由人类多能干细胞定向分化为多巴胺能神经元

本实验的总体目标是在体外诱导高效生成多巴胺能神经元。该过程首先制备人多能干细胞的单细胞贴壁培养体系。

第二步，将细胞培养基更换为神经元诱导培养基，以诱导形成底板前体细胞。接着，将多巴胺能神经元置于成熟培养基中进行培养。最后，将单细胞多巴胺能神经元前体细胞接种于多聚-L-鸟氨酸层粘连蛋白包被的培养板上，并在成熟培养基中培养30天。

最终，免疫荧光显微镜可用于评估重要多巴胺能神经元标志物的表达。该技术相较于现有的神经球神经酸方案具有更大优势，能够以更高的效率生成更均一的双神经细胞群体。

传代后第四天，从细胞培养物中吸出培养基。每孔加入一毫升Accutase溶液消化细胞，并在37摄氏度孵育五分钟。孵育期间，向六孔板的每孔中加入一毫升明胶，然后将该六孔板连同新制备的基质胶包被的培养板一同放入培养箱中。

当细胞变为半悬浮状态时，用移液器反复吹打数次以制成单细胞悬液。随后将细胞转移至15毫升离心管中，在258 ×g、室温条件下离心3分钟。用适量添加了血清的人多能干细胞培养基重悬细胞沉淀，并加入thi vivin至终浓度为2毫摩尔。

接下来，将细胞以1:1的比例接种于明胶包被的培养板中，在37摄氏度条件下孵育30分钟。去除饲养层细胞后，将细胞转移至新的15毫升离心管中。加入含血清的人多能干细胞培养基重悬细胞，离心后计数，再用含硫代异烟酰胺的MT.SR一培养基重悬细胞，调整细胞浓度至每毫升180,000个细胞。

然后从包被的培养板中吸除 Matrigel，并向每孔加入两毫升细胞。48 小时。在将细胞重新接种至 Matrigel 培养板后。

吸去每个孔中的培养基，用 PBS 洗涤细胞一次。然后向细胞中加入 2 mL KSR 分化培养基，其中添加 SB431542 和 LDN193189，从第 0 天到第 20 天每天更换培养基，具体方案如图表所示。在第 20 天，吸去分化培养基，每孔加入 1 mL 37 °C 的 Accutase，在 37 °C 下孵育 5 分钟以解离细胞。在孵育期间，将包被有聚-L-鸟氨酸、层粘连蛋白和纤连蛋白的培养板放入培养箱中预热。

随后，在复苏后将脱离的细胞重悬并制成单细胞悬液，用神经基础培养基稀释细胞。计数后，离心收集细胞，将沉淀重悬于B27分化培养基中，调整浓度至每毫升含100万个细胞。然后吸除多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白/纤连蛋白包被板中的纤连蛋白溶液。

用 PBS 洗涤两次，然后将 400 微升细胞转移至每个孔中。在最初的 24 小时后更换培养基，之后每隔一天更换一次，直至实验终点，以去除任何未贴壁的死细胞。如图中所示，重铺的单细胞人多能干细胞在分化开始的前 48 小时内会以细胞簇的形式扩增，达到约 70% 的融合度。

分化后，细胞在短短三到四天内即可达到完全汇合。到第20天，分化后的细胞以小团簇的形式附着并生长。在接下来的五天内，团簇内出现更为密集且形态完整的轴突和神经突，并在团簇之间形成一些连接。

经过11天的分化后，人多能干细胞可被高效地转化为底板前体细胞。如图中所示，几乎所有细胞均表达底板前体细胞标志物Nestin和FoxA2，超过90%的细胞表达Corin、OTX2和LMX1A。经过进一步分化，底板前体细胞特化为表达TUJ1和TH的多巴胺能神经元。这些多巴胺能神经元具有中脑特性，因其表达GK2且对钙结合蛋白calbindin呈阴性。免疫染色实验还表明，不存在GFAP阳性星形胶质细胞，且GABA能神经元极少，说明该分化过程对多巴胺能神经元谱系具有高度特异性。

在测试该实验流程时，保持日常细胞培养的一致性至关重要，并需确保培养基使用正确的成分新鲜配制。