Name: 体外胰腺器官从分散的小鼠胚胎祖细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 了解小鼠胚胎胰腺祖细胞的三维培养方法，用于研究胰腺器官发育与细胞自组织机制。该技术可生成具有分支结构的类器官，适用于活细胞成像和功能分析。

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本研究先后获得了遗传学前沿国家研究中心（NCCR）的试点项目资助、青少年糖尿病研究基金会（JDRF）资助项目 41-2009-775 以及丹麦自由研究理事会/健康与疾病（Det Frie Forskningsråd/Sundhed og Sygdom）资助项目 12-126875 的支持。作者感谢 Spagnoli 实验室为视频拍摄提供了场地支持。

本方案旨在培养源自小鼠E10.5期解离的胰腺上皮细胞的胰腺类器官。
该方案需要获得动物实验的伦理批准。
1. 从小鼠E10.5胚胎中分离背侧胰腺芽
<ol>
	<li>在胚胎第 (E) 10.5 天处死定时妊娠的小鼠，用剪刀打开腹部，取出两侧子宫角，并将其置于盛有冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）或达尔伯克改良必需培养基（DMEM）的 10 cm 培养皿中。从处死动物到细胞接种的整个实验过程需在 60–90 分钟内完成，以避免细胞损伤。</li>
	<li>使用小剪刀将子宫分离成单个胚胎片段。将一个胚胎转移至含有冷 PBS 的 35 mm 培养皿中，并在解剖显微镜下以上部照明观察。用解剖镊子去除周围的肌肉、蜕膜和卵黄囊，暴露胚胎。将胚胎放回冷 DMEM 培养基中。可使用 3 ml 塑料移液管/滴管轻松转移胚胎。以类似方式逐个分离每个胚胎后再继续操作。</li>
	<li>将一个胚胎放入盛有 PBS 的洁净 35 mm 培养皿中。
	<ol>
		<li>使用细镊子（0.05 mm 宽度）去除前肢。将镊子轻轻插入开口处，以分离消化道与脊髓区域（图 1）。可选：为更方便观察胃部，可去除胚胎上半身至心脏处，并去除卵黄柄下方的尾部区域。</li>
		<li>定位胃、肝和肠。用镊子将胃至肠段的消化道分离出来，并置于冰上预冷的 DMEM 中（图 1）。背胰芽位于胃后方的背侧并与之相连（图 1）。</li>
		<li>以类似方式逐个分离每个消化道。若需对胚胎进行基因分型，应在解剖时收集尾部组织，并将每个独立的消化道分别置于 24 孔板的不同孔中，孔内含冰上预冷的 DMEM。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将一段消化道放入盛有冷 PBS 的洁净 35 mm 培养皿中。现在使用解剖显微镜下部透射照明，在明场条件下观察并解剖背胰芽。此条件有助于优化对组织体积的观察。使用电解 sharpened 钨针或 20 G 注射器针头，尽可能少地带附着间充质组织地分离胰芽（图 1）。
	<ol>
		<li>将分离的胰芽转移至含有冷 dispase 溶液（1.25 mg/ml）的培养皿中，孵育 2–3 分钟。此后，最方便的转移方式是使用火焰拉制的 50 µl 玻璃毛细管连接至口控柔性管。或者，也可使用 10 µl 移液器（Pipetman）配合合适的塑料吸头，但存在更高的丢失胰芽风险。</li>
		<li>在显微镜控制下进行胰芽的吸出与排出操作。将胰芽重新放回 PBS 中。使用针头和玻璃毛细管轻柔吸打，进一步清除分离胰芽周围的间充质组织（图 1）。</li>
		<li>当间充质完全去除后，用冷 PBS 清洗胰芽；将每个胰芽分别转移至 60 孔微型培养板的独立孔中（每孔含 10 µl 冷 DMEM）。注意不可在 dispase 溶液中去除间充质，否则会使组织变得非常黏稠。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 分散细胞的铺板与培养
<ol>
	<li>将所有胚胎的解剖上皮组织用火焰拉制的玻璃毛细管转移至装有10 µl PBS的60孔迷你培养盘的锥形孔中，进行洗涤。
	<ol>
		<li>将芽体转移至10 µl 0.05%胰蛋白酶中，于37 °C孵育4分钟。将芽体转移至含10 µl DMEM + 10%胎牛血清（FCS）的孔中以终止胰蛋白酶消化。</li>
		<li>使用拉制的细玻璃毛细管通过移液器吹打悬浮细胞进行解离。此步骤中需注意避免产生气泡，同时通过上下吹打使细胞解离。胰腺类器官的最佳起始状态为含有5–15个细胞的小细胞团，因此建议进行部分解离。图1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将多个胚胎的细胞汇集到一个离心管中，以尽量减少因个体处理带来的差异。用预冷的Matrigel以1:3的比例稀释细胞悬液。将此混合液分装至96孔板中，每孔8 µl，或分装至适用于成像的优化板中（见下文）。</li>
	<li>在37 °C下孵育平板5分钟，使Matrigel增稠。每孔加入70 µl选定的培养基（类器官或球体培养基，见 表1 和 2）并在含5% CO₂的湿润环境中孵育2 37 °C，95% 空气环境</li>
	<li>每4天更换一次培养基th 每天监测胰腺类器官的生长情况，并通过成像记录其发育过程。</li>
	<li>在此阶段，可根据先前报道的方法，在培养基中加入目标小分子或蛋白质以进行干扰实验 28.</li>
</ol>
表1：类器官培养基。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>材料名称</td>
			<td>储备液浓度</td>
			<td>终培养基中的浓度</td>
			<td>储备液体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>青霉素-链霉素</td>
			<td>100%</td>
			<td>1%</td>
			<td>50 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut 血清替代物（添加剂）</td>
			<td>100%</td>
			<td>10%</td>
			<td>500 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-巯基乙醇</td>
			<td>14.3 M</td>
			<td>0.1 mM</td>
			<td>1 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>佛波酯肉豆蔻酸酯乙酸盐（PMA）</td>
			<td>16 µM</td>
			<td>16 nM</td>
			<td>5 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632（ROCK 抑制剂）</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>10 µM</td>
			<td>1 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>50 µg/ml</td>
			<td>25 ng/ml</td>
			<td>2.5 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>重组人 R-spondin 1</td>
			<td>250 µg/ml</td>
			<td>500 ng/ml</td>
			<td>10 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; - 或 - &#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>重组小鼠 R-spondin 1</td>
			<td>250 µg/ml</td>
			<td>500 ng/ml</td>
			<td>10 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>重组人 FGF1（aFGF）</td>
			<td>100 µg/ml</td>
			<td>25 µg/ml</td>
			<td>1.25 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肝素（Liquemin）</td>
			<td>2500 U/ml</td>
			<td>2.5 U/ml</td>
			<td>2 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>重组人 FGF10</td>
			<td>100 µg/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
			<td>5 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4,412.25 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总计</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5,000 µl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：成球培养基。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>材料名称</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>终培养基中的浓度</td>
			<td>储存液体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>青霉素-链霉素</td>
			<td>100%</td>
			<td>1%</td>
			<td>50 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 x50（添加剂）</td>
			<td>100%</td>
			<td>10%</td>
			<td>100 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>重组人 FGF2 (bFGF)</td>
			<td>100 µg/ml</td>
			<td>64 ng/ml</td>
			<td>3.2 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632（ROCK 抑制剂）</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>10 µM</td>
			<td>1 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4845.8 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总计</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5000 µl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
3. 类器官发育进程的成像
<ol>
	<li>使用荧光延时显微镜每日或以延时显微成像技术对类器官进行成像。对于延时成像，应使用配备自动XY(Z)载物台的倒置荧光显微镜。</li>
	<li>将3 µl的小液滴滴加至含有2–5 ml培养基的4孔板或玻璃底板中。使用10倍长工作距离物镜进行成像。注意：可使用表达荧光示踪蛋白的转基因小鼠。例如，视频1展示了来自Pdx1-Ngn3-ERTM-ires-nGFP+ 小鼠4的类器官初始扩增过程。核定位的GFP可使用户将细胞作为独立对象进行追踪，但类似原理也可应用于具有膜荧光标记的小鼠（如mT/mG小鼠29）的细胞追踪。</li>
	<li>在细胞接种后3小时开始延时成像，以避免焦距漂移，并设置自动化控制软件在人工定义的位置每小时采集一张图像，持续3天或更长时间。对每个位置，均需获取微分干涉差（DIC）图像以及报告荧光标记表达的GFP信号图像。</li>
</ol>
4. 类器官的回收用于组织学分析
<ol>
	<li>将96孔板置于冰上，吸除培养基，并替换为冰冷的PBS，以部分解聚Matrigel。</li>
	<li>使用1,000 µl枪头轻柔吸取每个类器官，去除周围的Matrigel，避免破坏其整体结构。将每个类器官转移至含有冰冷PBS的孔中。保持孔板处于冰上。也可直接在Matrigel中进行固定。</li>
	<li>用4%多聚甲醛（PFA）固定类器官15分钟，随后用蔗糖进行冷冻保护，并包埋于明胶中。按照先前描述的方法（Johansson et al., 2007）4对每个类器官进行冷冻切片和组织学处理。</li>
</ol>
5. 类器官的回收用于PCR和生物化学分析
<ol>
	<li>将96孔板置于冰上，吸除培养基。每孔加入60 µl RNAlater，以稳定和保护细胞RNA。</li>
	<li>通过在冰上部分解聚，机械破坏每孔中的凝胶。可使用1,000 µl枪头回收单个类器官，以保持整体结构不被破坏；或使用200 µl枪头机械破坏凝胶，回收整个孔（含Matrigel）。用1,000 µl枪头将孔内内容物转移至置于冰上的无RNA酶、非粘性Eppendorf管中。</li>
	<li>用60 µl RNAlater洗涤各孔，并将洗涤液一并加入同一Eppendorf管中。</li>
	<li>在4 °C下，以500–1,000 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，仅保留20–30 µl RNAlater与沉淀一同留在管中。用于生化实验时，应尽可能使样品保持干燥状态。</li>
	<li>不要立即将样品在RNAlater中冷冻；可在4 °C下过夜保存（以使RNAlater充分渗透组织）。组织样品可长期储存在-20 °C，后续可用于组织破碎及少量RNA的提取。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

功能性β细胞的大规模生产 体外 仍然无效 1在此具有挑战性的背景下，发育生物学研究有助于解析功能性β细胞分化所必需的精确信号。本方案可用于胚胎胰腺前体细胞的维持、扩增与分化 体外包括形成能够产生胰岛素且不共表达其他内分泌激素的β细胞，这些细胞具有高水平的Pdx1，表达可使胰岛素成熟的前体转化酶，并含有经过加工的成熟胰岛素 28系统中的关键因素包括FGF信号通路（通过添加肝素增强的外源性FGF刺激）、Notch信号通路（内源性）以及Y-27632对ROCK的抑制作用：若缺乏这些因素，则无法生成或仅能生成极少量的类器官和球状结构。 28. FGF 和 Notch 信号活性的必要性可基于其在胰腺发育中的重要作用而得以理解 体内 28ROCK抑制剂可被blebbistatin替代，从而揭示出在细胞解离后微丝动态的过度激活会导致细胞死亡增加、前体细胞转录因子Pdx1受到强烈抑制以及细胞扩增能力丧失。有趣的是，类器官培养基中的许多其他组分被证明各自并非必需，但若共同缺失则会导致上皮分支结构的...

器官培养提供了一种有用的研究模型，可弥合复杂但高度相关的体内环境与简化但相关性较低的体外系统之间的差距 体内 研究以及细胞系模型的便捷但近似的模拟。在胰腺研究中，目前尚无与胰腺前体细胞完全等同的细胞系，尽管存在一些可模拟内分泌和外分泌细胞的永生化细胞系。成年完整胰腺无法进行体外培养；分离的内分泌胰岛可在无细胞增殖的情况下维持数周，而组织切片也可被保存 体外 几小时 5胚胎胰腺培养不仅被广泛用于研究其发育过程，还被用于探究上皮-间充质相互作用。 4,6,7，以成像观察过程 8 或与它们发生化学干扰 9. 主要采用两种器官培养方法：第一种是在纤维连接蛋白包被的培养板上培养胰腺芽 2，这有利于成像；第二种方法是在滤膜上于气液界面培养器官 3,4 最有利于保持形态发生。尽管这些方法非常有用，但会导致一定程度的扁平化；与正常发育相比，前体细胞的扩增极为有限，且起始细胞群体组成复杂，包含所有类型的胰腺细胞和间充质细胞。
培养和扩增分散的原代细胞的能力对于研究谱系关系以及揭示分离细胞类型的内在特性具有重要意义10。Sugiyama 等.11 能够在饲养层上将胰腺前体细胞和内分泌前体细胞维持培养3-5天，并保留部分功能特征。胰腺球（pancreatospheres）类似于神经球12和乳腺球13，已可从成体胰岛细胞和导管细胞中扩增获得，但产生这些球体的前体细胞/干细胞的本质尚不明确。此外，与生理发育过程相反，这些胰腺球中包含了一些神经元14,15。最近，研究人员还从胚胎期胰腺前体细胞16,17以及再生胰腺组织18中成功生成了球体，实现了良好的前体细胞扩增和后续分化，但未能重现形态发生过程。
近年来，由分散且通常定义明确的细胞自组织形成的类器官三维模型迅速发展，能够模拟多种器官的发育过程或成体更新，例如肠道19,20、胃21、肝脏22、前列腺23和气管24。在某些情况下，利用胚胎干细胞（ES细胞）在三维培养中重现了器官发育过程中的形态发生和分化，例如视杯25、肠道26和脑组织27。
本文介绍一种在三维 Matrigel 支架中扩增解离的多能胰腺前体细胞的方法，在该支架中这些细胞可进行分化并自我组织。

<table><tbody><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>KnockOut 血清替代物（添加剂）</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3148-25ML</td><td>储存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯（PMA）</td><td>Calbiotech</td><td>524400-1MG</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Y-27632（ROCK 抑制剂）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ab120129</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C。注意！稳定性/来源常导致问题。</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9644-2MG</td><td>储存于 -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>重组人 R-spondin 1</td><td>R&amp;D</td><td>4645-RS-025/CF</td><td>储存于 -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>重组小鼠 R-spondin 1</td><td>R&amp;D</td><td>3474-RS-050</td><td>储存于 -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>重组人 FGF1（aFGF）</td><td>R&amp;D</td><td>232-FA-025</td><td>储存于 -80 &amp;deg;C — 不可添加以增加β细胞产量</td></tr><tr><td>肝素（Liquemin）</td><td>Drossapharm</td><td></td><td>储存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>重组人 FGF10</td><td>R&amp;D</td><td>345-FG-025</td><td>储存于 -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>B27 ×50（添加剂）</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>重组人 FGF2（bFGF）</td><td>R&amp;D</td><td>233-FB-025</td><td>储存于 -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>储存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>RNAlater — RNA 稳定试剂</td><td>Qiagen</td><td>76104</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>Dispase&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4818-2MG</td><td>工作浓度：1.25 mg/ml。储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>用于重悬的 BSA</td><td>Milipore</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.millipore.com/catalogue/item/81-068-3">81-068&lt;/a&gt;</td><td>用于细胞因子的重悬&amp;nbsp; — 储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>Gibco</td><td>16141079</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>60 孔 MicroWell 培养板</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0815-100EA</td><td></td></tr><tr><td>4 孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>96 孔 F 型底板</td><td>Greiner Bio</td><td>6555180</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底板</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>一次性玻璃微量移液管</td><td>Blaubrand</td><td>708745</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td></td><td></td><td>配备 Hamamatsu ORCA ER B7W 相机以及 Ludin Cube 和 Box 的 Cell&amp;#174; 成像系统（电动倒置 Olympus IX81 显微镜台）&lt;br /&gt;
配备 Leica DFC365 FX 相机和 AF6000 Expert/Matrix 软件控制界面的 Leica DMI6000 B 显微镜台，周围配有 Ludin Cube 和 Box。</td></tr><tr><td>物镜</td><td></td><td></td><td>Olympus UPLAN FL NA 0.30 空气 9.50 mm 10X 长工作距离；&lt;br /&gt;
Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 空气 11.0 mm 10X 长工作距离</td></tr></tbody></table>

体外 从小鼠胚胎前体细胞诱导胰腺器官发生

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

胰腺是一个重要的器官，可调节葡萄糖稳态并分泌消化酶。关于胰腺胚胎发育的研究已推动了从干细胞生成胰腺细胞的方案的建立1。整个胚胎期的胰腺可在多个发育阶段进行体外培养2-4。这些培养方法已被用于药物测试以及发育过程的成像研究。然而，器官的扩展能力非常有限，且由于器官趋于扁平化，其形态发生过程无法被真实地重现。
我们提出了一种三维（3D）培养条件，可有效扩增解离的小鼠胚胎胰腺前体细胞。通过调控培养基的成分，可生成两种结构：一种主要是由处于初始状态的胰腺前体细胞扩增形成的中空球状结构；另一种则是更为复杂的类器官，其中前体细胞进一步发育为更成熟的扩增状态，并分化为内分泌细胞、腺泡细胞和导管细胞，且能自发地自组织，形态上类似于胚胎期的胰腺。
我们在此展示，体外过程重现了天然胰腺发育的诸多方面。该培养系统通过将初始复杂性简化为少数前体细胞，适用于研究细胞如何协同形成器官。该模型可再现胰腺的三维结构，因而可用于研究形态发生过程，包括上皮结构的极化和分支形成。同时，该系统也适用于评估细胞对微环境机械信号（如刚度）的响应及其对细胞张力完整性的影响。

E10.5 时期的背侧胰腺前体细胞经解离后接种于三维 Matrigel 中，可重现胰腺发育过程。使用荧光报告基因可最简便地追踪这些前体细胞。在本实验中，我们采用了一种转基因小鼠，该小鼠在无他莫昔芬存在的情况下，由 Pdx1 启动子驱动表达核定位的 GFP 蛋白（Pdx1-Ngn3-ERTM-nGFP）（视频 1），因此不会激活 Neurog34（图 2）。
使用类器官培养基后，细胞小簇在最初几小时内开始发生初始聚集成团。在前4天内，可通过细胞簇的增大观察到其扩张（图2A）。从第5天起，在体积最大的20%类器官中开始形成分支。单个细胞不会扩张，并且会失去Pdx1的表达，而较大的细胞簇则保持Pdx1的表达28。
在这些条件下，前体细胞会经历显著的形态发生过程，形成分支状的上皮结构。该过程仅在前...

本方案所述的三维培养方法可重现小鼠胚胎胰腺前体细胞发育为分支器官的过程，包括前体细胞的大量扩增、分化及形态发生。该方法适用于对微环境进行成像观察、功能干扰及操作干预。

胰腺是一个重要的器官，负责调节葡萄糖稳态并分泌消化酶。关于胰腺胚胎发育的研究已推动了……

本实验的总体目标是在三维 Matrigel 支架中扩增相关的多能性胰腺前体细胞，使其能够分化并自我组织。首先从胚胎第 10.5 天的小鼠胚胎中分离胰腺，然后通过第二步去除间充质，并将上皮组织解离为单细胞和小细胞团。最后一步是将细胞悬浮于Matrigel中，并将聚合后的凝胶进行孵育以实现扩增。最终可形成能够自我组织的分支状胰腺类器官，其形态类似于小鼠胚胎胰腺，可通过显微镜进行活体或终点观察。该技术相较于现有方法（如全胰腺外植体）的主要优势在于，起始使用的细胞群体具有明确的定义且复杂性较低。与二维细胞培养相比，三维培养能更好地维持胰腺前体细胞。该方法有助于我们回答该领域内一些关键问题，例如细胞间的相互作用或细胞与基质的相互作用。这最终将帮助我们理解极性是如何形成的，从而也揭示细胞多样性是如何产生的。该技术在人类中应用后，对糖尿病治疗具有重要意义，因为我们能够扩增胰腺组织，从而产生更多分泌胰岛素的功能更佳的细胞。本方法的可视化演示至关重要，因为去除“神奇时间”（amazing time）的步骤操作困难，而解离步骤对于类器官的形成尤为关键。首先，将之前分离得到的胚胎发育第10.5天的小鼠胚胎置于盛有PBS的洁净35毫米培养皿中。接着，使用宽度约为 0.05 毫米的细镊子去除前肢。将镊子轻轻插入开口处，分离消化道与脊髓区域。在胚胎中定位胃、肝和肠。然后使用针从胃到肠分离胃肠道。将胃肠道置于冰上的冷DMM中。重复上一步骤，以分离每个个体的胃肠道。将各个胃肠道组织分别置于不同的孔中。在含有冰冷DMM并置于冰上的24孔板中，仅当基因型具有重要意义时，才需要将它们分开。取一个胃肠道组织放入含冷PBS的洁净33毫米培养皿中，并在解剖显微镜下利用透射光以明场模式进行观察。当胃肠道处于视野中后，使用经电解打磨的细针头（而非普通针头或20号注射针头）解剖背侧胰芽。尽可能剥离胰芽周围间充质组织，仅保留上皮周围的少量组织。将分离出的胰芽置于培养皿中，并在冰冷的1.25毫克/毫升透明质酸酶溶液中孵育2至3分钟。从此步骤开始，在转移芽体时，使用连接在口控柔性管上的火焰拉制的50微升玻璃毛细管。在显微镜控制下将芽体放入溶液中。将胰腺芽体放回PBS中。然后使用细针和玻璃毛细管轻轻抽吸，将分离的胰腺芽从间充质中清理干净。待间充质完全去除后，用冷PBS冲洗胰腺芽，并将每个胰腺芽转移至独立的孔中，置于每孔含有10微升冷DMM的60孔板中。为清洗解剖得到的胰腺芽，将每个胰腺芽用移液器分别转移至含有 10 µL PBS 的 60 孔微型培养盘中的锥形孔内，随后将胰腺芽转移至含有 10 µL 0.05% 胰蛋白酶的孔中，在 37°C 下孵育 4 分钟。接着将胰腺芽转移至含有 10 µL 添加 10% 胎牛血清的 DMM 的孔中以灭活胰蛋白酶，再用拉制毛细管仪制备的细毛细管反复吹打细胞悬液，使细胞充分解离。建

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

体外胰腺器官从分散的小鼠胚胎祖细胞

一种三维克隆形成实验方法，可使类似胰腺的前体细胞分化为表达胰岛素的克隆集落。该方法利用含有甲基纤维素、Matrigel 和生长因子的半固体培养基，使单个前体细胞在其中增殖并分化。...

一种用于定量检测表达胰岛素的集落形成前体细胞的实验方法

本研究描述了一种诱导人类胚胎干细胞向胰腺分化的定向分化方法。具有重要意义的发现是，内皮细胞共培养可介导由人类胚胎干细胞衍生的胰腺前体细胞成熟为表达胰岛素的细胞。...

内皮细胞共培养在定向分化策略中促进人胚胎干细胞向胰岛素生成胰腺细胞的成熟

在此，我们介绍一种小鼠胚胎胰腺的分离、培养与操作方法。该方法是一种极佳的 离体...

一种系统 离体 胚胎胰腺的培养

本文描述了一种从人胎儿胰腺细胞中分离、培养和成像胰岛细胞簇（ICCs）的实验方案。...

人胎儿胰腺细胞簇的分离、培养与成像

体外集落形成实验用于鉴定从成年小鼠胰腺中分离的三潜能前体细胞

本文介绍了一种从悬浮培养的 e10.5...

由小鼠胰腺前体细胞生成无支架三维胰岛素表达胰腺类器官 体外

本文介绍了一种详细的实验方案，通过解离的单细胞非克隆型单层培养方法，将人多能干细胞（hPSCs）分化为胰腺/十二指肠同源框蛋白1+（PDX1+）细胞，以生成胰腺谱系细胞。该方法适用于制备均一的hPSC来源细胞，并可用于基因操作与筛选。...

高效生成人多能干细胞在贴壁培养中分化为胰腺/十二指肠同源框蛋白1+ 后前肠/胰腺前体细胞

本方案比较了两种不同诱导方案在将人牙髓干细胞（hDPSCs）向胰腺谱系分化中的应用...

体外诱导人牙髓干细胞向胰腺谱系分化

本方案描述了一种改进的方法，可提高人多能干细胞（hPSCs）在平面单层培养中衍生的胰腺前体细胞共表达PDX1和NKX6.1转录因子的效率。该方法通过更换新鲜基质、调控细胞密度以及解离内胚层细胞来实现。...

人多能干细胞在二维培养系统中向胰腺β细胞前体的分化

我们提供一种微创方案，用于将人干细胞来源的胰腺干细胞胰岛移植到免疫缺陷小鼠的肌肉内 体内...

小鼠肌肉内移植人多能干细胞衍生的胰腺内分泌细胞

了解小鼠胚胎胰腺祖细胞的三维培养方法，用于研究胰腺器官发育与细胞自组织机制。该技术可生成具有分支结构的类器官，适用于活细胞成像和功能分析。

体外从小鼠胚胎前体细胞诱导胰腺器官发生

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体外 从小鼠胚胎前体细胞诱导胰腺器官发生

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