Name: 从人多能干细胞定向多巴胺能神经元分化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 学习从人多能干细胞高效分化A9中脑多巴胺能神经元的优化方案。该方法通过神经诱导培养基促进底板祖细胞形成，经30天成熟培养获得高纯度神经元，为帕金森病疾病建模和细胞替代治疗研究提供重要工具。

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作者感谢Renee Reijo Pera实验室成员在本实验方案开发及本稿件准备过程中提供的帮助。本工作由加州再生医学研究所（CIRM）共享实验室（CL-00518）资助。

1. 培养基的制备
<ol>
	<li>通过混合以下成分制备小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养基：445 ml DMEM、50 ml 胎牛血清（FBS）和 5 ml 100× 青霉素/氨苄青霉素储备液。过滤除菌后的培养基置于 4 °C 保存，不超过 14 天。</li>
	<li>通过混合以下成分制备含血清的人多能干细胞（hPSC）培养基：385 ml DMEM/F12、100 ml KnockOut 血清替代物（KSR）、5 ml 100× 非必需氨基酸储备液、5 ml 100× 青霉素/氨苄青霉素储备液、5 ml 100× β-巯基乙醇储备液以及 10 ng/ml bFGF。过滤除菌后的培养基置于 4 °C 保存，不超过 10 天。</li>
	<li>通过混合以下成分制备无血清 mTeSR1 培养基：400 ml mTeSR1 基础培养基、100 ml 5× 补充剂和 5 ml 100× 青霉素/氨苄青霉素储备液。培养基置于 4 °C 保存，不超过 10 天。</li>
	<li>制备 10× 胶原酶 IV 储备液：称取 0.5 g 胶原酶 IV 粉末，溶于 50 ml DMEM/F12 中，过滤除菌。分装后于 -20 °C 保存数月。</li>
	<li>制备 0.1% 明胶溶液：称取 0.5 g 牛皮来源 B 型明胶粉末，溶于去离子水中，经高压灭菌后于室温保存数周。</li>
	<li>通过混合以下成分制备 KSR 分化培养基：410 ml DMEM、75 ml KSR、5 ml 100× 非必需氨基酸储备液、5 ml 100× 青霉素/氨苄青霉素储备液和 5 ml 100× β-巯基乙醇储备液。过滤除菌后的培养基置于 4 °C 保存，不超过 10 天。 
	注意：KSR 不同批次间存在差异，可能影响分化效率。因此建议测试多个批次的 KSR，以筛选出最适合分化的批次。</li>
	<li>通过混合以下成分制备 N2 分化培养基：98 ml DMEM、1 ml 100× N2 补充剂和 1 ml 100× 青霉素/氨苄青霉素储备液。过滤除菌后的培养基置于 4 °C 保存，不超过 10 天。</li>
	<li>通过混合以下成分制备 B27 分化培养基：480 ml 神经基础培养基（neurobasal medium）、10 ml 50× B27 补充剂、5 ml 100× GlutaMAX 储备液和 5 ml 100× 青霉素/氨苄青霉素储备液。过滤除菌后的培养基置于 4 °C 保存，不超过 10 天。</li>
</ol>
2. 在MEF饲养层细胞上培养hESC和hiPSC
H9 人类胚胎干细胞（hESCs）购自 WiCell 研究所，人类诱导多能干细胞（hiPSCs）则由 Reijo Pera 实验室通过逆转录病毒介导的 Yamanaka 因子 OCT3/4、SOX2、KLF4 和 c-MYC 转导建立18。
<ol>
	<li>在细胞传代至少前一天，向6孔板的每个孔中加入1 ml 0.1%明胶，制备明胶包被板，并在37 °C孵育至少30分钟。</li>
	<li>孵育结束后，吸除孔中的明胶，使用血细胞计数板计数细胞，以每孔1.6 × 105个细胞的密度将经辐照失活的MEF细胞接种至孔中，加入MEF培养基。 
	注意：MEF饲养层可选择在细胞传代前3天准备。</li>
	<li>在接种MEF饲养层后的第二天进行细胞传代：吸除hPSCs的培养基，每孔加入1 ml含1 mg/ml IV型胶原酶的溶液，于37 °C孵育1小时。</li>
	<li>在孵育期间，用PBS洗涤MEF饲养层一次，然后每孔加入1.5 ml预热（37 °C）的含血清hPSC培养基。</li>
	<li>1小时后，轻轻敲击培养板数次，使大部分未分化的细胞集落从板底脱落，而分化集落仍附着于板上。小心收集漂浮的集落，并转移至15 ml离心管中。</li>
	<li>用预热（37 °C）的DMEM/F12培养基轻柔洗涤培养板一次，并将洗涤液转移至同一15 ml离心管中。</li>
	<li>将离心管以179 × g离心3分钟。</li>
	<li>吸除上清液，注意不要扰动沉淀。加入预热的hPSC培养基，轻轻吹打数次使细胞团块分散为较小的集落，并充分混匀。</li>
	<li>按1:3至1:6的比例将细胞接种至新的MEF饲养层上。</li>
	<li>每天更换培养基，每5–6天传代一次细胞。</li>
</ol>
3. 分化细胞的制备
<ol>
	<li>至少在细胞准备前一日，制备一些Matrigel包被板（通常为6孔板中的3个孔）。用冷的（4 °C）DMEM/F12以1:40的比例稀释Matrigel，每孔加入1 ml。将Matrigel板在4 °C孵育过夜。注意：可用Parafilm密封Matrigel板，并在4 °C保存长达一周。</li>
	<li>传代后第4天使用细胞（见步骤2）。去除培养板上所有已分化的克隆。吸除培养板中的培养基，每孔加入1 ml accutase，于37 °C孵育5 min。</li>
	<li>孵育期间，通过向6孔板的每个孔中加入1 ml明胶来制备若干明胶板。将这些明胶板与前一日制备的Matrigel板一同放入培养箱中。</li>
	<li>5分钟孵育后或当细胞变为半悬浮状态时，将细胞上下吹打数次，使其分散为单细胞。</li>
	<li>将单细胞收集至15 ml离心管中，在258 × g下离心3分钟。</li>
	<li>用适量含血清的hPSC培养基重悬细胞，并加入Thiazovivin至终浓度为2 µM。</li>
	<li>以1:1比例将细胞接种至明胶包被的培养板中，在37 °C孵育30分钟以去除MEF饲养层细胞。</li>
	<li>将细胞转移至15 ml锥形管中，加入含有适当血清的hPSC培养基，并使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	<li>以 258 × g 离心 3 分钟。</li>
	<li>离心期间，将 Thiazovivin 加入适量 mTeSR1 培养基中，使其终浓度为 2 µM。</li>
	<li>离心后，吸除培养基，并加入含Thiazovivin的适量mTeSR1培养基，使细胞密度为1.8 × 105 细胞/毫升培养基</li>
	<li>从培养箱中取出Matrigel板，吸除Matrigel，将2 ml混合细胞加入6孔板的1个孔中。 
	注意：细胞密度应为 3.6 x 104 细胞/厘米²2 表面积。</li>
	<li>将培养板放回培养箱，让细胞贴壁培养24小时。</li>
	<li>细胞接种后24小时，吸除旧培养基，每孔加入2 ml新鲜mTeSR1培养基，继续培养24小时后再开始诱导分化。</li>
</ol>
细胞分化
<ol>
	<li>细胞重铺于Matrigel板后48小时开始诱导分化。</li>
	<li>从培养板中吸除培养基，用 PBS 洗涤细胞一次，每孔加入 2 ml 下述分化培养基：含 10 µM SB431542 和 100 nM LDN-193189 的 KSR 分化培养基。将此日标记为分化的第 0 天（D0）。</li>
	<li>从第0天到第20天，每天更换培养基。 
	注意：培养基的制备量应以不超过2天内使用完毕为宜。</li>
	<li>D1和D2阶段使用以下培养基：KSR分化培养基，添加10 µM SB431542、100 nM LDN-193189、0.25 µM SAG、2 µM purmorphamine和50 ng/ml FGF8b。</li>
	<li>D3和D4阶段使用以下培养基：KSR分化培养基，添加10 µM SB431542、100 nM LDN-193189、0.25 µM SAG、2 µM purmorphamine、50 ng/ml FGF8b和3 µM CHIR99021。</li>
	<li>D5和D6阶段使用以下培养基：75% KSR分化培养基与25% N2分化培养基混合，添加100 nM LDN-193189、0.25 µM SAG、2 µM purmorphamine、50 ng/ml FGF8b和3 µM CHIR99021。</li>
	<li>D7和D8使用以下培养基：50% KSR分化培养基与50% N2分化培养基混合，添加100 nM LDN-193189和3 µM CHIR99021。</li>
	<li>D9和D10使用以下培养基：25% KSR分化培养基与75% N2分化培养基混合，添加100 nM LDN-193189和3 µM CHIR99021。</li>
	<li>D11和D12使用以下培养基：B27分化培养基，添加3 µM CHIR99021、10 ng/ml BDNF、10 ng/ml GDNF、1 ng/ml TGF3、0.2 mM 抗坏血酸和0.1 mM cAMP。</li>
	<li>使用以下培养基进行后续分化：B27分化培养基，补充10 ng/ml BDNF、10 ng/ml GDNF、1 ng/ml TGFβ3、0.2 mM 抗坏血酸和0.1 mM cAMP。</li>
	<li>在分化第16天左右，准备一些多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白/纤连蛋白包被的培养板。将多聚-L-鸟氨酸储存液用冷（4 °C）PBS稀释至15 µg/ml，每孔加入1 ml至6孔板中，于37 °C孵育过夜。</li>
	<li>吸出聚-L-鸟氨酸溶液，用无菌水洗涤培养板3次，然后将培养板风干。</li>
	<li>将层粘连蛋白储备液用预冷的（4 °C）PBS稀释至1 µg/ml，每孔加入1 ml至6孔板中，37 °C孵育过夜。</li>
	<li>吸去层粘连蛋白溶液，用无菌水洗涤培养板3次，然后将培养板风干。</li>
	<li>将纤连蛋白储备液用预冷的（4 °C）PBS稀释至2 µg/ml，每孔加入1 ml至6孔板中，37 °C孵育过夜。</li>
	<li>用Parafilm密封培养板，并置于4 °C保存，时间最长可达两周。</li>
	<li>经过20天的分化后，将细胞重铺至多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白/纤连蛋白包被的培养板中。吸除分化培养基，向6孔板的1个孔中加入1 ml预热（37 °C）的Accutase溶液，于37 °C孵育5 min。</li>
	<li>孵育期间，将聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白/纤连蛋白包被的培养板放入培养箱中。</li>
	<li>5分钟孵育后或当细胞变为半悬浮状态时，轻柔地将细胞上下吹打数次，使其分散为单细胞。</li>
	<li>将单细胞收集到15 ml锥形管中，加入适量神经基础培养基用于细胞计数，培养基体积需根据细胞扩增情况调整（分化11天后，细胞可能扩增15–20倍）。使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	<li>以 258 × g 离心 3 分钟。吸除上清液，用 B27 分化培养基重悬细胞，使细胞浓度为 1 × 106 细胞/毫升培养基</li>
	<li>吸弃培养板中的纤连蛋白，用 PBS 洗涤两次，每孔加入 2 ml 细胞至 6 孔板中。 
	注意：重铺板时的细胞密度应为 2 x 105 细胞/平方厘米2 表面积。</li>
	<li>24小时后更换培养基，以去除未贴壁的死细胞。</li>
	<li>每隔一天更换一次培养基，直至达到特定实验的预定时间点。</li>
</ol>

<ol><li>Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Will+embryonic+stem+cells+be+a+useful+source+of+dopamine+neurons+for+transplant+into+patients+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).</li>
<li>Perrier, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 12543-12548 (2004).</li>
<li>Park, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+analyses+of+human+embryonic+stem+cell-derived+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 92, 1265-1276 (2005).</li>
<li>Buytaert-Hoefen, K. A., Alvarez, E., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tyrosine+hydroxylase+positive+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+after+coculture+with+cellular+substrates+and+exposure+to+GDNF%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF.</a> Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 669-674 (2004).</li>
<li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 925-940 (2004).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+dopaminergic+neuronal+subtypes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 781-790 (2005).</li>
<li>Schulz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+dopaminergic+neurons+in+serum-free+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture.</a> Stem Cells. 22, 1218-1238 (2004).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+dopaminergic+neurons+in+vitro+from+human+embryonic+stem+cells+treated+with+neurotrophic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Generation of dopaminergic neurons in vitro from human embryonic stem cells treated with neurotrophic factors.</a> Neuroscience Letters. 359, 99-103 (2004).</li>
<li>Cho, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+and+large-scale+generation+of+functional+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3392-3397 (2008).</li>
<li>Cooper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+ES+and+Parkinson%27s+disease+iPS+cells+into+ventral+midbrain+dopaminergic+neurons+requires+a+high+activity+form+of+SHH%2C+FGF8a+and+specific+regionalization+by+retinoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 45, 258-266 (2010).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27, 275-280 (2009).</li>
<li>Sanchez-Danes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+A9+midbrain+dopaminergic+neurons+by+lentiviral+delivery+of+LMX1A+in+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells.</a> Human Gene Therapy. 23, 56-69 (2012).</li>
<li>Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+functional+floor+plate+tissue+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 6, 336-347 (2010).</li>
<li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480, 547-551 (2011).</li>
<li>Xi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+midbrain+dopamine+neurons+from+primate+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Specification of midbrain dopamine neurons from primate pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 30, 1655-1663 (2012).</li>
<li>Kirkeby, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+regionally+specified+neural+progenitors+and+functional+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+under+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions.</a> Cell Reports. 1, 703-714 (2012).</li>
<li>Mendez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+analysis+of+functional+fetal+dopamine+cell+suspension+transplants+in+the+striatum+and+substantia+nigra+of+patients+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%3A+a+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cell type analysis of functional fetal dopamine cell suspension transplants in the striatum and substantia nigra of patients with Parkinson's disease.</a> Brain: a Journal of Neurology. 128, 1498-1510 (2005).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Nishimura, K., Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+application+of+stem+cell+technology+toward+the+treatment+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+%26+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Therapeutic application of stem cell technology toward the treatment of Parkinson's disease.</a> Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 171-175 (2013).</li>
<li>Smidt, M. P., Burbach, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+mesodiencephalic+dopaminergic+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 8, 21-32 (2007).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+and+bFGF+cooperate+to+maintain+the+pluripotency+of+human+embryonic+stem+cells+in+the+absence+of+feeder+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 330, 934-942 (2005).</li>
<li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14071-14076 (2002).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

人类多能干细胞（包括hESCs和hiPSCs）可被诱导分化 体外 以生成我们体内大多数（即使不是全部）类型的细胞，包括多巴胺能神经元，这一点已在先前的研究中得到证实19基于胚胎多巴胺能神经元发育的相关知识20 以及其他实验室已发表的实验方案14,15我们优化了从人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化生成多巴胺能神经元的培养条件。该方案高效、可重复，我们已成功将此处所述的方案应用于H1和H9 hESC系，以及来自帕金森病（PD）患者和健康对照个体的hiPSC系。
在我们的实验方案中，获得高效分化率有三个关键步骤：首先，在定向分化前，细胞中不应存在已分化的hPSC集落。由于hPSC培养过程中常出现向三个胚层自发分化的现象，因此在将hPSC解离为单细胞之前，必须清除这些已分化的集落。其次，应从解离后的hPSC中去除MEF饲养层细胞，因为已有研究表明，MEF细胞可分泌促进自我更新并抑制分化的因子21。为此，将hPSC与MEF细胞混合物在明胶包被的培养板上孵育3...

多巴胺能（DA）神经元存在于多个脑区，包括中脑、下丘脑、视网膜和嗅球。位于黑质致密部（SNpc）的A9多巴胺能神经元通过向端脑的纹状体投射，形成锥体外系运动系统，从而调控行为和运动。A9多巴胺能神经元的退化会导致帕金森病（PD），帕金森病是人类第二常见的神经退行性疾病，目前尚无法治愈。细胞替代疗法是治疗帕金森病最有前景的策略之一1，因此，人们高度关注从人类多能干细胞（hPSCs）——包括人类胚胎干细胞（hESCs）和近年来出现的人类诱导多能干细胞（hiPSCs）——中获得A9多巴胺能神经元。
大量研究尝试利用不同方法从人多能干细胞（hPSCs）诱导生成A9型多巴胺能神经元。早期所有报道均通过神经玫瑰花结前体阶段来产生多巴胺能神经元。通过与MS5共培养2 或 PA63-5 在有或无外源生长因子的条件下培养2-4周后，L. Studer 及其同事与其他三个研究团队成功诱导人胚胎干细胞（hESCs）形成神经玫瑰花结。随后，他们通过机械分离或酶消化方法富集这些玫瑰花结，以进行进一步分化。在其他研究中，研究人员通过拟胚体（embryoid body, EB）悬浮培养分化的方式生成神经玫瑰花结。6-9随后，研究人员建立了一种基于单层细胞的分化方法10,11，他们在细胞外基质上接种人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs），并在培养过程中添加不同的生长因子，以诱导人多能干细胞（hPSCs）向多巴胺能神经元分化，该过程模拟了 体内 胚胎多巴胺能神经元发育。尽管这些研究均获得了表达酪氨酸羟化酶（TH）且具备某些多巴胺能神经元特征的细胞，但整个分化过程耗时且费力，通常效率低下；更重要的是，除利用LMX1a异位表达的一项研究外，大多数研究均未证实这些神经元具有A9型身份。12最近，一种基于新腹侧板（floor plate, FP）的实验方案被开发出来13-16，其中在分化早期阶段，通过激活音猬因子（sonic hedgehog）和经典Wnt信号通路首先生成具有多巴胺能神经元潜能的底板（FP）前体细胞，随后这些底板细胞进一步特化为多巴胺能神经元。尽管该方案效率较高，但仍存在一些问题；例如，整个分化过程耗时较长（至少35天），且依赖于饲养细胞15，或依赖EB16 或未证实其A9身份14.
此处，基于已有的知识 体内 胚胎多巴胺能神经元发育及其他研究者已发表的结果，我们优化了培养条件，以高效地从人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs）生成多巴胺能神经元。我们首先通过小分子CHIR99021激活经典Wnt信号通路，同时使用小分子SAG和purmorphamine激活音猬因子（sonic hedgehog）信号通路，从而诱导形成前脑前体细胞（FP前体细胞）。这些FP前体细胞表达FOXA2、LMX1a、CORIN、OTX2和NESTIN。随后，我们利用生长因子BDNF、GDNF进一步将这些FP前体细胞定向分化为多巴胺能神经元。 等等生成的多巴胺能神经元为A9型细胞，因其对GIRK2呈阳性而对Calbindin呈阴性17该方案无需饲养细胞或拟胚体，具有高效且可重复的特点。利用此方案，可在不到4周的时间内从正常人的hESCs或hiPSCs中获得多巴胺能神经元，用于细胞移植研究；或从帕金森病（PD）患者的hiPSCs中获得 体外 帕金森病的建模或帕金森病潜在治疗药物的测试。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/氨苄青霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>KSR</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>mTesR1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>IV型胶原酶</td><td>Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>N2添加剂</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27添加剂</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>生长因子减少型Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>MP Biomedicals</td><td>1000449</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-361380</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td></td></tr><tr><td>SAG</td><td>EMD Millipore</td><td>566660-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Purmorphamine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202785</td><td></td></tr><tr><td>FGF8b</td><td>R&amp;D Systems</td><td>423-F8-025</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cellagen Technology</td><td>C2447-2s</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>248-BD-025</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>212-GD-010</td><td></td></tr><tr><td>TGF-β3</td><td>R&amp;D Systems</td><td>243-B3-002</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人NESTIN抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-23927</td><td>1/1,000 稀释</td></tr><tr><td>兔抗人OTX2抗体</td><td>Millipore</td><td>AB9566</td><td>1/2,000 稀释</td></tr><tr><td>山羊抗人FOXA2抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF2400</td><td>1/200 稀释</td></tr><tr><td>兔抗人LMX1a抗体</td><td>Millipore</td><td>AB10533</td><td>1/1,000 稀释</td></tr><tr><td>兔抗人TH抗体</td><td>Pel Freez</td><td>P40101</td><td>1/500 稀释</td></tr><tr><td>鸡抗人TH抗体</td><td>Millipore</td><td>AB9702</td><td>1/500 稀释</td></tr><tr><td>小鼠抗人TUJ1抗体</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>1/2,000 稀释</td></tr><tr><td>兔抗人GIRK2抗体</td><td>Abcam</td><td>ab30738</td><td>1/300 稀释</td></tr><tr><td>兔抗人Calbindin抗体</td><td>Abcam</td><td>ab25085</td><td>1/400 稀释</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5804</td><td></td></tr></tbody></table>

由人类多能干细胞定向分化为多巴胺能神经元

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

中脑黑质致密部中的多巴胺能（DA）神经元（也称为 A9 DA 神经元）是帕金森病（PD）中特异性丢失的细胞类型。目前，人们高度关注从人多能干细胞（hPSCs）中获得 A9 DA 神经元，以用于 PD 的再生性细胞替代治疗。在神经发育过程中，A9 DA 神经元起源于位于中枢神经系统腹侧中线的底板（FP）前体细胞。在此，我们优化了 hPSCs 分步分化为 A9 DA 神经元的培养条件，该过程模拟了胚胎期 DA 神经元的发育过程。在本方案中，我们首先描述了利用小分子方法从 hPSCs 高效生成 FP 前体细胞，随后将这些 FP 细胞转化为 A9 DA 神经元，并可长期维持 体外 数月。该高效、可重复且可控的方案在来自正常人及帕金森病（PD）患者的正常人源胚胎干细胞（hESCs）和人源诱导多能干细胞（hiPSCs）中均表现良好，可由此获得A9类多巴胺能神经元以开展 体外 疾病建模与药物筛选 体内 帕金森病的细胞移植治疗

分化方案的总体概述见图1。本方案的分化效率取决于起始细胞的状态。因此，必须确保以下三点：首先，在将hPSCs解离为单细胞进行分化之前，应彻底清除所有已分化的克隆；其次，通过将细胞在明胶包被的培养板上孵育30分钟，尽可能耗尽（若非全部）MEF饲养层细胞；第三，将hPSC单细胞以适当的密度接种至Matrigel包被的培养板上。如图2所示，重铺的hPSC单细胞在分化前48小时内以细胞簇形式扩展，培养板中约形成70%的融合度。分化后，这些细胞在短短3-4天内即可达到完全融合，从大约D16-D17开始，融合的细胞层中开始出现空隙，可在这些空隙及细胞层下方观察到轴突/神经突。在D20重铺后，已分化的细胞以小团块形式贴壁并生长。随后5天内，这些团块中会延伸出更为密集且形态完整的轴突/神经突，不同团块之间的轴突/神经突开始形成连接。在长期培养过程中，同一团块内的神经元产生更多的突起，逐渐成熟，并与邻近团块中的神经元建立更多连接。
经过11天的分化后，人多能干细胞（hPSCs）可高效地转化为前脑前体细胞。如图3</s...

我们基于发育生物学知识和已发表的研究，开发了一种优化的方案，可高效地从人类胚胎干细胞和人类诱导多能干细胞中生成A9型中脑多巴胺能神经元，该技术将有助于帕金森病的疾病建模及细胞替代治疗。

黑质致密部中的多巴胺能神经元（也称为A9多巴胺能神经元）是帕金森病中特异性丧失的细胞类型……

本实验的总体目标是在体外诱导高效生成多巴胺能神经元。该过程首先制备人多能干细胞的单细胞贴壁培养体系。第二步，将细胞培养基更换为神经元诱导培养基，以诱导形成底板前体细胞。接着，将多巴胺能神经元置于成熟培养基中进行培养。最后，将单细胞多巴胺能神经元前体细胞接种于多聚-L-鸟氨酸层粘连蛋白包被的培养板上，并在成熟培养基中培养30天。最终，免疫荧光显微镜可用于评估重要多巴胺能神经元标志物的表达。该技术相较于现有的神经球神经酸方案具有更大优势，能够以更高的效率生成更均一的双神经细胞群体。传代后第四天，从细胞培养物中吸出培养基。每孔加入一毫升Accutase溶液消化细胞，并在37摄氏度孵育五分钟。孵育期间，向六孔板的每孔中加入一毫升明胶，然后将该六孔板连同新制备的基质胶包被的培养板一同放入培养箱中。当细胞变为半悬浮状态时，用移液器反复吹打数次以制成单细胞悬液。随后将细胞转移至15毫升离心管中，在258 ×g、室温条件下离心3分钟。用适量添加了血清的人多能干细胞培养基重悬细胞沉淀，并加入thi vivin至终浓度为2毫摩尔。接下来，将细胞以1:1的比例接种于明胶包被的培养板中，在37摄氏度条件下孵育30分钟。去除饲养层细胞后，将细胞转移至新的15毫升离心管中。加入含血清的人多能干细胞培养基重悬细胞，离心后计数，再用含硫代异烟酰胺的MT.SR一培养基重悬细胞，调整细胞浓度至每毫升180,000个细胞。然后从包被的培养板中吸除 Matrigel，并向每孔加入两毫升细胞。48 小时。在将细胞重新接种至 Matrigel 培养板后。吸去每个孔中的培养基，用 PBS 洗涤细胞一次。然后向细胞中加入 2 mL KSR 分化培养基，其中添加 SB431542 和 LDN193189，从第 0 天到第 20 天每天更换培养基，具体方案如图表所示。在第 20 天，吸去分化培养基，每孔加入 1 mL 37 °C 的 Accutase，在 37 °C 下孵育 5 分钟以解离细胞。在孵育期间，将包被有聚-L-鸟氨酸、层粘连蛋白和纤连蛋白的培养板放入培养箱中预热。随后，在复苏后将脱离的细胞重悬并制成单细胞悬液，用神经基础培养基稀释细胞。计数后，离心收集细胞，将沉淀重悬于B27分化培养基中，调整浓度至每毫升含100万个细胞。然后吸除多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白/纤连蛋白包被板中的纤连蛋白溶液。用 PBS 洗涤两次，然后将 400 微升细胞转移至每个孔中。在最初的 24 小时后更换培养基，之后每隔一天更换一次，直至实验终点，以去除任何未贴壁的死细胞。如图中所示，重铺的单细胞人多能干细胞在分化开始的前 48 小时内会以细胞簇的形式扩增，达到约 70% 的融合度。分化后，细胞在短短三到四天内即可达到完全汇合。到第20天，分化后的细胞以小团簇的形式附着并生长。在接下来的五天内，团簇内出现更为密集且形态完整的轴突和神经突，并在团簇之间形成一些连接。经过11天的分化后，人多能干细胞可被高效地转化为底板前体细胞。如图中所示，几乎所有细胞均表达底板前体细胞标志物Nestin和FoxA2，超过90%的细胞表达Corin、OTX2和LMX1A。经过进一步分化，底板前体细胞特化为表达TUJ1和TH的多巴胺能神经元。这些多巴胺能神经元具有中脑特性，因其表达GK2且对钙结合蛋白calbindin呈阴性。免疫染色实验还表明，不存在GFAP阳性星形胶质细胞，且GABA能神经元极少，说明该分化过程对多巴胺能神经元谱系具有高度特异性。在测试该实验流程时，保持日常细胞培养的一致性至关重要，并需确保培养基使用正确的成分新鲜配制。

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从人多能干细胞定向多巴胺能神经元分化

我们已建立一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导生成神经母细胞的方案，该方法能够大量获得发育中中枢神经系统所需的神经前体细胞和神经元细胞类型，用于神经修复。...

利用小分子诱导高效地从多能性人胚胎干细胞分化获得人神经前体细胞与神经元

多能性人类干细胞（hPSCs）的神经元分化方案通常耗时较长，且需要较高的细胞培养技术。本文中，我们改进了一种基于小分子的分化方法，将其应用于多孔板体系，从而能够以简单、快速且高效的方式在受控条件下生成人类神经元。...

在多孔板格式中快速高效地从人类多能干细胞生成神经元

本视频展示了如何从非转基因和转基因的人类多能干细胞（hPSCs）生成神经前体细胞。通过使用神经分化培养基，将hPSCs分化为神经前体细胞。在非转基因细胞中，使用小分子诱导分化；而在转基因hPSCs中，则通过添加抗生素来激活神经分化特异性转录因子的启动子，从而诱导其分化。...

非转基因与转基因人类多能干细胞向神经前体细胞的分化

本视频展示了通过转染携带受四环素反应元件调控的神经发生转录因子基因的工程化慢病毒，诱导人多能干细胞分化为神经元，并随后用四环素衍生物和成熟培养基处理的过程。...

利用基因工程慢病毒实现人多能干细胞向神经元的分化

本视频展示了将人胚胎干细胞（hESCs）分化为多巴胺能神经元的过程，以提供研究帕金森病的模型。将hESCs在微孔板中的神经诱导培养基中培养，形成三维神经球。随后在神经诱导培养基中继续培养，以促进其分化为多巴胺能前体神经元。最终神经元的成熟过程在培养小室中的气液界面条件下进行，从而形成由成熟多巴胺能神经元组成的三维类器官。...

由人胚胎干细胞生成多巴胺能神经元类器官

该实验通过模拟人类发育过程中所经历的类似检查点，获得端脑神经元。细胞首先被允许自发分化，随后暴露于促使其向神经谱系分化的因子中，再经过分离后接种至盖玻片上，以促进其终末分化与成熟。...

从人类多能干细胞诱导端脑谷氨酸能神经元的特化

我们修改并实施了一项先前发表的方案，该方案描述了将人 诱导 多能干细胞（hiPSCs）快速、可重复且高效地分化为兴奋性皮层神经元的方法12。具体而言，我们的改进可实现对神经元细胞密度的控制，并可在微电极阵列上应用，以在神经网络水平上检测其电生理特性。...

利用微电极阵列测量网络活性的诱导多能干细胞快速神经元分化

本方案介绍了通过仙台病毒感染将外周血单个核细胞重编程为诱导性神经干细胞，将iNSCs分化为多巴胺能神经元，将多巴胺能前体细胞移植到单侧损毁的帕金森病小鼠模型，并评估iNSC来源的多巴胺能前体细胞用于帕金森病治疗的安全性和有效性。...

从外周单个核细胞生成诱导性神经干细胞及其向多巴胺能神经元前体细胞的分化用于移植研究

本文介绍了一种人类胚胎干细胞单细胞培养及其后续分化为神经前体细胞的实验方案。该方案操作简便、稳定可靠、可扩展性强，适用于药物筛选和再生医学应用。...

利用人胚胎干细胞单细胞培养实现高效神经分化

在本实验方案中，我们描述了一种稳定且高效的分化策略，可用于由人类多能干细胞生成节后交感神经元。该模型将为多种自主神经系统疾病的研究所需的神经元提供来源。...

在无饲养层且化学成分明确的培养条件下利用人多能干细胞高效分化出节后交感神经元

我们展示了与自动化成像和分析兼容的人诱导多能干细胞（hiPSC）培养及神经元分化的自动化流程。...

人诱导多能干细胞来源的皮层神经元和多巴胺能神经元的自动化生产及整合活细胞监测

学习从人多能干细胞高效分化A9中脑多巴胺能神经元的优化方案。该方法通过神经诱导培养基促进底板祖细胞形成，经30天成熟培养获得高纯度神经元，为帕金森病疾病建模和细胞替代治疗研究提供重要工具。

由人类多能干细胞定向分化为多巴胺能神经元

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