利用 Jsubtomo 对电子冷冻断层成像重构结果中的病毒包膜糖蛋白刺突进行平均化处理

本实验的总体目标是研究包膜病毒表面存在的糖蛋白复合物的结构。首先，通过之前由冷冻电子显微镜数据计算得到的断层成像体积，定位其中的病毒颗粒，从而实现这一目标。第二步是利用人工定义的数据子集，构建两个在统计学上相互独立的糖蛋白复合物的初始模型。

接下来，对这些模型进行优化，然后用于自动检测病毒颗粒上所有的糖蛋白复合物。最后一步是利用完整的数据集对糖蛋白复合物的结构进行精细优化。最终，使用分子可视化工具解析所得的最终结构。

对这些糖蛋白刺突进行三维结构分析，对于理解病毒致病机制以及药物设计具有重要价值。与X射线晶体学等现有方法相比，该技术的主要优势在于能够解析膜蛋白在天然膜环境中的结构。该技术有助于解决结构生物学中的关键科学问题。

例如，许多含膜病毒的结构。尽管该技术可为这些病毒中的糖蛋白复合物提供深入见解，但也适用于其他体系，如嵌入脂质体中的膜蛋白。本实验流程将由我团队的两位成员Slee和David Bittel进行演示。

首先，在B show中打开一个autogram文件。使用颗粒挑选工具，通过定义病毒颗粒的中心坐标，在图像中手动挑选病毒颗粒。重复此步骤，直到所有变异株均已被处理。

将病毒坐标保存至 star 文件中。接着对所有断层图像重复此过程。然后以提取模式运行 J sub tomo py，将每个子断层图中的病毒颗粒提取为独立的体积文件，并使用保存的 star 文件作为输入文件，生成两个独立的初始模型。

首先，打开卵巢子体积图文件。在 B 中显示。通过工具箱窗口中的颗粒挑选工具，定义一个峰的中心坐标，从而在 Varian 子体积中选取一部分峰。

重复此步骤，直到所有明显可区分的刺突蛋白均被处理完毕。将刺突蛋白的坐标保存至 star 文件中。重复此步骤，直到大约处理了 200 个糖蛋白刺突为止。

按照文本方案中所述将视图分配给变体后，使用 J sub tomo 创建真实空间掩膜。运行 mask py。然后使用 J sub tomo create wedge mask py 生成倒易空间掩膜。

倒易空间掩模用于排除因单轴断层数据采集而产生的缺失楔形区域。接下来，使用 J.Sub tomo create averages.PY，并以保存的选择文件作为输入文件，生成两个初始平均结构。

使用迭代法对之前生成的两个模型进行对齐和平均，以减少初始平均值中的噪声，具体操作使用 J sub tomo iterate gold PY 工具。该过程两个阶段的详细信息可在文本方案中找到。通过在 kyira 中检查最终的低通滤波图文件，评估结构的对称性程度。例如，如果刺突蛋白为三聚体复合物，则应能明显观察到三重对称性。

继续按照文本方案中的详细步骤优化结构。接下来，在Varian表面均匀生成用于模板匹配的种子，并通过运行JVs py为这些种子分配初始视角向量。使用先前生成的star文件作为输入文件，生成的种子数量应约为预期刺突数量的1.5倍。

该视图向量近似于最接近每个种子点的刺突蛋白的方向。接下来，像之前一样生成病毒表面的两个独立平均值。然后按照文本方案中详述的方法优化种子点的位置。

最后，使用 jvs.py 生成优化后的种子星形文件的 com 标记文件。通过打开 CMM 文件及相关的病毒粒子图谱文件来检查种子。在 kyira 中进行。

确保精细定位的种子相对于病毒膜正确对齐。可根据交叉相关系数对精细标记进行着色，自动定位Varian子体积中所有刺突蛋白，方法是在精细种子周围使用局部模板匹配来定位刺突蛋白，对其进行对齐并取平均值，并将手动挑选刺突蛋白子集生成的平均结构用作初始模板。有关此过程的更多细节，请参见文字版实验方案。为可视化结果，可在Kyira中打开刺突蛋白的精细结构进行可视化。

继续拟合原子结构，然后使用 j Subo Create model DO py 创建病毒粒子的复合模型。最后在 kyira 中打开该复合模型进行可视化。

初始模型通过205个手动挑选的刺突蛋白进行了优化。三重对称性在中心最突出的刺突蛋白上无需施加任何对称约束即可明显观察到，并在后续的优化轮次中被施加，以在Varian病毒表面手动检测所有刺突蛋白。每个病毒颗粒在43纳米半径、间隔20度的位置上生成106个种子点，并相对于膜结构对其位置进行迭代优化。

选用相关性最佳的糖蛋白刺突区域计算最终平均结构，该平均结构的分辨率达到35埃。结果显示，中心区域存在三聚体刺突结构，此外还包含来自六个相邻刺突的部分贡献。

通过将结构置于已知位置来计算Varis的复合模型，揭示了刺突蛋白位于Varian表面的分布情况。偶尔可观察到刺突蛋白存在局部有序的簇状区域。在进行此操作时，务必仅使用最佳数据，并仔细检查所有中间结果。

通过此步骤，可将X射线晶体学结构拟合到最终的平均结构中，从而更准确地观察蛋白质-蛋白质相互作用。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用J Omo对病毒包膜糖蛋白结构进行平均处理。