Name: DNA的亲和纯化的芯片（DAP芯片）方法来确定目标基因的细菌双组分调控系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 学习使用DNA亲和纯化芯片（DAP芯片）方法鉴定细菌双组分调控系统的靶基因。该方法通过体外微阵列技术确定反应调节蛋白的基因组结合位点，无需已知激活信号即可分析基因调控网络。

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感谢 Amy Chen 在视频拍摄准备过程中提供的帮助以及对实验技术的示范。本研究由 ENIGMA：生态系统与基因及分子组件集成网络（http://enigma.lbl.gov）完成，ENIGMA 是劳伦斯伯克利国家实验室的科学重点研究领域项目，项目经费由美国能源部科学办公室、生物与环境研究办公室通过合同编号 DE-AC02-05CH11231 提供支持。

注意：以下方案专为确定细菌Desulfovibrio vulgaris Hildenborough中反应调节因子DVU3023的基因靶标而设计，也可根据需要调整用于研究其他感兴趣的转录调控因子。
1. 克隆并纯化RR
<ol>
	<li>从脱硫弧菌 Hildenborough（D. vulgaris）中克隆 RR 基因 DVU3023，并将其插入大肠杆菌（Escherichia coli）表达载体，使该基因带有C端His标签，且其表达受T7启动子调控。 
	注意：可采用多种克隆方法，具体由研究人员决定。也可使用其他亲和标签。</li>
	<li>将表达载体转化至大肠杆菌（E. coli）BL21 (DE3) 表达菌株中。</li>
	<li>在37 °C下培养1 L BL21表达菌液。当菌液达到对数中期时，加入IPTG至终浓度0.5 mM以诱导蛋白表达。随后在室温下继续培养24小时。</li>
	<li>在4 °C条件下，以5,000 × g离心10分钟收集菌体。用裂解缓冲液（20 mM 磷酸钠，pH 7.4，500 mM NaCl，40 mM 咪唑，1 mg/ml 溶菌酶，1× 苯并核酸酶）重悬菌体，并在4 °C下使用French压滤器裂解细胞。</li>
	<li>在4 °C条件下，以15,000 × g离心裂解液30分钟，随后使用0.45 µm针头滤器过滤。</li>
	<li>在FPLC仪器上，用10 ml洗涤缓冲液（20 mM 磷酸钠，pH 7.4，500 mM NaCl，40 mM 咪唑）清洗1 ml Ni Sepharose层析柱。</li>
	<li>将裂解液上样至层析柱，再用20 ml洗涤缓冲液洗涤层析柱。</li>
	<li>使用洗脱缓冲液（20 mM 磷酸钠，pH 7.4，500 mM NaCl，500 mM �咪唑）进行0–100%梯度洗脱，收集DVU3023蛋白。</li>
	<li>将洗脱组分上样至脱盐柱，并用脱盐缓冲液（20 mM 磷酸钠，pH 7.4，100 mM NaCl）进行洗涤。</li>
	<li>使用高分子量截留的离心滤管对蛋白样品进行离心浓缩。加入DTT至终浓度0.1 mM，并加入甘油至终浓度50%，将蛋白于-20 °C保存。 
	注意：针对每种研究蛋白，纯化方法需单独优化。</li>
</ol>
2. 使用电泳迁移率变动分析法（EMSA）确定RR的基因靶标
<ol>
	<li>PCR 扩增候选靶基因 DVU3025 上游 400 bp 区域，使用 D. vulgaris 以 Hildenborough 基因组 DNA 为模板，使用一条未标记的正向引物和一条 5’-生物素标记的反向引物。 
	注意：选择候选靶基因的建议：通常，响应调节子（RR）会结合其自身基因/操纵子的上游区域，或可能调控邻近编码的基因。如果该RR在其他物种中有直系同源物，可寻找其邻近区域中保守的基因。替代方法包括基于调控子预测来选择候选基因例如,&#160;RegPrecise5，或预测依赖σ54的启动子6 对于那些本身依赖σ⁵⁴的RRs。</li>
	<li>将PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，切下大小约为400 bp的条带，使用凝胶回收试剂盒纯化DNA。</li>
	<li>将 DVU3023 蛋白（0.5 pmol）与 100 fmol 生物素标记的 DNA 底物在含有 10 mM Tris HCl（pH 7.5）、50 mM KCl 和 5 mM MgCl₂ 的缓冲液中混合2，1 mM DTT，25% 甘油，以及 1 µg/ml poly dI·dC（非特异性竞争 DNA），总体积为 20 µl。同时设置一个不含任何蛋白质的反应作为对照。将反应体系在室温下孵育 20 分钟。</li>
	<li>注意：以上为标准反应条件，可根据具体研究的RR（响应调节子）添加其他反应组分。若需实现激活，可在反应体系中加入50 mM乙酰磷酸（通常情况下，RR会结合DNA） 体外 未激活状态下</li>
	<li>预先将预制的微型6%聚丙烯酰胺-0.5×TBE凝胶在0.5×TBE缓冲液中以100 V预电泳30分钟。向结合反应体系中加入5 µl 5×上样缓冲液（含0.1%溴酚蓝、0.1%二甲苯氰蓝、30%甘油的1×TBE溶液），取18 µl反应产物上样至凝胶。以100 V电泳2小时。 
	注意：为避免过热导致蛋白质-DNA复合物解离，可将电泳系统的外层缓冲液室中加入电泳运行缓冲液，使凝胶的大部分区域被缓冲液包围而达到隔热效果。或者，也可在4 °C条件下进行电泳。</li>
	<li>将带电尼龙膜裁剪至与凝胶相同大小，并在0.5x TBE中浸泡至少10分钟。从胶盒中取出凝胶，修去凝胶边缘的突起部分，将凝胶和膜夹在两层浸透0.5x TBE的厚滤纸之间，放入半干式转膜仪中，以20 V电压运行30分钟。</li>
	<li>将膜放入商用紫外光交联仪中，并设置时间为3分钟。 
	注意：膜可在室温下干燥保存数天，之后再进行下一步操作。</li>
	<li>使用商品化的化学发光检测试剂盒，按照生产商说明书，利用链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物显影印迹膜。</li>
	<li>使用连接到配备CCD相机的计算机成像印迹，观察在RR存在下DNA底物迁移率的变化，该变化表明RR结合了被检测的DNA。 
	注意：可通过在反应中加入过量的未标记竞争性 DNA 来检测蛋白-DNA 迁移的特异性，这应会消除或减弱观察到的迁移现象。</li>
</ol>
3. 基因组DNA-蛋白质结合后验证靶标富集
<ol>
	<li>基因组DNA-蛋白质结合反应
	<ol>
		<li>使用微探头对1.5 ml离心管中的100 µl基因组DNA（浓度为100–200 ng/µl）进行超声处理，设置9次低强度脉冲，每次1秒，脉冲间间隔2秒，将基因组DNA剪切至平均片段大小为500 bp。 
		注意：如果DNA溅到管壁上，每次脉冲后需离心收集管内液体。具体实验条件取决于所使用的超声破碎仪。剪切后的DNA片段长度可能在100-1000 bp之间，但平均片段大小应为400-600 bp。过度剪切可能导致结合位点完整性降低，而剪切不足或过度均会影响后续全基因组扩增步骤中的文库构建。</li>
		<li>将2-3 µg剪切的基因组DNA与RR蛋白（0.5 pmol DVU3023）在含有10 mM Tris-HCl（pH 7.5）、1 mM DTT、50 mM KCl和5 mM MgCl₂的缓冲液中混合2，25% 甘油和 50 mM 乙酰磷酸。在 25 °C 下孵育反应 30 分钟。取 10 µl 该反应液转移至 1.5 ml 离心管中，标记为 input DNA。 
		注意：加入乙酰磷酸盐以通过磷酸化激活蛋白 体外 磷酸化。磷酸化可促进DNA结合，但许多响应调节蛋白（RRs）也能在未磷酸化状态下结合DNA 体外 未激活状态7反应中添加的蛋白量取决于蛋白制备物的活性，可通过EMSA优化该用量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>亲和纯化与蛋白质结合的DNA
	<ol>
		<li>向一个0.6 ml微量离心管中加入30 µl Ni-NTA琼脂糖树脂。以100 × g离心1 min，使树脂沉淀至管底，弃去上清液。加入100 µl洗涤缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，5 mM MgCl₂）2，50 mM KCl，25% 甘油），轻弹管壁混匀，于 100 × g 离心 2 分钟。弃上清液。</li>
		<li>将剩余的90 µl结合反应液加入经洗涤的Ni-NTA树脂中，在旋转摇床上孵育30分钟。</li>
		<li>以 100 × g 离心 2 分钟，弃去上清液（未结合的 DNA）。加入 100 µl 洗涤缓冲液，轻弹管壁混匀，以 100 × g 离心 2 分钟。弃去上清液。重复洗涤步骤两次。</li>
		<li>加入35 µl洗脱缓冲液（20 mM磷酸钠缓冲液 pH 8，500 mM NaCl，500 mM咪唑）至树脂中，涡旋混匀。室温放置孵育5分钟。以100 × g离心2分钟。将上清液转移至新的1.5 ml离心管中，标记为蛋白结合的DNA组分。</li>
		<li>同时向输入DNA中加入35 µl洗脱缓冲液。</li>
		<li>使用PCR纯化试剂盒纯化输入样本和蛋白质结合的DNA组分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对输入样本和蛋白质结合的DNA样本进行全基因组扩增。
	<ol>
		<li>向不同的PCR管中分别加入10 µl输入DNA和蛋白结合DNA。向每个样本中加入1 µl 10x片段化缓冲液、2 µl文库制备缓冲液和1 µl文库稳定化溶液。充分涡旋混匀。在热循环仪中95 °C加热2 min，然后置于冰上冷却。 
		注意：起始DNA量应至少为10 ng，以避免引入扩增偏差。</li>
		<li>加入1 µl文库制备酶，用移液器混匀，然后在热循环仪中依次于16 °C孵育20分钟、24 °C孵育20分钟、37 °C孵育20分钟、75 °C孵育5分钟，最后置于4 °C保存。</li>
		<li>向每个试管中加入47.5 µl 水、7.5 µl 10x扩增主混合液和5 µl DNA聚合酶。充分混匀后，于95 °C加热3 min，随后进行20个循环的94 °C/15 sec、65 °C/5 min扩增反应。反应结束后置于4 °C保存。</li>
		<li>使用PCR纯化试剂盒纯化扩增的DNA样品，并通过分光光度法测定DNA浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用qPCR验证蛋白质结合DNA中的靶标富集
	<ol>
		<li>使用任意免费的引物设计软件，设计用于扩增经EMSA验证的目标基因（DVU3025）上游区域200 bp的qPCR引物。</li>
		<li>为每种DNA模板与每对引物设置三个重复的qPCR反应。针对每对引物配制相应的主混合液。1×主混合液包含10 µl的2×Sybr Green qPCR混合液、每种引物各0.5 µM，并加水至总体积为18 µl。将18 µl主混合液分装至96孔PCR板的每个孔中。</li>
		<li>将扩增并纯化的输入DNA和蛋白质结合DNA样品用水稀释至5 ng/µl，作为DNA模板。取2 µl DNA模板加入孔中。</li>
		<li>用超透明qPCR封板膜密封反应板，在离心机中以200 × g离心1分钟。将反应板放入实时qPCR仪中，使用配套的qPCR软件按以下程序循环：95 °C预变性1分钟，然后进行40个循环，每个循环为95 °C变性10秒、59 °C退火15秒、70 °C延伸35秒。</li>
		<li>同时设置三份含有引物的qPCR反应，用于扩增一个无关基因的上游区域（阴性对照）。</li>
		<li>计算 ΔCT 通过减去 CT 通过计算蛋白结合DNA中目标基因的富集倍数，即用蛋白结合DNA的Ct值与输入DNA的Ct值之差的2的幂次方来表示。计算公式为：2^(Ct_input - Ct_protein-bound)ΔCT. 
		注意：如果目标上游区域在蛋白结合的DNA中相较于输入的DNA出现富集，表明结合反应和亲和纯化成功，可进行步骤4。若未观察到目标上游区域的富集，则需使用不同量的蛋白重复结合反应（步骤3.1）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. DNA标记与芯片杂交
<ol>
	<li>用Cy3标记输入DNA，用Cy5标记富集DNA
	 注意：Cy3和Cy5染料对光敏感，操作时应尽量减少光照暴露。
	<ol>
		<li>将1 µg DNA与40 µl Cy3/Cy5标记的9聚体混合，加水调整体积至80 µl。</li>
		<li>在黑暗条件下，于98 °C加热变性10分钟（使用PCR仪）。冰上快速冷却2分钟。</li>
		<li>加入 2 µl Klenow 聚合酶（3’-5’-外切酶缺失）-，50,000 U/ml）、5 mM dNTPs 和 8 µl 水，充分混匀，在黑暗条件下于 37 °C 孵育 2 小时（使用 PCR 仪）。</li>
		<li>加入EDTA至终浓度50 mM以终止反应，并加入NaCl溶液至终浓度0.5 M。</li>
		<li>将样品转移至含有0.9倍体积异丙醇的1.5 ml离心管中，避光孵育10分钟，然后在12,000 × g离心10分钟。沉淀物若为Cy3标记的DNA应呈粉红色，若为Cy5标记的DNA应呈蓝色。</li>
		<li>用80%乙醇（500 µl）洗涤沉淀，于12,000 x g离心2 min。在避光条件下空气干燥沉淀5–10 min。 
		注意：沉淀物可在 -20 °C 下保存。</li>
		<li>将沉淀重悬于25 µl水中。通过分光光度法测定DNA浓度。</li>
		<li>将每份6 µg的Cy3和Cy5标记的DNA加入同一支1.5 ml离心管中，在避光条件下低温真空离心干燥（若离心机盖透明，需遮盖）。 
		注意：沉淀物可在 -20 °C 保存，直至进行杂交反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微阵列杂交
	<ol>
		<li>使用前3-4小时打开杂交系统，并将温度设置为42 °C。</li>
		<li>配制杂交溶液主混合液，使得1x溶液包含11.8 µl 2x杂交缓冲液、4.7 µl杂交组分A和0.5 µl比对寡核苷酸。</li>
		<li>将沉淀重悬于5 µl水中。取13 µl该混合液加入样品中。涡旋振荡15秒，在干浴仪中95 °C孵育5分钟。将样品置于杂交系统中42 °C保存，直至上样。</li>
		<li>根据制造商的说明书制备微阵列芯片-混样装置组件。</li>
		<li>将混匀滑片组件放入杂交系统中。向加样孔加入16 µl样品，用粘性膜密封各孔，在系统中开启混匀功能，于42 °C杂交16–20小时。</li>
		<li>将10倍浓度的商用缓冲液用水稀释，分别配制1倍浓度的洗涤缓冲液I（250 ml）、II（50 ml）和III（50 ml），并向每种缓冲液中加入DTT至终浓度为1 mM。将缓冲液I预热至42 °C。</li>
		<li>将混匀滑片插入拆卸工具中，放入盛有预热缓冲液I的培养皿内。用手剧烈摇动拆卸工具，同时将混匀滑片剥离。</li>
		<li>将载玻片放入含有50 ml 洗涤缓冲液I的容器中，手动剧烈振荡2分钟。</li>
		<li>将载玻片转移至第二个容器中，加入50 ml 洗涤缓冲液II，手动剧烈振摇1分钟。</li>
		<li>将载玻片转移至含有50 ml洗涤缓冲液III的第三个容器中，手动剧烈振荡15秒。</li>
		<li>用纸巾快速吸去载玻片边缘的液体，放入载玻片架中。以200 × g离心2分钟以干燥载玻片。将载玻片放入载玻片盒中，用铝箔包裹，并置于干燥器中保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扫描芯片阵列
	<ol>
		<li>根据仪器说明书将载玻片放入微阵列扫描仪中。</li>
		<li>使用扫描软件将波长设置为 532 nm = Cy3 和 635 nm = Cy5，初始光电倍增管增益设置在 350 至 400 之间。</li>
		<li>预览芯片以确定芯片上的阵列位置。选择用于扫描的阵列区域。</li>
		<li>扫描芯片阵列并调整光电倍增管设置，使阵列特征以黄色为主。直方图应显示红色和绿色曲线重叠或尽可能接近。两条曲线应在10以上结束-5 饱和时的标准化计数</li>
		<li>分别保存 532 和 635 nm 的图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>阵列数据分析
	<ol>
		<li>将图像导入阵列分析软件。使用该软件为每个阵列生成两个配对报告（.pair 文件）（分别对应 Cy3 和 Cy5 图像）。生成标准化的 log2使用配对文件生成比值文件。使用对数2使用500 bp的滑动窗口分析比值文件以搜索峰，将峰位点定位到基因靶标的上游区域。</li>
		<li>检查阳性靶标（通过EMSA确定并经qPCR验证，本示例中为DVU3025）是否出现在最高峰中。 
		注意：如果阳性目标未出现在排名靠前的命中结果中，则有可能该RR具有多个基因靶点，此时可进行重复的DAP-chip实验，并利用所有重复实验中共同的峰来生成靶点列表。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 结合位点基序预测与验证
<ol>
	<li>根据DAP-chip分析结果，获取前几位基因靶点上游区域（400 bp）的序列。通过Microbes Online平台（meme.nbcr.net）对这些序列进行MEME分析，以预测基序。 
	注意：增强子结合蛋白（如依赖sigma54的调控因子）可在起始位点上游数百个碱基对处结合。对于其他转录调控因子，较短的区域（如上游200 bp）通常已足够。</li>
	<li>设计包含预测结合位点基序的正链和反链DNA寡核苷酸，基序两侧各保留10个碱基。订购时使正链5’端生物素标记。</li>
	<li>将正链与反链寡核苷酸按1:1.5的比例混合，溶于10 mM Tris HCl（pH 8.0）、1 mM EDTA和50 mM NaCl溶液中，总体积为20 µl，置于PCR管内。在PCR仪中95 °C加热5分钟，随后缓慢冷却至25 °C。稀释10倍后，作为EMSA实验中的野生型双链DNA底物使用。</li>
	<li>采用与上述相同的方法制备修饰后的底物，但设计寡核苷酸时在结合基序的保守碱基中引入4–6个碱基替换。</li>
	<li>将反应体系中的RR蛋白与野生型或修饰后的底物进行结合反应，并按照步骤2所述方法通过EMSA进行检测。</li>
	<li>注意：若RR蛋白能结合野生型底物而不能结合修饰后的底物，则表明预测的基序得到验证。</li>
</ol>
6. 其他相关细菌物种中基序的保守性
<ol>
	<li>选择包含 DVU3023 直系同源基因的目标基因组。从 NCBI 网站获取这些基因组的序列和注释文件。</li>
	<li>使用 Perl 等编程语言编写脚本，利用 DAP-chip 目标中的基序序列构建位置加权矩阵，并使用该矩阵对其他测序基因组中存在的相似基序进行评分。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文所述的 DAP-chip 方法已成功用于确定中国台湾希氏脱硫弧菌（Desulfovibrio vulgaris Hildenborough）中多个响应调节蛋白（RR）的基因靶标7，其中一项结果在此作为代表性示例展示。对于 RR DVU3023，候选基因靶标的选取较为直接：DVU3025 位于 RR 基因的下游紧邻位置，且该 RR 基因与靶基因在多种脱硫弧菌（Desulfovibrio）物种中均保守存在，此外 DVU3025 还具有预测的 σ54 依赖型启动子。电泳迁移率变动分析（EMSA）提供了一种简便方法，可快速检测 RR 是否与候选靶基因结合，同时可用于评估纯化蛋白样品的活性，并确定蛋白-DNA 结合的最佳条件。
也可在存在和不存在乙酰磷酸的条件下检测DNA结合活性，以确定磷酸化是否为DNA结合所必需。并非所有响应调节蛋白（RR）都能被小分子供体磷酸化9，在这些情况下，如果条件允许，可使用纯化的同源传感器激酶来激活该蛋白。目前已发现一些非典型的RR，其接收结构域中缺乏关键的活性位点残基，因而无法...

细菌的存活与增殖能力在很大程度上取决于其感知环境变化并作出响应的能力，而这种能力又依赖于其信号转导系统。一种细菌所编码的信号系统数量被称为其“微生物智商”（microbial IQ），可反映其生存环境的多变性以及感知多种信号并精细调控响应的能力1。双组分信号转导系统（TCS）是细菌中最普遍的信号系统，由一个组氨酸激酶（HK）和一个效应响应调节蛋白（RR）组成：HK感知外界信号，并通过磷酸化将信号传递给效应RR2。RR可具有多种输出结构域，因而表现出不同的效应模式，但最常见的响应是通过DNA结合结构域实现的转录调控1。绝大多数TCS所感知的信号及其相应功能至今仍不清楚。
尽管染色质免疫沉淀结合芯片技术（ChIP-chip）等体内方法通常用于确定转录因子的基因组结合位点3，但这些方法仅在已知激活条件或信号的情况下才能用于细菌双组分系统中的反应调节子（RRs）。通常，激活双组分系统的环境信号比其靶基因更难确定。本文所述的基于体外微阵列的检测方法可有效且快速地确定双组分系统的靶基因并预测其功能。该检测方法利用了反应调节子可在体外通过乙酰磷酸等小分子供体进行磷酸化并从而被激活的特性4。
在本方法中，即DNA亲和纯化芯片法（DAP-chip，DNA-affinity-purified-chip）（图1），将目标RR基因与His标签一起在E. coli中克隆表达，并将纯化的带标签蛋白与剪切后的基因组DNA进行孵育。通过亲和纯化富集与蛋白结合的DNA，随后对富集的DNA和输入DNA（input DNA）进行扩增、荧光标记，混合后杂交至针对目标生物定制的平铺芯片（tiling array）上（图1）。由于微阵列实验易受技术假象影响，因此需采取额外步骤以优化检测。其中一个步骤是利用电泳迁移率变动分析（EMSA）确定该RR的单一靶标（参见 图2 中的工作流程）。接着，在蛋白与基因组DNA结合并完成DAP步骤后，通过qPCR检测蛋白结合DNA组分与输入组分中阳性靶标是否富集，从而验证RR结合条件的最优化（图2）。芯片杂交完成后，对数据进行分析，识别出信号强度较高的峰值区域，这些区域代表蛋白结合的基因组位点。根据所获得的靶基因，可对RR的功能进行预测。利用这些靶向的基因组位点预测结合位点基序，并通过EMSA实验进一步验证（图2）。随后，可通过在近缘物种基因组中扫描类似的结合基序，将该RR的功能预测和靶基因信息推广至编码正交RR（orthologous RRs）的物种（图2）。DAP-chip方法可为此前缺乏信息的双组分系统（TCS）提供大量功能数据。只要目标蛋白可被纯化且DNA结合条件可被确定，该方法亦适用于任何转录调控因子；同时，只要目标生物具有可用的基因组序列，该方法即可应用于任何感兴趣的生物体。
<img alt="Gene expression process diagram; E. coli, RR-His expression, Ni-NTA purification, DNA amplification." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. DNA亲和纯化芯片（DAP-chip）策略7目标生物的RR基因被克隆至带有羧基末端His标签的载体中 E. coli 表达菌株。纯化的His标签蛋白通过乙酰磷酸进行磷酸化激活，并与剪切后的基因组DNA混合。取部分结合反应产物作为输入DNA保存，其余部分则使用Ni-NTA树脂进行亲和纯化。输入DNA和RR结合的DNA分别进行全基因组扩增，并分别用Cy3和Cy5标记。标记后的DNA混合后杂交至平铺阵列芯片，随后分析以确定其基因靶标。图示经修改并重新印制，采用知识共享许可协议来源7.
<img alt="蛋白质-DNA 相互作用分析流程图；EMSA、qPCR 功能预测步骤。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 实验流程概要。 对于任何纯化的带标签蛋白，首先通过EMSA确定其靶标。使蛋白与基因组DNA结合，随后对富集的和输入的DNA进行DNA亲和纯化（DAP）和全基因组扩增（WGA）。若已知基因靶标，可使用qPCR确认该已知靶标在蛋白结合组分中是否富集。若无法确定靶标，则直接进行DNA标记和芯片杂交。若qPCR未检测到富集，则使用不同蛋白用量重复蛋白-gDNA结合及DAP-WGA步骤。利用芯片分析寻找峰值信号，并将其定位至靶基因。利用靶基因的上游区域预测结合位点基序。通过EMSA实验验证所预测的基序。利用该基序扫描研究中的RR同源物所在相关物种的基因组，预测这些物种中的靶基因。根据所获得的基因靶标，可进一步预测RR及其同源物的生理功能。本图经修改并重新印制，采用知识共享许可协议来自7。

<table><tbody><tr><td>HisTrapFF 柱（Ni-Sepharose 柱）</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td>17-5255-01</td><td></td></tr><tr><td>Akta explorer（FPLC 仪器）</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 脱盐柱</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td>17-5087-01</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick 凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的寡核苷酸</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>6% 聚丙烯酰胺-0.5x TBE 预制小型 DNA 迁移延迟凝胶</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td><td>EC63652BOX</td><td>也可自行灌制凝胶。</td></tr><tr><td>尼龙膜</td><td>EMD Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>INYC00010</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD 半干式电泳转移系统</td><td>Biorad, Hercules, CA, USA</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>加厚印迹纸，8 x 13.5 cm</td><td>Biorad, Hercules, CA, USA</td><td>170-3967</td><td></td></tr><tr><td>UV 交联仪 XL-1000 型</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-992-89</td><td></td></tr><tr><td>核酸化学发光检测试剂盒（Pierce）</td><td>Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA</td><td>89880</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 琼脂糖树脂</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>GenomePlex 全基因组扩增试剂盒（片段化缓冲液、文库制备缓冲液、文库稳定化溶液、文库制备酶、10x 扩增主混合液、WGA 聚合酶）</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>WGA2-50RXN</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop ND-1000</td><td>Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA</td><td>用于 DNA 定量</td><td></td></tr><tr><td>Perfecta Sybr Green SuperMix（含 ROX）</td><td>Quanta biosciences</td><td>95055-500</td><td>可使用任何 Sybr Green PCR 混合液</td></tr><tr><td>qPCR 用超透明热封膜（PlateMax）</td><td>Axygen</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>96 孔透明低矮 PCR 微孔板</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td><td>PCR-96-LP-AB-C</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems StepOne Plus 实时 PCR 系统</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td><td>4376600</td><td>可使用任何实时 PCR 系统</td></tr><tr><td>Qiaquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td><td>28104</td><td>可使用任何 PCR 纯化试剂盒</td></tr><tr><td>Cy3/Cy5 标记的九聚体</td><td>Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA</td><td>N46-0001, N46-0002</td><td></td></tr><tr><td>Klenow 聚合酶 50,000 U/ml，3'-5' 外切酶&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>M0212M</td><td></td></tr><tr><td>杂交系统</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td>该公司已不再生产芯片及相关产品，需使用 Agilent 或 Affymetrix 等替代来源。</td></tr><tr><td>定制打印的微阵列及混匀器</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>杂交试剂盒（2x 杂交缓冲液、杂交组分 A、定位寡核苷酸）</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>洗涤缓冲液试剂盒（10x 洗涤缓冲液 I、II、III，1 M DTT）</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4200A 微阵列扫描仪</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td><td>该型号已被更先进的型号取代</td><td></td></tr><tr><td>GenePix Pro 微阵列软件</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nimblescan v.2.4，ChIP-chip 分析软件</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

dna亲和纯化芯片（dap-chip）法用于确定细菌双组分调控系统的目标基因

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

体内 方法（如 ChIP-chip）是用于确定转录因子全局基因靶标的成熟技术。然而，在研究激活条件尚未明确的细菌双组分调控系统时，这些方法的应用受到限制。此类系统仅在特定信号存在下被激活后才调控转录。由于这些信号通常未知，本文视频文章中描述的基于 体外 微阵列的方法可用于确定应答调控因子的基因靶标及其结合位点。这种 DNA 亲和纯化芯片法可适用于任何具有测序基因组的生物中的任意纯化调控蛋白。该方案包括使纯化的带标签蛋白与剪切后的基因组 DNA 结合，随后亲和纯化蛋白结合的 DNA，再对 DNA 进行荧光标记并杂交至定制的平铺微阵列。本文还描述了可用于优化特定调控因子检测的前期步骤。通过微阵列数据分析产生的信号峰可用于预测结合位点基序，随后通过实验验证这些基序。这些基序预测还可用于确定近缘物种中同源应答调控因子的基因靶标。我们通过确定环境细菌 Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 中依赖 sigma54 的应答调控因子 DVU3023 的基因靶标和结合位点基序，进而预测其功能，展示了该方法的适用性。

上述方法已应用于确定模式硫酸盐还原菌 Desulfovibrio vulgaris Hildenborough7 中响应调节蛋白（RR）的全基因组靶基因。该生物含有大量双组分系统（TCS），其响应调节蛋白超过70种，表明其可感知并响应多种多样的信号。由于这些信号通路的信号分子及其激活条件尚不明确，因此难以在 体内 对其功能开展分析。本研究采用DAP-chip方法鉴定了代表性响应调节蛋白DVU3023的靶基因，从而预测其可能的生物学功能。
DVU3023 是一种依赖 sigma-54 的响应调节子（RR），其编码基因位于一个包含相应组氨酸激酶（HK）的操纵子中（图 3A）。在其C端添加了His标签的基因被克隆并在 E. coli 中表达并纯化。为初步确定其靶标，将纯化的RR用于检测其与下游十基因操纵子（DVU3025–3035）的结合能力，该操纵子包含乳酸摄取和氧化相关基因。RR DVU3023 能够迁移 DVU3025 上游区域（图 3B）...

本文视频介绍了一种基于体外微阵列的 in vitro 方法，用于确定双组分系统反应调节因子的基因靶标及其结合位点。

DNA亲和纯化芯片（DAP-chip）法用于确定细菌双组分调控系统的目标基因

体内方法（如 ChIP-chip）是已确立的技术，用于确定转录因子的全基因组靶基因。然而，它们具有……

以下实验的总体目标是利用基于体外微阵列的检测方法，确定细菌双组分反应调节因子的基因组结合位点。该目标通过克隆并纯化带有标签的反应调节因子蛋白，通过体外磷酸化激活该蛋白，并利用电泳迁移率变动分析确定一个基因靶标，作为后续微阵列步骤的阳性对照来实现。第二步中，将纯化的反应调节因子蛋白与剪切的基因组DNA混合，通过亲和纯化将蛋白结合的DNA与输入DNA分离。接下来，对蛋白质结合的DNA和输入DNA进行扩增，并通过定量PCR验证蛋白质结合组分中阳性对照基因靶标的富集情况，随后进行荧光标记、混合，并杂交至覆盖全基因组的平铺微阵列。为了确定该反应调节因子的基因组结合位点，实验结果可显示最可能受该反应调节因子调控的基因，且结果可通过电泳迁移率变动实验进一步验证。该技术相较于其他方法（如体内芯片-芯片技术）的主要优势在于，即使对于双组分系统，其激活信号和作用条件尚不明确时，该方法仍可应用。该方法对细菌信号传导领域具有重要意义，因为绝大多数反应调节因子的基因靶标尚不明确，而该方法有助于揭示复杂的调控网络。在开始此实验步骤之前，将由本实验室的研究助理 Amy Chen 演示该操作流程。纯化一种rr，即从克隆的DVU 3 0 2 3基因混合物中表达的DVU 3 0 2 3蛋白。在缓冲溶液中，将0.5皮摩尔的DVU 3 0 2 3蛋白与100飞摩尔先前制备的经末端标记的DNA底物混合，总体积为20微升。设置一组不含任何蛋白的反应作为对照，随后将所有反应在室温下于实验台孵育20分钟。孵育结束后，向结合反应体系中加入5微升5×上样缓冲液。将每个反应体系中的18微升样品上样至预先制备的微型6%聚丙烯酰胺0.5×TBE凝胶中，在100伏电压下电泳2小时。电泳完成后，将带电尼龙膜剪裁至与凝胶相同大小，并在0.5×TBE缓冲液中浸泡至少10分钟。随后将凝胶从凝胶夹中取出。切去凝胶上的任何突起部分，将凝胶和膜夹在两层浸透0.5 XTBE的厚滤纸之间。将凝胶和膜放入半干转印装置中，在20伏电压下运行30分钟。随后，将膜放入商用紫外光交联仪中，在使用化学发光检测试剂盒显影后，设定交联时间为三分钟，并使用连接至配备CCD相机的计算机的成像系统进行成像。观察在存在RR的情况下DNA底物迁移率是否发生改变，这表明RR结合了被检测的DNA。接下来，将两到三微克的共享基因组DNA与0.5皮摩尔的DVU 3 0 2 3在缓冲溶液中混合。在25摄氏度下孵育反应30分钟后，取10微升反应液转移至一个1.5毫升离心管中，并标记为输入DNA。向一个0.6毫升的微量离心管中加入30微升镍NTA亲和树脂。将样品在100 ×g条件下离心1分钟，使树脂沉降到管底。离心后，弃去上清液。加入100 µL洗涤缓冲液，轻弹管壁以混匀内容物。离心后，以100 ×g离心两分钟，弃去上清液。将结合反应中剩余的90 µL加入镍-NTA树脂的洗涤液中。然后将样品在旋转摇床中孵育30分钟。孵育结束后，以100 ×g离心2分钟。弃去上清液后，重复洗涤步骤3次。向树脂中加入35微升洗脱缓冲液，通过涡旋振荡混匀。将样品在室温下于实验台上孵育5分钟。离心样品后，将上清液转移至新的1.5毫升离心管中，并标记为蛋白结合的DNA组分。随后，在输入DNA及其与蛋白质结合的DNA组分纯化后，向输入DNA中加入35微升洗脱缓冲液。将各10微升分别加入不同的PCR管中。然后向每个样本中加入1微升10×片段化缓冲液、2微升文库制备缓冲液和1微升文库稳定化溶液，充分涡旋混匀样本。将样品在95摄氏度的热循环仪中孵育两分钟。完成后，将样品置于冰上冷却。接着，向样品中加入1 µL文库制备酶，并通过移液混匀内容物。将样品放入热循环仪中孵育。孵育结束后，向每个试管中加入47.5 µL水、7.5 µL 10×扩增主混合液和5 µL聚合酶。样品混合后，将其置于热循环仪中加热。为每种DNA模板设置三个重复的QPCR反应，首先为先前设计的每对引物配制一份1倍浓度的预混液，然后向96孔PCR板的每个孔中分装18微升预混液。将扩增并纯化的输入DNA样本和蛋白结合DNA样本用水稀释至5纳克/微升，并向每个孔中加入2微升各样本。随后，使用UltraClear QPCR封板膜密封反应板。在离心机中以200 ×g离心微孔板1分钟。将微孔板放入实时定量PCR仪中运行循环，使用以下条件：用S3标记输入DNA，用SCI-5标记富集后的DNA。将1微克DNA与40微升S3 SCI-FI标记的9碱基寡核苷酸混合，并加水调整总体积至80微升。在热循环仪中于98摄氏度避光变性处理10分钟。完成后立即将样品置于冰上快速冷却两分钟，然后向每个反应体系中加入2 µL 3'→5'外切聚合酶、5 mM脱氧核苷三磷酸以及8 µL水。混匀后，在避光条件下于37°C的PCR仪中孵育反应体系2小时。此时，加入EDTA至终浓度50 mM以终止反应，并加入氯化钠溶液至终浓度0.5 M。然后，在避光条件下孵育10分钟后，转移至含有0.9倍体积异丙醇的1.5毫升离心管中。在12,000 ×g条件下离心10分钟。取S3和sci-fi标记的DNA各6 µg，于1.5毫升离心管中混合，并在避光条件下低温真空干燥，若离心机盖透明，需将其覆盖。待沉淀干燥后，将其悬浮于5 µL水中。随后，将13 µL预先配制好的1×杂交溶液主混合液加入样品中，涡旋15秒，于干浴仪中95 °C孵育5分钟。将样品从干浴仪中取出后，置于42 °C的杂交系统中，直至准备上样。接下来，将先前准备好的混样玻片组件放入杂交系统中。向加样口加入16 µL样品，然后用粘性膜密封加样口，并启动系统中的混匀程序。在42 °C下杂交16至20小时后。将混匀器滑入拆卸工具中，并将其放入盛有温热缓冲液1的培养皿中。一边剧烈振荡拆卸工具，一边将混匀器剥离。将玻片放入含有50毫升洗涤缓冲液1的容器中，剧烈振荡清洗两分钟。然后用50毫升洗涤缓冲液二和50毫升洗涤缓冲液三重复之前的步骤。RRR DVU 3 0 2 3发生位移。QPCR检测DVU 3 0 2 5的上游区域显示，与输入的DNA相比，DVU 3 0 2 5上游区域在蛋白质结合组分中富集，表明DVU 3 0 2 3的结合条件合适。DVU 0 0 1 3作为阴性对照。DAP-chip分析后获得的前四个峰被选为DVU 3 0 2 3最可能的靶标。阳性靶标 DVU 3 0 2 5 是获得的首个峰值，且得分最高。另外两个基因靶标均为其他编码的乳酸透性酶。第四个基因靶标不位于上游区域，而是位于两个反向转录基因之间的基因间区域。使用 DAP-chip MEME 获得的靶标上游区域来预测结合位点基序。通过替换该基序中保守碱基进一步验证了该基序，结果消除了结合迁移现象。利用已验证的基序扫描其他硫酸盐还原菌基因组，当在开放阅读框上游区域检测到该基序时，选择含有DVU 3 0 2 3同源基因位点的区域作为潜在的基因靶标，基序序列依据自体rs预测结果确定。由此生成了一个共识结合位点基序，其序列与Divo Garris Hilton Burrow的基序高度相似。观看本视频后，您应能充分理解如何使用 Daptive 方法确定调控蛋白的基因靶标。只要能够纯化该蛋白并已知基因组序列，此方法即可用于分析任何调控蛋白的结合片段大小。

dna-affinity-purified-chip-dap-chip-method-to-determine-gene-targets

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生物学

DNA的亲和纯化的芯片（DAP芯片）方法来确定目标基因的细菌双组分调控系统

本文介绍了一种染色质免疫沉淀（ChIP）实验流程，用于对在组蛋白结合结构域上存在差异的蛋白质亚型进行全基因组定位分析。我们将其应用于ChIP-Seq分析，以鉴定KDM5A/JARID1A/RBP2组蛋白去甲基化酶的作用靶点。...

使用染色质免疫共沉淀进行全基因组分析以鉴定亚型特异性基因靶点

本视频演示了一种 体内 在细菌中进行的用于研究RNA结合蛋白（RBPs）与RNA相互作用的检测。将两种质粒构建体转化至细菌细胞中——一种为结合位点质粒，编码在RBP结合位点下游含有荧光报告基因的mRNA；另一种为RBP质粒，在诱导剂调控下表达RBP蛋白。当通过诱导剂增加RBP的表达时，RBP结合到mRNA上，导致报告基因的翻译受到抑制 通过...

研究目的基因翻译调控的报告基因抑制实验

本视频展示了一种利用抗体微阵列芯片检测环境样品中蓝细菌菌株的方法。含有多种细菌的样品与固定在芯片上的抗体发生相互作用，通过荧光标记的抗蓝细菌菌株抗体进行免疫染色，可在不同位点观察到特异性荧光信号，从而揭示特定蓝细菌菌株的存在。...

一种利用抗体微阵列芯片检测蓝细菌菌株的技术

我们开发了一种用于快速抗生素药敏试验的微流控平台。液体以高速流过固定在微流控通道底部的细菌。在压力和抗生素存在的情况下，敏感菌株的细菌会迅速死亡。然而，耐药细菌则能够在这些应激条件下存活。...

芯片上应激诱导的抗生素敏感性测试

本文介绍了一种将DNA腺嘌呤甲基转移酶鉴定技术（DamID）与高通量测序相结合的检测方法（DamID-seq）。该改进方法具有更高的分辨率和更宽的动态范围，可实现DamID-seq数据与其他高通量测序数据（如ChIP-seq、RNA-seq）的联合分析。...

DamID-seq：通过高通量测序腺嘌呤甲基化DNA片段实现全基因组蛋白质-DNA相互作用作图

我们提出了一种用于识别影响转录因子（TF）DNA结合的非编码遗传变异的策略性方案和实验流程。本文提供了针对基因型依赖性转录因子DNA结合的电泳迁移率变动分析（EMSA）和DNA亲和沉淀分析（DAPA）的详细实验方案。...

利用电泳迁移率变动分析（EMSA）和DNA亲和沉淀分析（DAPA）筛选功能性非编码遗传变异

慢性淋巴细胞白血病（CLL）是西方世界最常见的白血病类型。NFAT转录因子在多种细胞类型的发育和活化过程中发挥重要的调控作用。本文介绍了一种在人类CLL细胞中应用染色质免疫沉淀（ChIP）技术的实验方案，用于鉴定NFAT2的新型靶基因。...

一种染色质免疫沉淀实验用于鉴定慢性淋巴细胞白血病中新的NFAT2靶基因

本方法通过一种简单的活体报告基因检测法，在细菌细胞中定量分析RNA结合蛋白（RBPs）与其同源及非同源结合位点的结合亲和力。该检测基于报告基因的表达抑制作用。...

一种用于定量细菌中蛋白质-RNA 结合的检测方法

染色质免疫沉淀结合高通量测序（ChIP-seq）是一种用于确定转录因子与其调控的基因组序列之间相互作用的方法。本实验方案以鼠伤寒沙门菌（Salmonella...

发现CsgD调控靶点 沙门氏菌 使用染色质免疫沉淀和高通量测序（ChIP-seq）研究生物膜

利用ORFeome文库，差异径向毛细管配体结合分析法（DRaCALA）可用于鉴定生物体中的小分子配体结合蛋白。...

利用配体差异径向毛细管作用分析法（DRaCALA）鉴定小分子配体的结合蛋白

基于脱氧核酶的纳米机器可用于核酸的高选择性和高灵敏度检测。本文以EB病毒片段的检测为例，详细描述了利用免费软件设计含有10-23核心的脱氧核酶纳米机器的实验方案及其应用。...

基于DNAzyme 10-23的核酸识别纳米机器

学习使用DNA亲和纯化芯片（DAP芯片）方法鉴定细菌双组分调控系统的靶基因。该方法通过体外微阵列技术确定反应调节蛋白的基因组结合位点，无需已知激活信号即可分析基因调控网络。

DNA亲和纯化芯片（DAP-chip）法用于确定细菌双组分调控系统的目标基因

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