Name: 尾部皮肤来研究异基因CD4 + T细胞应答的小鼠移植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: 学习小鼠尾部皮肤移植技术，用于研究异基因CD4阳性T细胞介导的排斥反应与免疫耐受机制。该方法创伤小，可在不牺牲受体小鼠的情况下长期监测移植物状态，为移植免疫学提供可靠的实验模型。

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本工作由瑞士国家科学基金会（SNF）资助，资助项目编号为 PPOOA-_119204 和 PPOOP3_144918（授予 S.W.R.）。我们感谢 E. Palmer 和 B.T.H. Hausmann 提供小鼠及技术指导。

在本视频出版物和实验方案中，所有动物实验均按照瑞士巴塞尔城市州州立当局批准的动物实验方案进行。在可能的情况下，所有操作均应在无菌条件下进行。
1. 手术准备
<ol>
	<li>使用前对所有手术器械和纱布进行高压灭菌。</li>
	<li>加热保温垫，并将手术器械按顺序摆放在桌面上（材料与方法表）。</li>
	<li>打开指套式绷带。用棉签将凡士林涂抹于伤口敷料垫上（确保纱布完全被覆盖）。</li>
	<li>称量小鼠体重，并按0.05 mg/kg体重剂量给予镇痛药布托啡诺。注意：此剂量可在移植后立即提供镇痛作用。</li>
</ol>
2. 移植用尾部皮肤的制备
<ol>
	<li>安乐死处理供体小鼠（例如， I-Abm12每 CO 的 )2 窒息后，在切除前用消毒液对尾部进行消毒。</li>
	<li>将尾部黑色条纹朝下置于洁净的塑料板上，沿中线纵向切开，仅切及皮肤层，形成浅表切口。</li>
	<li>使用持针器从尾部剥离皮肤。</li>
	<li>将尾部皮肤放入盛有10 ml HBSS的10 cm细胞培养皿中。</li>
</ol>
3. 手术步骤
<ol>
	<li>将受体小鼠（例如 C57BL/6）置于透明诱导箱中，通过吸入3%异氟烷溶液进行麻醉。注意：小鼠通常需要3–5分钟达到手术麻醉深度。麻醉期间使用兽用眼膏涂抹眼睛，以防角膜干燥。</li>
	<li>将小鼠放置于加热垫上，通过面罩给予1.5%异氟烷，并通过夹捏脚趾评估每只动物的反射反应。</li>
	<li>剃除受体小鼠（例如 C57BL/6）背部的毛发，并用干燥纱布擦拭去除残留毛发。</li>
	<li>用无菌消毒液对剃毛后的移植部位进行消毒。</li>
	<li>用镊子夹住背部中/右侧皮肤，使用弯剪剪出约1 cm × 0.6 cm的圆形切口。</li>
	<li>若出现出血，用无菌棉签清洁伤口。</li>
	<li>评估切口大小，使用手术刀从尾部皮肤上切下与之大小相近的移植物。</li>
	<li>修剪移植物的角部使其呈圆形。</li>
	<li>将移植物置于手术刀上，用无菌棉签吸去多余的HBSS液体，然后将其放置于受体小鼠的移植床内。</li>
	<li>避免供体皮肤与宿主皮肤重叠，仅在接触区域涂抹组织粘合剂。</li>
	<li>在小鼠腰部周围贴上无皱褶的敷料胶带。</li>
	<li>使用粘性非弹性绷带将敷料固定在小鼠身上（偏移3 mm）。</li>
	<li>用剪刀在绷带上部腹侧剪开约3 mm的切口。注意：此举可防止小鼠在恢复过程中咬住绷带。</li>
	<li>移除麻醉面罩，将移植后的小鼠保留在加热垫上直至完全苏醒。</li>
	<li>仅当小鼠完全恢复后将其放回笼中，并检查其活动能力，确保绷带未绑得过紧。</li>
	<li>在进行下一台手术前，使用70%乙醇对所有手术器械进行灭菌处理。</li>
</ol>
4. 术后护理
<ol>
	<li>将含对乙酰氨基酚的糖浆加入饮水中（4 mg/ml），持续给药7天。</li>
	<li>小鼠恢复后，将其送回动物房。</li>
	<li>在敷料保留期间（1周），密切监测小鼠的临床症状，包括精神沉郁或其他行为改变（进食减少或活动减少）、外观异常（缺乏理毛行为）或姿势异常（毛发竖立或弓背姿势）。</li>
</ol>
5. 移除绷带（移植后6-7天）
<ol>
	<li>在透明诱导箱中通过吸入3%异氟烷溶液对小鼠进行麻醉（见上文）。</li>
	<li>使用动脉剪剪开绷带和石膏，并小心移除。注意：避免拉伸移植部位。</li>
	<li>监测移植小鼠的临床症状（见4.3），并对皮肤移植物排斥反应进行评分（表1）。注意：移植物评分系统利用尾部皮肤与背部皮肤之间毛发质地的差异。移植部位的外观及其排斥情况分为3个等级。C57BL/6免疫功能正常小鼠的同种异体皮肤（MHC II不匹配，例如 I-Abm12）移植物通常在移植后12–15天内被排斥（本实验室数据及15–20）。</li>
</ol>

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<li>Rosenberg, A. S., Finbloom, D. S., Maniero, T. G., Vander Meide, P. H., Singer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+prolongation+of+MHC+class+II+disparate+skin+allografts+by+in+vivo+administration+of+anti-IFN-gamma+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Specific prolongation of MHC class II disparate skin allografts by in vivo administration of anti-IFN-gamma monoclonal antibody.</a> Journal of immunology. 144 (12), 4648-4650 (1950).</li>
<li>Goes, N., Sims, T., Urmson, J., Vincent, D., Ramassar, V., Halloran, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbed+MHC+regulation+in+the+IFN-gamma+knockout+mouse.+Evidence+for+three+states+of+MHC+expression+with+distinct+roles+for+IFN-gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Disturbed MHC regulation in the IFN-gamma knockout mouse. Evidence for three states of MHC expression with distinct roles for IFN-gamma.</a> Journal of immunology. 155 (10), 4559-4566 (1995).</li>
<li>Surquin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-4+deficiency+prevents+eosinophilic+rejection+and+uncovers+a+role+for+neutrophils+in+the+rejection+of+MHC+class+II+disparate+skin+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">IL-4 deficiency prevents eosinophilic rejection and uncovers a role for neutrophils in the rejection of MHC class II disparate skin grafts.</a> Transplantation. 80 (10), 1485-1492 (2005).</li>
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<li>Bose, A., Inoue, Y., Kokko, K. E., Lakkis, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+perforin+down-regulates+CD4+and+CD8+T+cell-mediated+immune+responses+to+a+transplanted+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: perforin down-regulates CD4 and CD8 T cell-mediated immune responses to a transplanted organ.</a> Journal of immunology. 170 (4), 1611-1614 (2003).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

皮肤移植是一种广泛用于研究T细胞依赖性排斥反应和耐受性的方法。自从建立皮肤移植模型以来，已对其进行了多种改进和调整。在本描述的实验操作中，采用麻醉气体（异氟烷）进行I-Abm12尾部皮肤移植。使用气体麻醉可缩短操作时间和小鼠恢复时间，从而减少移植小鼠所受的应激。该操作使用组织粘合剂固定尾部皮肤，因为尾部皮肤比耳部或背部皮肤更容易卷曲。此外，在切割和修整边缘前，应先将尾部皮肤展平，这有助于减少卷曲，并改善尾部皮肤在背部切除部位的贴合位置。
为了评估移植物的排斥或接受情况，需要准备带有黑色条纹的尾部皮肤例如， 在移植物中央区域利用C57BL/6小鼠的毛发质地差异，便于根据毛发质地的不同对移植结果进行评分。
MHC II类分子I-Abm12的突变仅能在免疫功能正常和免疫缺陷的小鼠（相同遗传背景）中特异性激活CD4+ T细胞。这一特性一方面有助于实验结果的解读，但另一方面也限制了该方法仅适用于CD4+ T细胞的研究。为了将T细胞激...

皮肤、心脏和肾脏等实体器官的移植如今已成为全球医疗实践中的常规手术1。成功移植的器官可能因受体免疫系统的激活而被排斥，该系统可识别供体的主要组织相容性抗原。因此，移植患者需要接受免疫抑制药物治疗2。小鼠同种异体皮肤移植模型由Medawar及其同事于1955年建立，该模型有助于后续鉴定出被称为主要组织相容性复合体（MHC）I类和II类的靶分子。自那时起，皮肤移植模型不断被改进和调整，用于研究T细胞亚群的作用，以及化学和生物干预在抑制移植物排斥反应中的意义2-4。耳部和躯干皮肤的制备较为困难，且比尾部皮肤更易发生缺氧和坏死5；然而，其移植操作过程相似。此外，由于尾部皮肤具有特征性的毛发质地，其移植物的监测更为简便。
本文提供了一种详细的MHC II类错配尾部皮肤移植操作流程，可用于研究小鼠中由CD4+ T细胞介导的同种异体移植物排斥与耐受的不同方面。MHC II类分子I-Ab中存在的天然三点突变（称为I-Abm12）6-9足以在C57BL/6小鼠中诱导皮肤同种异体移植物的排斥反应8。I-Abm12分子可激活来自C57BL/6小鼠的多种αβ-T细胞受体（TcR）链的CD4+ T细胞，其中已鉴定出Vα2Vβ8-TcR特异性T细胞，用于构建TcR转基因小鼠10。通过过继转移Vα2Vβ8-TcR特异性T细胞，已在接受I-Abm12皮肤移植的免疫缺陷型C57BL/6 Rag2-/-小鼠中建立了排斥模型。
供体与受体之间的遗传差异会影响移植接受与排斥的结果。移植类型包括：自体移植，即来自受体个体自身的移植；同系移植和同种异体移植，分别指来自遗传上完全相同个体和遗传上无关个体的移植。通过化学和生物干预，已在患者和小鼠模型中实现了不同同种异体器官移植的接受11,3,4。在一项基础研究中，经抗CD3抗体处理的C57BL/6小鼠表现出I-Abm12尾部皮肤移植物的长期存活（未发表数据）。在受体小鼠移植前耗竭CD4+和CD8+T细胞，可导致MHC I类和II类不匹配移植物的接受（综述见12）。有趣的是，皮肤移植物的排斥依赖于CD4+T细胞的存在（综述见12）。在此模型中，通过抗体阻断共刺激分子或调节性T细胞抑制，靶向不同免疫细胞间的特异性相互作用，可能诱导耐受（未发表数据）。事实上，同时阻断CD40和CD28可诱导长期的皮肤同种异体移植物耐受13,14。
与其它器官移植相比，尾部皮肤移植操作简便且易于监测。此外，尾部皮肤移植物易于制备，且比其他皮肤组织更不易发生缺血。与注射麻醉剂相比，移植过程中使用麻醉气体（异氟烷）可缩短手术时间及受体恢复时间。通过使用组织粘合剂可防止尾部皮肤移植物卷曲，从而避免因卷曲导致的伤口愈合不全和移植物排斥。此外，I-Abm12 尾部皮肤移植模型可在遗传背景相同、免疫功能正常或免疫缺陷的小鼠中特异性激活 CD4+ T 细胞，有助于实验结果的解读。
本方案描述了一种可靠、可重复且易于监测的小鼠模型，可用于化学和生物学干预。该模型旨在研究尾部皮肤移植的排斥反应与耐受诱导。

<table><tbody><tr><td>聚维酮碘标准溶液</td><td>Mundipharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>31025060</td><td></td></tr><tr><td>Dafalgan，UPSA</td><td>Bristol Myers Squibb UPSA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>汉莎创可贴指套型</td><td>Beierdorf AG</td><td>REF.76861</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl 组织粘合剂</td><td>Braun</td><td>REF.1050052</td><td></td></tr><tr><td>Leukotape 经典型胶带，2 cm × 10 m</td><td>BSN Medical SAS</td><td>REF.02204-00</td><td></td></tr><tr><td>PBS，磷酸盐缓冲液，pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>10010015</td><td>GIBCO</td></tr><tr><td>无菌纱布，5 × 5 cm，8 层</td><td>MaiMed GmbH</td><td>21010</td><td></td></tr><tr><td>细齿镊</td><td>FST</td><td>11003-12</td><td></td></tr><tr><td>弯头精细虹膜剪</td><td>FST</td><td>14095-11</td><td></td></tr><tr><td>直头精细虹膜剪</td><td>FST</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>梅奥剪</td><td>FST</td><td>14010-15</td><td></td></tr><tr><td>动脉剪球头型，11.5 cm</td><td>FST</td><td>14080-11</td><td></td></tr><tr><td>组织镊</td><td>FST</td><td>11021-14</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片，20 号</td><td>Swann-Morton LTD</td><td>3006</td><td>碳钢</td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>Swann-Morton LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射器，1 ml</td><td>ARTSANA</td><td></td><td>一次性使用</td></tr><tr><td>Temgesic，丁丙诺啡</td><td>ESSEX Chemie AG</td><td></td><td>0.3 mg/ml</td></tr><tr><td>组织培养皿，10 cm，60.1 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>TPP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>凡士林</td><td>Vifor SA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>保温垫</td><td>Solis</td><td></td><td>型号 223</td></tr></tbody></table>

小鼠尾部皮肤移植以研究同种异体cd4 t细胞应答

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

研究T细胞应答及其在异体抗原识别过程中的后果，需要一种能够区分供体与宿主T细胞、便于监测移植物，并可根据不同免疫学问题进行调整的模型。Medawar及其同事于1955年建立了小鼠同种异体尾部皮肤移植模型。自此以后，该皮肤移植模型被不断改进和调整，以回答特定的免疫学问题。采用尾部皮肤使该模型易于评估移植物排斥反应，无需复杂准备或深度麻醉，适用于所有遗传背景的动物，可减少缺血性坏死的发生，并允许进行化学和生物学干预。
通常，CD4+ 和 CD8+ 同种异体T细胞均可介导同种异体移植物的排斥反应，因为它们能够识别来自不同小鼠品系的主要组织相容性抗原的不匹配。已有多个模型用于在皮肤移植小鼠中激活同种异体T细胞。鉴定包括C57BL/6小鼠在内的不同小鼠品系中的主要组织相容性复合物（MHC）I类和II类分子，是理解与研究T细胞介导的同种异体反应的重要步骤。在本处描述的尾部皮肤移植模型中，MHC II类分子（I-Ab）抗原呈递槽中的一个三点突变（I-Abm12）足以在C57BL/6小鼠中诱导强烈的同种异体CD4+ T细胞活化。来自I-Abm12小鼠的皮肤移植物在C57BL/6小鼠体内会在12–15天内被排斥，而同基因型移植物则可被接受长达100天。T细胞缺失的小鼠（CD3-/- 和 Rag2-/- 小鼠）可使皮肤移植物存活长达100天，但通过过继转移2 × 104个野生型或转基因T细胞可打破这种耐受。过继转移的T细胞在I-Abm12移植的Rag2-/-小鼠体内可发生增殖并产生IFN-γ。

在初步实验中，将I-Abm12同种异体移植物和I-Ab同系移植物移植到C57BL/6小鼠体内。去除敷料后，C57BL/6小鼠的移植物表现出伤口愈合的迹象，但接触区域未完全闭合（图1A）。去除敷料后，CD4+ T细胞介导的炎症导致C57BL/6小鼠在移植后13天内出现坏死区域（红斑）并排斥I-Abm12同种异体移植物（图1B-C，实心符号），而同系移植物可耐受长达100天（图1B-C，空心符号）。这些数据表明，在免疫功能健全的C57BL/6小鼠中，I-Abm12移植物发生了急性排斥反应的进程。
多项研究表明，MHC II类分子不匹配尾部皮肤的排斥反应依赖于同种异体CD4+ T细胞的存在（综述见12）。事实上，T细胞缺陷型CD3ε-/-小鼠以及T细胞和B细胞缺陷型Rag2-/-小鼠均表现出完...

尾部皮肤移植是研究小鼠同种异体免疫反应中T细胞依赖性排斥反应和耐受诱导的有力模型。该方案的优势在于手术创伤小，且易于监测，无需处死受体小鼠。

小鼠尾部皮肤移植以研究同种异体CD4 T细胞应答

研究T细胞应答及其在识别同种异体抗原过程中的后果需要一种能够区分供体与受体T细胞的模型……

以下实验方案的总体目标是进行小鼠尾部皮肤移植。为了在小鼠模型中研究T细胞介导的排斥反应或耐受诱导，首先从小鼠供体获取尾部皮肤。第二步，准备受体动物的移植部位。接下来，在最后一步中将移植物移植并用组织粘合剂和绷带固定。移植后第7天拆除绷带，并对移植物进行评分。最终可研究T细胞介导的同种免疫反应。这种尾部皮肤移植技术为研究小鼠同种异体免疫反应中T细胞依赖性的排斥反应和耐受诱导提供了一个强有力的模型。在开始操作之前，打开指套式绷带，并用棉签将凡士林涂抹在伤口垫上，确保纱布完全被覆盖。接下来，用消毒液对已处死的供体小鼠的尾巴进行消毒。然后将尾部置于干净的塑料板上。将上方的黑色条纹朝下，沿尾部中线在皮肤上做一纵向浅表切口。用镊子剥离皮肤，随后将组织放入盛有10毫升HBSS的10厘米细胞培养皿中。剃除麻醉后受体小鼠背部的毛发，并用一块干燥的纱布清除任何残留的杂毛。用无菌溶液对剃毛后的移植部位进行消毒，然后用镊子夹住背部中右侧的皮肤，使用弯剪剪出一个直径约1厘米×0.6厘米的圆形切口。接着，用手术刀从切除的供体尾部皮肤上切取移植物，修去角部使组织呈圆形，将移植物装载到手术刀上，并用无菌棉签吸去多余的HBSS。然后将干燥的组织放置于受体小鼠的移植床部位。避免供体与宿主皮肤重叠，仅在接触区域涂抹组织粘合剂。接着将无皱褶的敷料缠绕于小鼠腰部，并使用粘性非弹性绷带将敷料固定在小鼠身上，以防止小鼠牙齿钩住绷带。恢复期间，在材料的上腹部腹侧做一个三毫米的切口。在温热的加热垫上完全恢复后，将移植动物放回笼中，并评估其活动能力。为确保绷带不过紧，需在动物饮用水中加入对乙酰氨基酚糖浆处理七天。移植后六至七天，使用无菌动脉剪剪开并小心移除绷带，注意避免拉伸移植部位。最后，观察移植小鼠的临床表现，并对皮肤移植物的排斥反应进行评分。本实验中，C57BL/6小鼠接受了IABM12同种异体移植物和IAB sin移植物的移植。移除绷带后，在C57BL/6小鼠中，移植物表现出伤口愈合的迹象，但接触区域尚未闭合。一至两周后，出现CD4阳性T细胞介导的炎症，导致移植物内部出现坏死区域。在C57BL/6小鼠中，IABM12同种异体移植物于移植后13天内发生排斥反应。尽管同系移植组在长达100天内被耐受。MHC II类不匹配尾部皮肤的排斥依赖于同种异体CD4阳性T细胞的存在。例如，T细胞缺陷型CD3ε基因敲除小鼠以及T细胞和B细胞缺陷型RAG2基因敲除小鼠均表现出完全的伤口愈合，并可耐受IaBM12移植物长达100天。接受IABM 12不匹配尾部皮肤移植物可使研究人员在无严重疾病病理的小鼠模型中研究同种异体CD4阳性T细胞及其效应功能。该尾部皮肤移植模型的优势在于，可通过过继性转移抗原特异性CD4阳性T细胞，便捷地对CD4阳性T细胞进行功能分析。在此代表性实验中，转移2 × 10⁴个抗原特异性的转基因ABM细胞

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