编辑机制的理解。
使用的方法
- 从Trias Broce中分离线粒体和目标编辑区域。
- 制备合成RNA编辑报告基底。
- 与化合物和纯化的编辑区域进行结合检测。
- 使用F线基底监测RNA编辑报告活性。
主要结果
- 该检测方法成功识别出抑制RNA编辑的化合物。
- 抑制剂阻止了RNA报告基底的编辑。
- 该方法展示了高灵敏度和特异性。
- 讨论了已识别抑制剂的潜在治疗应用。
结论
- 基于核酶的检测方法是研究RNA编辑的有价值工具。
- 这种方法可以为试剂组瘤原虫生物学带来新的见解。
- 已识别的抑制剂可能作为药物开发的起点。
常见问题解答
Executive Industry Relevance
High-throughput identification of inhibitors targeting the trypanosome editosome is critical for advancing antiparasitic drug discovery and mechanistic de-risking in RNA editing biology. The fluorescence-based hammerhead ribozyme reporter assay enables rapid, quantitative screening of chemical libraries, supporting early-stage target validation and functional dissection of the editosome complex. This platform enhances predictive confidence and portfolio triage for RNA editing-focused therapeutic programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of the editosome complex in a controlled in vitro system.
- Supports biological de-risking by directly linking compound activity to RNA editing inhibition.
- Facilitates rapid triage of chemical probes for mechanistic studies and target validation.
Screening & Assay Development
- Provides a homogenous, mix-and-measure assay format suitable for high-throughput compound screening.
- Delivers quantitative, reproducible fluorescence readouts for robust assay standardization.
- Accelerates assay development cycles by eliminating radioactivity and complex workflows.
Translational & Preclinical Research
- Enables identification of tool compounds for downstream mechanistic and translational studies.
- Supports continuity from early discovery to preclinical validation by providing actionable molecular probes.
- Reduces risk of late-stage attrition by clarifying editosome function and inhibitor specificity.
Pipeline & Workflow Integration
This FRET-based assay integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing a scalable platform for screening, hit validation, and mechanistic follow-up in RNA editing research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of editosome function and inhibitor impact.
- Screening: Delivers high-throughput, quantitative outputs for compound prioritization.
- Analytics: Enables kinetic measurement and comparative analysis of inhibitor efficacy.
- Translational Research: Supplies validated tool compounds for further biological and disease-relevant studies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable assay platform adaptable to diverse RNA editing targets and compound libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target engagement and mechanistic de-risking.
- Operational Value: Streamlines workflows with standardized, scalable, and non-radioactive assay formats.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital allocation in early-stage portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement and prioritization of RNA editing-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA biochemistry and fluorescence assay development.
- Needs access to real-time PCR or fluorescence plate readers for kinetic measurements.
- Demands rigorous RNA-free and light-protected laboratory conditions to ensure assay fidelity.
- Assay adaptation may be necessary for different editosome variants or RNA substrates.
- Control experiments are essential to validate specificity and minimize false positives.
