由可重编程小鼠模型中利用细胞表面标志物介导分离iPS细胞中间态细胞

本实验的总体目标是从重编程小鼠胚胎成纤维细胞的培养物中分离出稀有的重编程中间态细胞。首先，从可重编程小鼠品系的 E 13.5 胚胎中分离获得小鼠胚胎成纤维细胞；第二步，将低代次的小鼠胚胎成纤维细胞接种于添加了多西环素的诱导性多能干细胞（IPS 细胞）培养基中，以启动重编程过程。

接下来，在重编程过程中的选定时间点收集细胞，并用针对特定细胞表面标志物的抗体进行标记。最终，可通过流式细胞术分离出稀有的重编程中间态细胞，用于进一步的实验分析。该技术相较于现有方法的主要优势在于，能够在排除那些对重编程过程具有抗性的细胞（这类细胞在群体中占大多数）的情况下，对稀有的重编程中间态细胞开展机制性研究。为获得小鼠胚胎成纤维细胞或间充质细胞，首先将胚胎第13.5天的子宫角转移至含有10毫升无菌PBS的10厘米组织培养皿中。

然后使用灭菌的手术级剪刀将子宫角切成单个组织块，每块包含一个胚胎。接下来，在超净台内的解剖显微镜下，使用灭菌镊子小心去除每个胚胎周围的子宫包膜和胚外膜，并将剥离后的胚胎逐个转移至含有10毫升新鲜PBS的10厘米培养皿中。随后，用镊子去除每个胚胎的头部、四肢、尾部及内脏器官。

根据需要将头部放入单独的1.5毫升离心管中冷冻，用于基因分型。将每个躯干转移至新的单独的10厘米培养皿中，使用两把手术刀对每个胚胎进行剪切，持续两分钟。在室温下用200 µL胰蛋白酶EDTA消化组织碎片3至5分钟，随后再进行两分钟的剪切处理。

然后用两毫升甲基纤维素培养基灭活胰蛋白酶，并使用1000微升移液器将细胞悬液转移至15毫升离心管中。通过轻柔吹打进一步机械解离组织，随后将细胞悬液转移至经明胶包被的10厘米培养皿中。向培养物中额外加入10毫升甲基纤维素培养基。

24至48小时后，培养皿应被小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）密集覆盖。为重编程MEFs，首先将低代次冻存的MEF细胞在37摄氏度水浴中快速解冻，然后将内容物转移至含有10毫升预热MEF培养基的离心管中。离心沉淀细胞后，将细胞沉淀重悬于12毫升新鲜MEF培养基中，并将细胞悬液转移至经明胶包被的T75培养瓶中。经过24至48小时的恢复期后，用PBS洗涤MEFs，随后在37摄氏度条件下加入3毫升胰蛋白酶-EDTA作用3至5分钟以解离细胞。

然后加入5毫升甲基纤维素培养基终止酶消化，并用10毫升移液管轻轻吹打使细胞进一步解离。接下来，在新的明胶包被的T75培养瓶中接种细胞，每平方厘米接种6.7×10³个细胞，加入含2微克/毫升多西环素的12毫升iPSC培养基，前6天进行重编程。每隔一天更换一次新鲜的含多西环素的iPSC培养基，并在所需时间点通过胰蛋白酶-EDTA消化法收集重编程中间产物，具体操作如前所示，针对每次收获的中间细胞悬液进行处理。

用 PBS 洗涤细胞。然后重悬。将沉淀重悬于 FAX 培养基中，用于抗体标记，以建立完全重编程的 iPSC 培养体系。

将细胞在不含多西环素的iPSC培养基中继续培养四到七天，以标记重编程的细胞。用相应的目标抗体标记收获的中间细胞。10分钟后，轻轻敲击离心管以重悬细胞，然后将离心管置于冰上再孵育10分钟。

第二次孵育后，每管用 10 毫升冷 PBS 洗涤细胞。然后小心吸除上清液，并将沉淀物重悬于适量的标记培养基中，该培养基需补充 strippin P size seven 并置于冰上。20 分钟后，再用 10 毫升冷 PBS 洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于含有碘化丙啶的标记培养基中。

通过70微米滤网过滤悬液以去除任何细胞团块，然后将细胞转移至冰上相应的流式管中。用于补偿对照时，将一管维持在经照射的饲养层细胞上的iPS细胞重悬于800微升标记缓冲液中。

留出 200 微升细胞用于未标记对照。然后将剩余的细胞悬液分装至三个 15 毫升离心管中，用于单色对照，并按前述方法标记样本，以便通过流式细胞术分析中间产物。首先在前向散射与侧向散射散点图中设置门控，以排除碎片。

然后利用前向散射高度与前向散射面积的关系排除聚集体，并利用PI通道与前向散射的关系对PI阴性活细胞进行设门。使用未标记细胞调节Pacific blue、FITC和PSI seven通道的电压。

将细胞群体理想地定位在相应通道的低端。接下来，使用未标记的对照细胞设置门控，将重编程培养物分为第3天、第6天和第9天。细胞群体包括SSEA1阴性TH1.2阳性细胞、SSEA1阴性TH1.2阴性细胞，以及重编程中间态细胞SSEA1阳性TH1.2阴性细胞。

然后，利用SSEA-1与EPAM点图进一步细分第九天的SSEA-1阳性、TH 1.2阴性组分。根据未标记对照样本，在EPAM阳性细胞和EPAM阴性细胞周围设门，如图所示。最后，将细胞收集至1至2毫升的iPS细胞培养基中。

在强力霉素诱导下，重编程的细胞在第6天左右会经历明显的形态学变化。早期类似克隆的细胞集落开始出现，并随着进一步培养而持续增大。一次成功的重编程实验，初始接种五乘以十的五次方个细胞的T75培养瓶中应产生超过500个克隆；建立的诱导多能干细胞（iPS）培养物应具有典型的穹顶状克隆结构，且几乎不含分化细胞。

重编程过程中的形态学和分子变化反映在细胞表面标志物Thigh 1.2、SSEA-1以及最终EPCA表达的变化上。虽然MES细胞主要对Thigh 1.2呈阳性，而对其他标志物呈阴性，但在第3天时，大部分细胞已开始下调Thigh 1.2的表达，仅有极小部分细胞变为SSEA-1阳性。在此时间点的实际重编程中间阶段，到第6天和第9天时，SSEA-1阳性细胞的比例增加，通常超过10%，到约第12天时可被检测到。

可检测到一部分SSEA-1阳性细胞也呈epca阳性。已建立的真正iPS细胞培养物将呈强阳性。

在进行SSEA和EPCA实验时，重要的是要记住仅使用经过适当基因分型的低代次细胞系。