DNA亲和纯化芯片（DAP-chip）法用于确定细菌双组分调控系统的目标基因

以下实验的总体目标是利用基于体外微阵列的检测方法，确定细菌双组分反应调节因子的基因组结合位点。该目标通过克隆并纯化带有标签的反应调节因子蛋白，通过体外磷酸化激活该蛋白，并利用电泳迁移率变动分析确定一个基因靶标，作为后续微阵列步骤的阳性对照来实现。第二步中，将纯化的反应调节因子蛋白与剪切的基因组DNA混合，通过亲和纯化将蛋白结合的DNA与输入DNA分离。

接下来，对蛋白质结合的DNA和输入DNA进行扩增，并通过定量PCR验证蛋白质结合组分中阳性对照基因靶标的富集情况，随后进行荧光标记、混合，并杂交至覆盖全基因组的平铺微阵列。为了确定该反应调节因子的基因组结合位点，实验结果可显示最可能受该反应调节因子调控的基因，且结果可通过电泳迁移率变动实验进一步验证。该技术相较于其他方法（如体内芯片-芯片技术）的主要优势在于，即使对于双组分系统，其激活信号和作用条件尚不明确时，该方法仍可应用。

该方法对细菌信号传导领域具有重要意义，因为绝大多数反应调节因子的基因靶标尚不明确，而该方法有助于揭示复杂的调控网络。在开始此实验步骤之前，将由本实验室的研究助理 Amy Chen 演示该操作流程。

纯化一种rr，即从克隆的DVU 3 0 2 3基因混合物中表达的DVU 3 0 2 3蛋白。在缓冲溶液中，将0.5皮摩尔的DVU 3 0 2 3蛋白与100飞摩尔先前制备的经末端标记的DNA底物混合，总体积为20微升。设置一组不含任何蛋白的反应作为对照，随后将所有反应在室温下于实验台孵育20分钟。

孵育结束后，向结合反应体系中加入5微升5×上样缓冲液。将每个反应体系中的18微升样品上样至预先制备的微型6%聚丙烯酰胺0.5×TBE凝胶中，在100伏电压下电泳2小时。电泳完成后，将带电尼龙膜剪裁至与凝胶相同大小，并在0.5×TBE缓冲液中浸泡至少10分钟。随后将凝胶从凝胶夹中取出。

切去凝胶上的任何突起部分，将凝胶和膜夹在两层浸透0.5 XTBE的厚滤纸之间。将凝胶和膜放入半干转印装置中，在20伏电压下运行30分钟。随后，将膜放入商用紫外光交联仪中，在使用化学发光检测试剂盒显影后，设定交联时间为三分钟，并使用连接至配备CCD相机的计算机的成像系统进行成像。

观察在存在RR的情况下DNA底物迁移率是否发生改变，这表明RR结合了被检测的DNA。接下来，将两到三微克的共享基因组DNA与0.5皮摩尔的DVU 3 0 2 3在缓冲溶液中混合。在25摄氏度下孵育反应30分钟后，取10微升反应液转移至一个1.5毫升离心管中，并标记为输入DNA。

向一个0.6毫升的微量离心管中加入30微升镍NTA亲和树脂。将样品在100 ×g条件下离心1分钟，使树脂沉降到管底。离心后，弃去上清液。

加入100 µL洗涤缓冲液，轻弹管壁以混匀内容物。离心后，以100 ×g离心两分钟，弃去上清液。将结合反应中剩余的90 µL加入镍-NTA树脂的洗涤液中。

然后将样品在旋转摇床中孵育30分钟。孵育结束后，以100 ×g离心2分钟。弃去上清液后，重复洗涤步骤3次。

向树脂中加入35微升洗脱缓冲液，通过涡旋振荡混匀。将样品在室温下于实验台上孵育5分钟。离心样品后，将上清液转移至新的1.5毫升离心管中，并标记为蛋白结合的DNA组分。

随后，在输入DNA及其与蛋白质结合的DNA组分纯化后，向输入DNA中加入35微升洗脱缓冲液。将各10微升分别加入不同的PCR管中。然后向每个样本中加入1微升10×片段化缓冲液、2微升文库制备缓冲液和1微升文库稳定化溶液，充分涡旋混匀样本。

将样品在95摄氏度的热循环仪中孵育两分钟。完成后，将样品置于冰上冷却。接着，向样品中加入1 µL文库制备酶，并通过移液混匀内容物。

将样品放入热循环仪中孵育。孵育结束后，向每个试管中加入47.5 µL水、7.5 µL 10×扩增主混合液和5 µL聚合酶。样品混合后，将其置于热循环仪中加热。

为每种DNA模板设置三个重复的QPCR反应，首先为先前设计的每对引物配制一份1倍浓度的预混液，然后向96孔PCR板的每个孔中分装18微升预混液。将扩增并纯化的输入DNA样本和蛋白结合DNA样本用水稀释至5纳克/微升，并向每个孔中加入2微升各样本。随后，使用UltraClear QPCR封板膜密封反应板。

在离心机中以200 ×g离心微孔板1分钟。将微孔板放入实时定量PCR仪中运行循环，使用以下条件：用S3标记输入DNA，用SCI-5标记富集后的DNA。将1微克DNA与40微升S3 SCI-FI标记的9碱基寡核苷酸混合，并加水调整总体积至80微升。在热循环仪中于98摄氏度避光变性处理10分钟。

完成后立即将样品置于冰上快速冷却两分钟，然后向每个反应体系中加入2 µL 3'→5'外切聚合酶、5 mM脱氧核苷三磷酸以及8 µL水。混匀后，在避光条件下于37°C的PCR仪中孵育反应体系2小时。此时，加入EDTA至终浓度50 mM以终止反应，并加入氯化钠溶液至终浓度0.5 M。

然后，在避光条件下孵育10分钟后，转移至含有0.9倍体积异丙醇的1.5毫升离心管中。在12,000 ×g条件下离心10分钟。取S3和sci-fi标记的DNA各6 µg，于1.5毫升离心管中混合，并在避光条件下低温真空干燥，若离心机盖透明，需将其覆盖。

待沉淀干燥后，将其悬浮于5 µL水中。随后，将13 µL预先配制好的1×杂交溶液主混合液加入样品中，涡旋15秒，于干浴仪中95 °C孵育5分钟。将样品从干浴仪中取出后，置于42 °C的杂交系统中，直至准备上样。

接下来，将先前准备好的混样玻片组件放入杂交系统中。向加样口加入16 µL样品，然后用粘性膜密封加样口，并启动系统中的混匀程序。在42 °C下杂交16至20小时后。

将混匀器滑入拆卸工具中，并将其放入盛有温热缓冲液1的培养皿中。一边剧烈振荡拆卸工具，一边将混匀器剥离。将玻片放入含有50毫升洗涤缓冲液1的容器中，剧烈振荡清洗两分钟。

然后用50毫升洗涤缓冲液二和50毫升洗涤缓冲液三重复之前的步骤。RRR DVU 3 0 2 3发生位移。QPCR检测DVU 3 0 2 5的上游区域显示，与输入的DNA相比，DVU 3 0 2 5上游区域在蛋白质结合组分中富集，表明DVU 3 0 2 3的结合条件合适。DVU 0 0 1 3作为阴性对照。DAP-chip分析后获得的前四个峰被选为DVU 3 0 2 3最可能的靶标。

阳性靶标 DVU 3 0 2 5 是获得的首个峰值，且得分最高。另外两个基因靶标均为其他编码的乳酸透性酶。第四个基因靶标不位于上游区域，而是位于两个反向转录基因之间的基因间区域。使用 DAP-chip MEME 获得的靶标上游区域来预测结合位点基序。

通过替换该基序中保守碱基进一步验证了该基序，结果消除了结合迁移现象。利用已验证的基序扫描其他硫酸盐还原菌基因组，当在开放阅读框上游区域检测到该基序时，选择含有DVU 3 0 2 3同源基因位点的区域作为潜在的基因靶标，基序序列依据自体rs预测结果确定。由此生成了一个共识结合位点基序，其序列与Divo Garris Hilton Burrow的基序高度相似。

观看本视频后，您应能充分理解如何使用 Daptive 方法确定调控蛋白的基因靶标。只要能够纯化该蛋白并已知基因组序列，此方法即可用于分析任何调控蛋白的结合片段大小。