的iPS细胞从中间体可重编程小鼠模型的细胞表面标志物介导的净化
2014年9月6日
小鼠胚胎成纤维细胞可以通过转录因子 Oct-4、Sox-2、Klf-4、c-Myc 的强制表达以低效率重编程为诱导多能干细胞。重编程反应的罕见中间体是通过用针对细胞表面制造商 Thy-1.2、Ssea-1 和 Epcam 的抗体标记分离的 FACS。
该程序的总体目标是从重编程小鼠胚胎成纤维细胞的培养物中分离罕见的重编程中间体。这是通过首先从可重编程小鼠品系的 E 13.5 胚胎中获得小鼠胚胎成纤维细胞来实现的。在第二步中，将低传代小鼠胚胎成纤维细胞接种在补充有多西环素的诱导多能干细胞或 IPS 细胞培养基中，以启动重编程过程。
接下来，在重编程过程中的选定时间点收获细胞，并用针对特定细胞表面标志物的抗体标记。最终，可以通过事实分离出罕见的重编程中间体，以进行进一步的实验分析。现有方法的这种技术的主要优点是，在没有对重编程过程无效的细胞的情况下，可以对罕见的重编程中间体进行机制研究，这些细胞构成了群体的大部分 生成小鼠胚胎、成纤维细胞或 MES 首先将胚胎第 13.5 天子宫角转移到含有 10 毫升无菌 PBS 的 10 厘米组织培养皿中。
然后用消毒的手术级剪刀将角剪成单独的块，每块包含一个胚胎。接下来，在组织培养罩中的解剖显微镜下，使用消毒的镊子小心地去除子宫包膜和每个胚胎周围的额外胚膜，并将每个剥落的胚胎转移到装有 10 毫升新鲜 PBS 的 10 厘米培养皿中。然后用镊子去除每个胚胎的头部、四肢、尾巴和内脏器官。
根据需要将头部冷冻在单独的 1.5 ml 试管中，以便进行基因分型。将每个躯干转移到新的单独的 10 厘米板中，并使用两个手术刀片将每个胚胎切碎两分钟。在 200 微升胰蛋白酶 EDTA 中，在室温下消化组织块 3 到 5 分钟，然后再切碎 2 分钟。
然后用 2 毫升冰毒培养基灭活试用素，并使用 1000 微升移液管将细胞浆液转移到 15 毫升试管中。进一步用轻柔的移液机械解离组织，然后将细胞溶液转移到涂有明胶的 10 厘米培养皿中。向培养物中再添加 10 毫升冰毒培养基。
24 至 48 小时后，应在平板上密密麻麻地覆盖 MEF 以重新编程 MEF，首先在 37 摄氏度的水浴中解冻低通道冷冻冰毒培养物，然后将内容物转移到装有 10 毫升预热冰毒培养基的试管中。离心细胞后，将沉淀重悬于 12 毫升新鲜冰毒培养基中，并将细胞悬液转移到明胶包被的 T 75 培养容器中。恢复期 24 至 48 小时后，用 PBS 洗涤 MEF，然后用 3 毫升胰蛋白酶 EDTA 在 37 摄氏度下分离细胞 3 至 5 分钟。
然后用 5 毫升冰毒培养基停止酶消化，并用 10 毫升移液管轻轻混合进一步解离细胞。接下来，通过将细胞接种到新的明胶上来重编程 mets，以 6.7 倍 10 的 T 75 培养瓶包被到每平方厘米的 12 毫升含有 2 微克多西环素的 IPSC 培养基中，前六天。每隔一天用新鲜的多西环素补充的 IPSE 培养基更换培养基，通过胰蛋白酶 EDTA 分离在所需的时间点收获重编程中间体，正如刚刚对于每个收获的中间悬浮液所示。
在 PBS 中洗涤细胞。然后复苏。将沉淀悬浮在传真介质中进行抗体标记，以建立完全重编程的 IPSC 培养物。
将细胞在不含多西环素的 IPSC 培养基中再培养 4 到 7 天，以标记重编程的细胞。用适当的目标抗体标记收获的中间体。10 分钟后，轻轻敲击试管以重悬细胞，然后将试管置于冰上再 10 分钟。
第二次孵育后，用每管 10 mL 冷 PBS 洗涤细胞。然后小心吸出上清液，并将沉淀重悬于适当体积的标记培养基中，并在冰上补充有 strippin P size 7。20 分钟后，在另外 10 个冷 PBS 中洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于补充有碘化丙啶的标记培养基中。
通过将悬浮液通过 70 微米过滤器过滤掉任何细胞团块，然后将细胞转移到冰上相应的传真管中。对于补偿控制。Resus 将 IPS 细胞的冷冻小瓶悬浮在 800 微升标记缓冲液中，保存在受辐照的 mes 上。
留出 200 微升细胞用于未标记的对照对照。然后将剩余的细胞悬液分装在三个 15 毫升试管中，用于单色对照，并如刚才所示标记样品，以通过流式细胞术分析中间体。首先，在前向并排散点图中设置一个门，以排除碎片。
然后使用前向散射高度与前向散射区域来排除聚集体，并使用 PI 通道与前向散射。对 PI 阴性活细胞进行门控。使用未标记的单元格调整太平洋蓝 FITC 和 PSI 7 通道的电压。
理想情况下，将细胞群定位在相应通道的低端。接下来，用未标记的对照细胞设置门，将重编程培养物细分为第 3 天、第 6 天和第 9 天。SSEA 1 阴性 TH 1.2 阳性细胞、SSEA 1 阴性 TH 1.2 阴性细胞和重编程中间体 SSEA 1 阳性 TH 1.2 阴性细胞的群体。
然后进一步细分第 9 天 SSEA 一个阳性 TH 1.2 负分数与 SSEA 1 与 EPAM 图。使用未标记的对照，在 EPAM 阳性细胞和 EPAM 阴性细胞周围绘制门，如图所示。最后，将细胞收集在 1 至 2 mL 的 IPS 细胞培养基中。
在多西环素诱导后，重编程神话在第 6 天左右发生明显的形态变化。早期菌落状斑块开始出现，在进一步培养后继续扩大大小。一个好的重编程实验将导致每个 T 75 产生超过 500 个菌落，最初接种 5 乘以 10 到第五个细胞，并且建立的 IPS 培养物将具有特征性的圆顶形菌落，并且大部分没有分化的细胞。
重编程过程中的形态和分子变化反映在大腿 1.2 SSEA 1 和最终 epca 的细胞表面表达的变化中。虽然 MES 主要对大腿 1.2 呈阳性，而其他标志物呈阴性，但到第 3 天，很大一部分细胞已经开始下调大腿 1.2 的表达，极小的亚群已成为 SSEA 1 阳性。该时间点的实际重编程中间体在第 6 天和第 9 天，在第 12 天左右可以检测到 SSEA one 阳性细胞的百分比增加，通常远高于 10%。
可以检测到同样呈阳性的 SSEA one 阳性细胞亚群。对于 epca。已建立的真正 IPS 细胞培养物将呈强阳性。
对于 SSEA one 和 EPCA在尝试此过程时，重要的是要记住仅使用事先已正确基因分型的低传代图。
概述
本研究概述了一种从小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中分离稀有重编程中间体的程序，这些中间体在转化为诱导多能干细胞（iPSCs）的过程中被发现。该过程涉及使用特定的转录因子和抗体标记，以便于识别和分离这些中间体。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞生物学
- 细胞重编程
- 流式细胞术
背景
- 诱导多能干细胞（iPSCs）可以从体细胞中产生。
- 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）作为研究重编程的模型。
- 转录因子Oct-4、Sox-2、Klf-4和c-Myc对重编程至关重要。
- 重编程中间体的分离允许进行机制研究。
研究目的
- 从MEFs中分离稀有重编程中间体。
- 分析这些中间体以更好地理解重编程过程。
- 提高生成iPSCs的效率。
使用的方法
- 从E 13.5胚胎中提取MEFs。
- 在添加多西环素的iPSC培养基中接种MEFs。
- 在特定时间点收集细胞并用抗体标记。
- 通过流式细胞术分离中间体。
主要结果
- 使用特定标记成功分离了重编程中间体。
- 识别了在各种重编程阶段的不同细胞群体。
- 展示了对分离的中间体进行机制研究的能力。
- 提高了对MEFs中重编程动力学的理解。
结论
- 该方法允许有效分离重编程中间体。
- 获得的见解可以提高iPSC生成的效率。
- 未来的研究可以利用这些中间体获得更深入的机制见解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Purification of iPS cell intermediates using cell surface markers enables mechanistic de-risking of reprogramming workflows, addressing a key bottleneck in stem cell-based discovery. This approach enhances predictive confidence in early-stage cell fate decisions and supports robust target validation for regenerative medicine and disease modeling portfolios. Isolating rare intermediates allows for precise interrogation of reprogramming dynamics, informing risk-adjusted advancement in cell therapy pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic studies on reprogramming intermediates free from refractory cell populations.
- Supports functional validation of pluripotency-associated markers during cell fate transitions.
- Facilitates pathway clarification by tracking marker expression changes over time.
- Improves predictive confidence in selecting reprogramming factors and conditions.
Screening & Assay Development
- Provides validated cell populations for downstream phenotypic screening and assay development.
- Standardizes isolation of defined intermediates, enhancing reproducibility across experiments.
- Generates quantitative outputs via flow cytometry for robust assay readouts.
- Enables scalable preparation of intermediates for compound evaluation or genetic perturbation studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns reprogramming intermediates with disease-relevant cell states for translational modeling.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic studies on defined cell populations.
- Reduces biological ambiguity in preclinical models by isolating homogeneous cell states.
Pipeline & Workflow Integration
This cell surface marker-based purification method integrates at the interface of early discovery and preclinical research, bridging mechanistic studies with translational applications.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on reprogramming efficiency and marker dynamics.
- Screening: Delivers reproducible, marker-defined cell populations for assay readiness and quantitative analysis.
- Analytics: Provides flow cytometry-based measurements to compare reprogramming stages and conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment of in vitro intermediates with in vivo disease or developmental states.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for isolating rare cell populations across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell reprogramming studies.
- Operational Value: Standardizes cell isolation and improves reproducibility across R&D teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by enabling robust target validation and pathway analysis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cell-based therapeutic and modeling programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and cell surface marker selection.
- Demands access to high-quality antibodies and analytical instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of gating strategies and marker panels.
- May require adaptation for different cell types or reprogramming systems.
- Dependent on availability of isogenic, well-characterized starting cell populations.
